趨化因子受體CCR6及其配體CCL20與結腸癌肝轉移關系的實驗研究

張 朋王金慶周 勇紀志鵬孟祥瑞葛運飛丁印魯

趨化因子受體CCR6及其配體CCL20與結腸癌肝轉移關系的實驗研究

張 朋①王金慶①周 勇①紀志鵬①孟祥瑞①葛運飛①丁印魯①

目的：探討人趨化因子受體6（CCR6）及其配體CCL20的表達與結腸癌肝轉移的關系。方法：選擇2012年10月-2014年10月在本院行結腸癌根治術的患者93例作為研究對象，采用實時熒光定量PCR檢測93例患者的結腸癌組織、正常腸黏膜組織及其中14例結腸癌肝轉移組織、肝轉移灶旁肝組織中CCL20及CCR6 mRNA表達情況，分析比較其差異。結果：CCR6及CCL20 mRNA在結腸癌和肝轉移灶中高表達，并且均顯著高于癌旁組織，比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結腸癌組織中CCR6及CCL20 mRNA表達與患者的性別、年齡、腫瘤大小及組織學類型無明顯關系（P＞0.05），與TNM分期有關（P＜0.05）。結論：CCR6及其配體CCL20可能參與調(diào)節(jié)結腸癌向肝臟特異性轉移過程。

趨化因子； 人趨化因子受體6； CC亞族趨化因子配體20； 結腸癌； 肝轉移

結腸癌總發(fā)病率在歐美等發(fā)達國家占惡性腫瘤的第3位[1]。我國雖較發(fā)達國家發(fā)病率低，但近年有明顯上升趨勢[2]。其遠處轉移主要通過血管與淋巴管的機械運輸作用，近年來研究結果顯示趨化因子參與了腫瘤的遠處轉移[3-5]。本研究檢測93例結腸癌組織及相應的肝轉移組織中CCR6、CCL20 mRNA的表達，探討信號轉導通路成員CCR6及其配體CCL20在結腸癌肝轉移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年10月-2014年10月本院普外科收治的結腸癌根治術后患者93例作為研究對象，均經(jīng)病理證實結腸癌。其中男49例，女44例；年齡29～86歲，中位年齡67歲；TNM分期Ⅰ期7例，Ⅱ期39例，Ⅲ期28例，Ⅳ期19例，其中14例發(fā)生結腸癌肝轉移。術后病理組織學類型包括：高中分化腺癌69例，低分化腺癌24例。

1.2 入選標準 （1）手術根治切除后病理診斷結腸癌；（2）美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）的TNM分期為Ⅰ～Ⅳ期；（3）手術方式包括開腹及腹腔鏡結腸癌根治術，包括右半結腸、橫結腸、左半結腸切除術，行常規(guī)淋巴結清掃；（4）手術前未接受放化療和生物治療并且簽署知情同意書。

1.3 實驗方法

1.3.1 儀器與試劑 RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kits（德國Qiagen公司）；TaqMan2×PCR Master Mix、GeneAmp7900 Sequence Detection Systems（美國Applied Biosystems公司），DNA系列分析儀（美國Applied Biosystems公司）；流式細胞儀、QPREP標本處理儀（美國Coulter公司）；藻紅素（PE）標記鼠抗人CCR6單抗（美國eBioscience公司）。

1.3.2 組織標本的準備 所有標本均于手術切除腫瘤后10～25 min內(nèi)采集，結腸癌組織以及鄰近正常腸黏膜組織（距腫瘤邊緣大于5 cm），肝轉移患者取肝轉移灶及灶旁肝組織，所得標本立即置于液氮中保存。

1.3.3 總RNA的提取及單鏈cDNA的合成 取結腸癌組織75 mg，以液氮研磨，加1 mL Trizol混勻，15～30℃靜置5 min。加入0.2 mL氯仿，充分振蕩15 s，15～30℃靜置3 min。12 000 r/min離心15 min，取上清，加入0.5 mL異丙醇，輕輕混勻，15～30℃靜置10 min，12 000 r/min離心5 min，棄上清。沉淀中加入75%的乙醇，混勻，7500 r/min離心5 min后棄上清，室溫放置晾干。加適量的DEPC溶解。用紫外分光光度計測定其純度及濃度后，取3 μg總RNA進行反轉錄。反轉錄用20 μL體系，包括2 μL 10×RT mix，2μL dNTP，2μL Oligo（dt），1 μL反轉錄酶，最后用DEPC液補至20 μL[6]。

1.3.4 引物、探針的設計與合成 將反轉錄后的cDNA模板用無菌去離子液稀釋至300 μL，取5 μL為PCR模板。CCR6引物：上游5’-GGT CAA CTT TAA CTG TGG GAT G-3’，下游5’-GGT GTA GGC GAG GAC TTT CT-3’。CCL20引物：5’-AGC AGC AAG CAA CTA CGA CT-3’，下游5’-TCT TAG GCT GAG GAG GTT CA-3’。GAPDH引物上游：5’-ATG GGA AGC TGG TCA TCA AC-3’，下游：5’-TTC AGC TCT GGG ATG ACC TT-3’。PCR反應體系：2.5×SYBR 11.25 μL，上下游引物（10 μL/L）各1.25μL，模板5 μL，其余用無菌去離子液補足至25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min；94 ℃15 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，收集溶解曲線。計算CCL20和CCR6基因相對于GAPDH的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以（±s）表示，正態(tài)分布的資料比較采用t檢驗，非正態(tài)分布資料用Mann-Whitney U-test進行檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同組織CCR6、CCL20 mRNA表達情況比較 CCR6、CCL20 mRNA在結腸癌組織及肝臟轉移組織中的表達量高于正常黏膜組織及肝轉移灶旁組織，比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同組織CCR6、CCL20 mRNA表達情況比較（±s）

表1 不同組織CCR6、CCL20 mRNA表達情況比較（±s）

CCL20 mRNA相對表達量正常黏膜組織（n=93）0.625±0.1820.754±0.074大腸癌組織（n=93）3.134±0.1962.006±0.044肝轉移組織（n=14）3.537±0.1682.182±0.128肝轉移灶旁組織（n=14）0.594±0.2420.783±0.122組織類型CCR6 mRNA相對表達量

2.2 CCR6、CCL20 mRNA表達與結腸癌臨床病例特征的關系 CCR6、CCL20 mRNA表達與結腸癌患者性別、年齡、腫瘤大小及組織學分級無相關性（P＞0.05），與結腸癌的TNM分期相關（P＜0.05），見表2。

表2 CCR6、CCL20 mRNA表達與結腸癌臨床病例特征的關系

3 討論

趨化因子是一單鏈小分子蛋白質超家族，通過與受體的相互作用，引起靶細胞的定向遷移[7]。大多數(shù)趨化因子有4個特征性的保守的半胱氨酸（Cys），根據(jù)靠近分子氨基端（N端）的前2個Cys之間是否插入其他氨基酸，將它們分為4類：CXC類（如IL-8）、CC（如MCP-1）；CX3C類（如Fractalkine）及C類（如Lymphotactin）[8]。趨化因子受體是一類介導趨化因子行使功能的G蛋白偶連的跨膜受體（GPCR）。按趨化因子的分類，分為CC類受體（CCR）、CXC類受體（CXCR）、CX3C和C類受體（CX3CR、CR）[9]。趨化因子受體CCR6是趨化因子CCL20（又稱巨噬細胞炎性反應蛋白-3α，MIP-3α）的專屬受體（specific receptors），二者構成一個與細胞間信息傳遞、細胞遷移有密切關系的生物學軸，其實質在于CCR6對其配體CCL20的高度親和力和絕對特異性。目前關于CCR6在腫瘤轉移中的作用的研究尚處于起始階段。Andre等[10]研究顯示CCR6高表達與乳腺癌的胸膜轉移轉移相關；Rubie等[11]發(fā)現(xiàn)肝癌組織中CCR6與CCL20表達高于正常肝臟組織。胰腺癌組織存在趨化因子CCL20及其受體CCR6 mRNA的表達，CCL20可以顯著促進人胰腺癌細胞株COLO-357的增殖和遷移[12]。CCL20還能夠促進胰腺癌細胞株PANC-1侵襲，CCR6抗體可以阻斷CCL20對胰腺癌細胞的促侵襲作用。正常肝組織和肝細胞癌組織中均有CCL20及CCR6表達，但癌組織中CCL20及CCR6表達顯著升高[13]。CCR6尤其高表達于癌組織侵襲的前沿部分，這有助于表達CCR6的癌細胞在CCL20信號刺激下向周邊浸潤生長。

與正常結直腸組織相比，趨化因子受體CXCR4、CCR6、CCR7在結直腸癌原發(fā)瘤中均表達升高，但在肝轉移瘤中僅CXCR4、CCR6升高；與食道、胃、結直腸等組織比較，肝臟組織中CCL12、CCL19、CCL21表達均無明顯改變，而CCL20在肝組織中表達卻明顯升高，提示在肝臟分泌的CCL20誘導下，高表達CCR6的結直腸癌細胞可以發(fā)生定向遷移進而形成肝轉移[14]。

CCR6、CCL20在結直腸癌組織中高表達，CCR6在多數(shù)肝轉移標本中表達高于鄰近正常肝組織。Ghadjar等[15]對64例結直腸癌標本進行免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，CCR6高表達可以促進結直腸癌肝轉移，CCR6表達程度是預測結直腸癌肝轉移的獨立因子。

本研究結果表明，CCR6、CCL20 mRNA在結腸癌及肝轉移灶組織中的表達較相應的癌旁組織顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CCL20、CCR6 mRNA的表達與患者年齡、性別、腫瘤大?。═分期）、病理類型無明顯相關性（P＞0.05），與TNM分期密切相關（P＜0.05），提示CCL20、CCR6軸與結腸癌肝轉移關系密切，在結腸癌發(fā)生、發(fā)展、轉移過程中發(fā)揮重要作用。這些結果不僅為結腸癌患者預后的判斷提供了參考，而且為結腸癌肝轉移的預防和臨床治療提供理論基礎。

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Experimental Study of the Relationship between Human Chemokine Receptor 6，CC Chemokine Ligand 20 and Liver Metastasis of Colorectal Cancer

ZHANG Peng，WANG J in-qing，ZHOU Yong，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（23）：049-052

Objective：To investigate the relationship between CCR6，CCL20 and liver metastasis of colorectal cancer. Method：93 patients who received radical operation for carcinoma of colon in our hospital from October 2012 to October 2014were selected as the research objects.The expression situation of CCR6，CCL20 mRNA in 93 patients’ colorectal cancer tissues，normal mucosa tissues and 14 patients’ colorectal liver metastases tissues，adjacent nontumorous liver tissues was examined by real-time fluorescent quantitative PCR.The differences among them were analyzed and compared.Result：The expression of CCR6，CCL20 mRNA in colorectal cancer tissues and metastatic liver focus were significantly higher than in the adjacent tissues，the differences were statistically significant（P＜0.05）.The expression of CCR6，CCL20 mRNA in colorectal cancer tissues had no significant correlation with the patients’ sex，age，tumor size and pathological types（P＞0.05），but it had a relationship with TNM-staging（P＜0.05）.Conclusion：CCR6 and CCL20 may take part in the regulation of colorectal liver metastasis.

Chemokine； Human chemokine receptor 6； CC chemokine ligand 20； Colorectal cancer； Liver metastasis

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.23.017

2015-05-03） （本文編輯：王利）

①山東大學第二醫(yī)院 山東 濟南 250033

丁印魯

First-author’s address：The Second Hospital of Shandong University，J i’nan 250033，China