昆蟲病原線蟲共生菌Tc 毒素研究進(jìn)展

張 杰，南宮自艷，宋 萍，王永娟，王勤英

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河北保定 071000)

目前生產(chǎn)上應(yīng)用最多的微生物殺蟲劑是蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis(Bt)，而且已經(jīng)成功商業(yè)化應(yīng)用的殺蟲蛋白基因也主要來源于Bt(Kumar et al.，2008;Van，2009)。Bt 制劑的大規(guī)模應(yīng)用和表達(dá)Bt δ-內(nèi)毒素基因的轉(zhuǎn)基因植物的大面積種植，已經(jīng)導(dǎo)致并加速了Bt 抗性昆蟲種群的發(fā)展(Tabashnik et al.，1993)。因此，發(fā)掘新的殺蟲毒素、豐富殺蟲基因的多樣性已成為當(dāng)務(wù)之急(Bravo and Soberón，2008)。除了繼續(xù)從不同Bt 菌株克隆、鑒定新型殺蟲蛋白外，還需挖掘新的資源?，F(xiàn)有研究表明，其它昆蟲病原微生物中也存在不同類型的殺蟲蛋白基因，其中引人注目的是在昆蟲病原線蟲共生菌中發(fā)現(xiàn)的具有殺蟲活性的新型蛋白毒素復(fù)合物(Toxin complexes，Tc)(Ffrench-Constant et al.，2007;張四維等，2011)。

昆蟲病原線蟲共生菌是存在于昆蟲病原線蟲(Entomopathogenic nematodes，EPNs)腸道內(nèi)的一類革蘭氏陰性細(xì)菌，屬于腸桿菌科Enterobacteriaceae(Gaugler，2002)。昆蟲病原線蟲和共生菌是互惠共生的關(guān)系，昆蟲病原線蟲作為載體負(fù)責(zé)將體內(nèi)的共生菌送到昆蟲血腔內(nèi)，而共生菌在昆蟲血腔內(nèi)快速繁殖，負(fù)責(zé)殺死并分解昆蟲，為線蟲提供其所需的養(yǎng)分，昆蟲病原線蟲——共生菌復(fù)合體作為生物殺蟲劑已被廣泛應(yīng)用于防治地下害蟲和鉆蛀類害蟲(Gaugler and Kaya，1990)。1998年 Bowen 等從發(fā)光桿菌Photorhabdus luminescens W14 菌株的胞外分泌物中分離純化出具有極高口服殺蟲活性的Tc 毒素蛋白(Bowen et al.，1998;Bowen and Ensign，1998)，為昆蟲病原線蟲共生菌的應(yīng)用開辟了一條嶄新的途徑。隨后，在另一種昆蟲病原線蟲共生菌——嗜線蟲致病桿菌Xenorhabdus nematophila 中也發(fā)現(xiàn)了類似的Tc 毒素(Morgan et al.，2001;崔龍等，2003;Wang et al.，2012)，這類Tc 毒素是由多亞基組成的高分子量復(fù)合蛋白，具有廣譜胃毒活性(Ffrench-Constant et al.，2000;Sergeant et al.，2001)，而且與已知的其它殺蟲蛋白同源性很低(Ffrench-Constant and Waterfield，2005)。近年來，在越來越多的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)Tc 毒素的存在，不僅在沙雷氏菌Serratia spp.(Hurst et al.，2007)和耶爾森氏菌Yersinia spp.(Hurst et al.，2011)等革蘭氏陰性細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了Tc 毒素，而且在某些革蘭氏陽性菌的基因組中也發(fā)現(xiàn)了類似的tc 基因，如Pseudomonas spp.和Bacillus thuringiensis(Hares et al.，2008;Péchy-Tarr et al.，2008;Blackburn et al.，2011)。隨著越來越多的Tc 毒素被發(fā)現(xiàn)，Tc 毒素的特性、功能和殺蟲機(jī)理已成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。本文對(duì)近年來國內(nèi)外已報(bào)道昆蟲病原線蟲共生菌Tc 毒素的殺蟲活性、蛋白結(jié)構(gòu)、編碼此類毒素的基因特點(diǎn)以及Tc 毒素的殺蟲機(jī)理研究進(jìn)展進(jìn)行了歸納綜述，分析了其在農(nóng)業(yè)上潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1 Tc 毒素的特性

1.1 Tc 毒素的殺蟲活性

Tc 毒素首次是從發(fā)光桿菌P.luminescens W14菌株中分離確認(rèn)的，隨后在嗜線蟲致病桿菌X.nematophila 中也發(fā)現(xiàn)了類似的毒素。此外，研究發(fā)現(xiàn)同一菌株內(nèi)可以產(chǎn)生多種Tc 毒素，而不同的Tc 毒素也顯示出不同的殺蟲活性(Bowen et al.，1998;Sergeant et al.，2003)。Bowen 等人(1998)從P.luminescens W14 菌株的上清液中分離純化出4種Tc 毒素，分別被命名為Tca、Tcb、Tcc 和Tcd，這4種Tc 毒素對(duì)煙草天蛾P(guān)hotorhabdus luminescens 幼蟲都顯示出血腔注射活性，但是僅有Tca 和Tcd 具有胃毒活性。Sergeant 等(2003)通過基因原核表達(dá)的方法確認(rèn) X.nematophilus PMFI296 菌株能產(chǎn)生2種Tc 毒素，而這兩種Tc 毒素顯示出不同的殺蟲譜，一種毒素包含有XptA1、XptB1 和XptC1 三種蛋白，對(duì)歐洲粉蝶Pieris brassicae 和大菜粉蝶P.rapae 幼蟲有胃毒活性，而另一種Tc 毒素是由XptA2、XptB1 和XptC1 三種蛋白組成，僅對(duì)煙芽夜蛾Heliothis virescens 的幼蟲有較高的胃毒活性。Mahar 等人(2004)報(bào)道了X.nematophila 和P.luminescens 菌液及其代謝物對(duì)沙漠蝗Schistocerca gregaria 具有較高口服殺蟲活性;國內(nèi)王勤英等對(duì)X.nematophilus HB310 菌株殺蟲活性的研究比較多，毒力測(cè)定表明該菌株不僅對(duì)菜粉蝶P.rapae、小菜蛾P(guān)lutella xylostella、云斑粉蝶Pontia daplidice、蘋掌舟蛾P(guān)halera flavescens等幼蟲以及東亞飛蝗Locusta migratoria manilensis的蝗蝻和成蟲具有廣譜的殺蟲活性，而且對(duì)棉鈴蟲Helicoverpa armigera 幼蟲具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用(王勤英等，2004;毛文杰等，2007;張園等，2013)，并且證實(shí)了該菌株的殺蟲活性組分也是Tc類毒素蛋白復(fù)合物(王勤英等，2005;Wang et al.，2012)。劉崢等(2003)和金永玲等(2010)分別報(bào)道了X.nematophilus 對(duì)菜粉蝶幼蟲和小菜蛾幼蟲的拒食活性。越來越多的證據(jù)證明這些昆蟲病原線蟲共生菌所具有的廣譜殺蟲活性與同一菌內(nèi)存在多種Tc 毒素有關(guān)。Tc 毒素所顯示的廣譜殺蟲活性也引起越來越多的人對(duì)該類毒素的關(guān)注和研究，認(rèn)為這些共生菌和Tc 毒素在農(nóng)業(yè)害蟲防治方面具有很好的開發(fā)應(yīng)用潛力(Ffrench-Constant et al.，2007)。

1.2 Tc 毒素蛋白的組成

Tc 毒素一般是由3種類型的蛋白亞基共同組成的高分子量蛋白復(fù)合體。根據(jù)蛋白序列相似性和分子量的大小，蛋白亞基被分為A、B、C 三種類型。為了更好的研究Tc 類毒素蛋白，Waterfield等(2001)和Ffrench-Constant 等(2005)根據(jù)基因位點(diǎn)名稱和蛋白類別對(duì)Tc 毒素中的蛋白亞基制定了命名原則，例如TcdA1 代表由tcd 基因位點(diǎn)上的基因編碼的A 類蛋白，“1”代表tcd 基因多拷貝中的第一個(gè)。實(shí)際上，并不是每個(gè)基因位點(diǎn)都參與編碼這3 類蛋白亞基，而是只有tcd 參與到所有3 類蛋白的編碼，其被認(rèn)為是P.luminescens W14 基因組中致病島的一部分。嗜線蟲致病桿菌產(chǎn)生的兩種Tc 毒素都是由3種蛋白亞基組成的，第一種由XptA1、XptB1 和XptC1 這三個(gè)蛋白亞基組成，XptA1 在pH10.5 這樣較高的溶液環(huán)境下仍能保持原有構(gòu)象，意味著它能夠抵御鱗翅目幼蟲中腸酶液的降解而保持生物活性(Lee et al.，2007);第二種由XptA2、XptB1 和XptC1 三個(gè)亞基按照4∶1∶1 比例構(gòu)成。在這兩種Tc 毒素中，XptA1 和XptA2 是主效蛋白，在Tc 毒素的殺蟲活性中其主要作用，而XptB1 和XptC1 是輔助蛋白，只有這三種蛋白亞基在一起才具有殺蟲活性，其中XptB1 和XptC1 可被來自于P.luminescens 的TcdB2 和TccC3 分別替代，與XptA2 形成新的雜合蛋白，并且其殺蟲活力顯著高于天然的Xpt 蛋白毒素(Sheets et al.，2011)。

1.3 Tc 毒素蛋白的結(jié)構(gòu)

嗜蟲致病桿菌Tc 毒素的XptA1 或XptA2、XptB1 和 XptC1 蛋白分子量分別由 2523(287 kDa)或2538(284 kDa)、1401(170 kDa)和1014(110 kDa)個(gè)氨基酸組成(Morgan et al.，2001)，Tc 毒素中的3種蛋白以4∶1∶1 化學(xué)組成復(fù)合物，分子量高達(dá)1402 kDa(圖1)(Sheets et al.，2011)。對(duì)嗜線蟲致病桿菌Tc 毒素中的XptA1 和XptA2 蛋白結(jié)構(gòu)研究表明，自然狀態(tài)下，XptA1 和XptA2 均是以四聚體的方式形成一個(gè)中空的籠狀結(jié)構(gòu)，XptB1 和XptC1 被包裹在其內(nèi)，其中XptC1 在胞內(nèi)被酶解成大約70 kDa 和30 kDa 兩個(gè)片段(圖1)(Lee et al.，2007;Sheets et al.，2011)，每個(gè)XptA1 蛋白單體均含有3個(gè)明顯的電子密集域，對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)分析也證實(shí)XptA1 蛋白含有三個(gè)結(jié)構(gòu)域(Lee et al.，2007)。尹富仕等人(2010)應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)XptA2 蛋白也含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，但是每個(gè)結(jié)構(gòu)域單獨(dú)表達(dá)的產(chǎn)物活性均很低。Christos 等(2013)利用冷凍電子顯微鏡觀察到P.luminescens Tc 毒素中的TcdA1 蛋白也是以以四聚體的方式形成一個(gè)中空的籠狀結(jié)構(gòu)。此外，來自對(duì)非昆蟲病原線蟲共生菌Y.entomophaga的Yn-Tc 毒素的3D 結(jié)構(gòu)研究表明，Yn-Tc A 蛋白也有與XptA 蛋白類似的結(jié)構(gòu)，該蛋白形成五聚體籠狀結(jié)構(gòu)，Yn-Tc B 和Yn-Tc C 位于籠套的頂端，此外，Yn-Tc 毒素復(fù)合物中還含有兩個(gè)幾丁質(zhì)酶亞基，具有內(nèi)切殼聚糖的活性，其功能可能與圍食膜的降解有關(guān)(Landsberg et al.，2011)。

圖1 Xpt 蛋白毒素結(jié)構(gòu)模型(Sheets et al.，2011)Fig.1 Structural model of the Xpt protein toxin complex

1.4 編碼Tc 毒素的殺蟲基因

隨著越來越多的昆蟲病原線蟲共生菌基因組測(cè)序的完成，對(duì)共生菌中編碼Tc 毒素的基因組成、排列方式等有了更深入的了解(Chaston et al.，2011;Lanois et al.，2013)。與Bt 中cry 基因不同的是，目前在這些非Bt 細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的編碼Tc 毒素的殺蟲基因是以操縱元(operon)形式存在的(圖2)(Ffrench-Constant et al.，2007)，一般需要至少3個(gè)不同基因(tcA，tcB 和tcC)同時(shí)表達(dá)形成蛋白毒素復(fù)合物(Tc)才能發(fā)揮充分的殺蟲作用，單一基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物殺蟲活性很低或沒有殺蟲活性(Morgan et al.，2001;Waterfield et al.，2005;Ffrench-Constant et al.，2007)。發(fā)光桿菌P.luminescens 中不同的Tc 毒素蛋白基因簇tca、tcb、tcc 和tcd 位點(diǎn)(locus)包含有不同數(shù)目的基因，根據(jù)基因序列，在這些基因位點(diǎn)內(nèi)的所有單個(gè)基因可以歸為三個(gè)類群:tcdA類(A)、tcaC 類(B)和tccC 類(C)，每個(gè)類群內(nèi)的基因編碼的蛋白在Tc 毒素中具有類似的功能(Ffrench-Constant et al.，2005)。在P.asymbiotica基因組中也發(fā)現(xiàn)了tca、tcb、tcc 和tcd 四個(gè)tc 基因簇位點(diǎn)，但是，這些tc 位點(diǎn)中的基因發(fā)生了gene loss and pseudogene formation，導(dǎo)致P.asymbiotica菌失去了對(duì)煙草天蛾幼蟲的胃毒殺蟲活性(Hinchliffe et al.，2010)。在具有廣譜殺蟲活性的嗜蟲致病桿菌中也發(fā)現(xiàn)了緊密連鎖分布的xptA1、xptA2、xptB1 和xptC1 基因，xptA1 和xptA2 是主導(dǎo)基因，分別與xptB1 和xptC1 基因編碼的蛋白組成兩種Tc 復(fù)合體:Xpt-Tc1(XptA1、XptB1 和XptC1)和Xpt-Tc2(XptA2、XptB1 和XptC1)，三個(gè)基因一起表達(dá)的Tc 毒素才具有充分的殺蟲活性，單一基因表達(dá)產(chǎn)物的殺蟲活性很低(Morgan et al.，2001;Sergeant et al.，2003)。引起蠐螬琥珀病的Serratia entomophila Sep-Tc 毒素是由位于質(zhì)粒上的sepA、sepB 和sepC 三個(gè)基因編碼的，其中sepA 是主效基因，三個(gè)基因一起表達(dá)才能顯示出其殺蟲活性(Hurst et al.，2000;Dodd et al.，2006;Hurst et al.，2007);最近，又從Yersinia entomophaga 發(fā)現(xiàn)了類似的基因簇:yenA1、yenA2、yenB、yenC1 和yenC2，該類基因編碼的蛋白形成的Yen-Tc 毒素復(fù)合物也具有廣譜殺蟲活性(Hurst et al.，2011)。這些編碼Tc 毒素的基因緊密連鎖在染色體或質(zhì)粒上形成約30-40 kbp 的致病島，其編碼的蛋白也比較大，一般在1000個(gè)氨基酸左右或以上。整個(gè)基因組序列分析表明，在tc基因簇兩側(cè)往往還有其他相關(guān)基因，如編碼幾丁質(zhì)酶的基因，在P.luminescens 和X.nematophila的Tc 致病島上都發(fā)現(xiàn)有編碼幾丁質(zhì)酶基因，到目前為止，還不清楚這些幾丁質(zhì)酶基因與Tc 毒素的關(guān)系(Morgan et al.，2001;Busby et al.，2012)。Tc 致病島通常插入到基因組tRNA 旁邊，此外，在Tc 致病島上，往往還存在編碼轉(zhuǎn)座酶類或噬菌體的基因存在，這些基因的存在有助于tc 類基因在同一物種內(nèi)或不同物間的水平轉(zhuǎn)移，這能夠解釋為何編碼Tc 類毒素的基因存在于多種細(xì)菌中(Waterfield et al.，2005)。

圖2 tc 基因的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of the tc genes

2 Tc 毒素作用機(jī)理

盡管Tc 類毒素對(duì)昆蟲中腸組織病理學(xué)影響與Bt δ-內(nèi)毒素類似，被敏感昆蟲取食后也能夠破壞中腸細(xì)胞組織(Blackburn et al.，1998;Nangong et al.，2006;Sean et al.，2012)，但是到目前為止，對(duì)該類毒素在蟲體內(nèi)的作用方式尚不清楚，現(xiàn)有研究結(jié)果認(rèn)為Tc 毒素的作用模式與Bt Cry 毒素可能存在差別很大(圖3、圖4)(Lee et al.，2007;Landsberg et al.，2011;Sheets et al.，2011)。離體實(shí)驗(yàn)證實(shí)Xpt 復(fù)合物中的XptA2 蛋白不僅能與昆蟲中腸刷狀緣膜囊泡(BBMV)結(jié)合，而且能在人造膜上形成空洞(Sheets et al.，2011)。Lang 等(2013)通過對(duì)來自 P.luminescens Tc 毒素復(fù)合物中的TcdA1 蛋白的電生理分析表明，TcdA1 蛋白也能夠在人造雙層脂膜上形成離子滲透通道。

圖3 Tc 毒素中不同蛋白之間的關(guān)系及作用模式(Ffrench-Constant et al.，2007)Fig.3 The roles and interation mechanism among the proteins in tc protein

Lang 等(2010，2011)檢測(cè)了來自 P.luminescens 的Tc 毒素復(fù)合物中的TcC 蛋白的活性，證實(shí)該蛋白作用于細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白，具有ADP-ribosyltransferases 活性，提出了Tc 毒素的假想作用模式:Tc 毒素復(fù)合物被敏感昆蟲取食后，不經(jīng)酶解直接穿過圍食膜，其中多聚體TcA 部分首先選擇性地與靶標(biāo)細(xì)胞壁接觸形成孔洞，隨后其上的TcC 亞基進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，通過ADP 核糖基化作用導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白和Rho 三磷酸酶的改變，誘導(dǎo)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白的集聚并抑制細(xì)胞的吞噬作用，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

圖4 Yen-Tc 毒理功能模型(Landsberg et al.，2011)Fig.4 Yen-Tc toxicological function model

Christos 等(2013)通過對(duì)比TcdA 插入細(xì)胞膜形孔道時(shí)和與TcB 和TcC 形成聚合物時(shí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)TcA 在插入細(xì)胞膜時(shí)構(gòu)象發(fā)生劇烈變化，這種注射式機(jī)制是一種新的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，就像是注射器一樣(圖5)。這種機(jī)制解釋了ABC 型毒素復(fù)合物是如何在細(xì)胞膜上構(gòu)成通道并將其致死性結(jié)構(gòu)運(yùn)輸?shù)剿拗骷?xì)胞質(zhì)中，研究人員深信他們提出的這種機(jī)制是整個(gè)ABC 型毒素家族的特點(diǎn)。該課題組的研究人員借助X 射線晶體學(xué)和電子冷凍顯微鏡，生成了發(fā)光桿菌的Tc 毒性復(fù)合物精細(xì)圖像，揭示出了這些分子復(fù)合物是從何處取得能量來穿透細(xì)胞膜的。Tc 復(fù)合物中的TcA 上有一條由48個(gè)氨基酸構(gòu)成的肽鏈，它像松緊帶或彈簧一樣被拉長(zhǎng)，如果松緊帶或彈簧收縮，就會(huì)釋放能量推動(dòng)這一通道通過細(xì)胞膜，像注射器一樣將一些毒性酶投入到細(xì)胞中。此外，TcA 亞基上還有一個(gè)由20個(gè)氨基酸組成的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)將這一復(fù)合體結(jié)合到宿主細(xì)胞上;為此，Tc 復(fù)合體中4個(gè)這樣的結(jié)構(gòu)域往往圍繞一個(gè)受體，從而提高了結(jié)合的強(qiáng)度(Meusch et al.，2014)。

圖5 Tc 毒素類似注射器的穿膜機(jī)制(Christos et al.，2013)Fig.5 Syring-like mechanism for membrane insertion of Tc protein

3 小結(jié)與展望

昆蟲病原線蟲共生菌Tc 毒素作用機(jī)理不同于Bt 毒素，并且具有高效、廣譜等優(yōu)點(diǎn)，作為新的生物殺蟲劑或者作為培育轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的基因源，具有很好的商業(yè)潛力和應(yīng)用前景。Tc 毒素是由三類蛋白組成的分子量高達(dá)1402 kDa 的復(fù)合體，目前為止研究人員已經(jīng)確定了大部分蛋白的空間結(jié)構(gòu)，逐步明確了它們各自的功能，解答了毒素如何進(jìn)入到宿主細(xì)胞質(zhì)中以及運(yùn)輸過程中能量的來源等問題。但是毒素殺蟲機(jī)理仍未研究清楚，許多問題仍有待進(jìn)一步研究。由多亞基組成的大分子蛋白Tc 毒素是如何穿透昆蟲圍食膜到達(dá)中腸細(xì)胞?被攝入昆蟲中腸內(nèi)以后是否存在類似Bt Cry蛋白的酶解作用?該毒素在昆蟲中腸里的受體蛋白是什么?如果TcA 只是形成一種穿膜的蛋白運(yùn)輸機(jī)制，那么被注入到細(xì)胞內(nèi)致死結(jié)構(gòu)又是什么?對(duì)Tc 毒素蛋白特性及殺蟲機(jī)理的深入研究，必將為生物蛋白質(zhì)農(nóng)藥提供更加豐富、新穎的資源。

產(chǎn)生Tc 毒素的昆蟲病原線蟲共生菌因?yàn)榫哂锌诜付净钚钥梢灾苯又瞥晌⑸镛r(nóng)藥應(yīng)用于田間。與Bt 殺蟲蛋白類似，Tc 毒素蛋白也會(huì)受紫外線影響而導(dǎo)致變性失活，因此在制劑中加入一些紫外線保護(hù)劑可減少由其造成的影響，也可將Tc毒素蛋白制成微膠囊劑把蛋白保護(hù)起來防止蛋白變性(官珊等，2005;周學(xué)永等，2006)。Tc 基因成簇性、協(xié)同作用性導(dǎo)致其單個(gè)基因表達(dá)產(chǎn)物活性很低，其較大的基因結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)影響了利用這些基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物操作(Liu et al.，2003)，隨著基因工程技術(shù)的越來越成熟，多基因的遺傳操作問題也會(huì)得以解決，Tc 毒素定將為生物防治開辟一條新的途徑。

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