DNA 條形碼快速鑒定廣州木槿蚜蟲

汪珍春，鄧其芬，陳詩穎，鄭毅勝，姜立云

(1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510006;2.中國科學(xué)院動物進化與系統(tǒng)學(xué)重點實驗室，北京 100101)

木槿 Hibiscus syriacus Linn.隸屬錦葵科Malvaceae 木槿屬Hibiscus Linn.的常綠灌木或小喬木，又稱赤槿、佛桑、扶桑等，在中國嶺南一帶被俗稱為大紅花，是廣州市的常見綠化植物。木槿在春、秋兩季非常容易受到蚜蟲的威脅，嫩枝、葉片、花蕾是其主要寄生部位，常造成葉面卷縮，花蕾不開放甚至脫落，蚜蟲排泄的蜜露還會污染葉面和枝梢，造成煙霉病，影響木槿的生長和美觀(Ellis et al.，1998)。

蚜蟲類Aphidinea 昆蟲隸屬于昆蟲綱Insecta 半翅目Hemiptera，世界已知5000 余種(Favret，2013)。中國蚜蟲類資源豐富，已知種類有1100余種(Liu et al.，2009)。蚜蟲體型很小，形態(tài)特征特化或退化，具有復(fù)雜的多型現(xiàn)象，有效的形態(tài)鑒別特征較少。通常每個蚜蟲物種具有有翅孤雌型和無翅孤雌型2個型，在具有全周期生活史的蚜蟲甚至多達5-8個型，包括干母、干雌、有翅孤雌型、無翅孤雌型、產(chǎn)雌性母、產(chǎn)雄性母、雌性蚜和雄性蚜(張廣學(xué)和鐘鐵森，1983)。所采樣本主要是無翅孤雌型和少量的有翅孤雌型。此外，許多蚜蟲還有多種體色型，例如根據(jù)本研究發(fā)現(xiàn)棉蚜Aphis gossypii Glover 的體色有白色、白綠色、黃色、粉綠色、墨綠色和黑色等。

DNA 條形碼(DNA barconding)是利用線粒體細胞色素C 氧化酶亞基I(Cytochrome coxidase subunit I，COI)作為動物通用的物種鑒定標記(Hebert et al.，2003)，通過對基因序列差異的分析可以將所有物種進行快速鑒定，不受物種形態(tài)鑒定知識缺乏的限制。DNA 條形碼技術(shù)在許多動物類群中得到了應(yīng)用，積累了大量的數(shù)據(jù)。在蚜蟲物種鑒定方面也做了大量的嘗試，結(jié)果表明COI基因可以很好地區(qū)分大部分物種，在蚜蟲鑒定中具有顯著的優(yōu)勢和應(yīng)用價值(Wang and Qiao，2009;Pelletier et al.，2012;Rebijith et al.，2013;汪珍春等，2013;Armelle et al.，2014)。

城市綠化植物上蚜蟲種類快速、準確的鑒定對于殺蟲劑種類的選取，以及抗蚜蟲品系的篩選都具有重要的指導(dǎo)作用，然而，僅依據(jù)形態(tài)特征開展的蚜蟲物種鑒定工作中的錯誤鑒定和同物異名現(xiàn)象時有發(fā)生，而且需要具有扎實的專業(yè)知識與豐富經(jīng)驗的分類學(xué)者才能完成。因此，本研究采集了廣州市越秀區(qū)、天河區(qū)、海珠區(qū)和大學(xué)城的木槿上的蚜蟲樣品共計64 份，通過擴增和分析其COI 基因，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以期對廣州市木槿蚜蟲物種的快速、準確鑒定提供依據(jù)，為植保工作提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

研究用蚜蟲樣品均采自廣州市木槿，共計64 份樣品(表1)，涉及3 屬5種。所采集的樣品分別浸泡于75%和95%酒精中。其中，75%酒精浸泡標本用于形態(tài)鑒定，95%酒精浸泡標本用于分子實驗。標本由中國科學(xué)院動物研究所喬格俠研究員鑒定，并保存于中國科學(xué)院動物研究所國家動物博物館(中國，北京)和廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。

1.2 粗提DNA、PCR 擴增、測序以及序列比對分析

DNA 的粗提取:利用 TakaRa 公司的MightyAmp DNA Polymerase Ver.2 試劑盒對樣品進行 DNA 粗提。該試劑盒由 MightyAmp DNA Polymerase(1.25U/μL)和MightyAmp Buffer Ver.2(Mg2+，dNTP plus)組成。本實驗選取浸泡于95%酒精中的體型較大的單個蚜蟲蟲體，吸干蟲體表面酒精后，用dH2O 漂洗3 次，浸泡過夜。次日更換dH2O 后，保留約3 μL 的dH2O，用研磨杵將蟲體研碎，吸取上清液，即得到單個蚜蟲DNA粗提液。

PCR 引物及擴增條件:擴增引物為通用引物LEP-F(ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG)和LEP-R(AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA)，用于擴增COI 基因3'端約700 bp 的片段。反應(yīng)條件為98℃變性2 min，98℃變性10 s，54℃退火15 s，68℃延伸1 min，35個循環(huán)。68℃最終延伸10 min。擴增體系為20 μL，包括:MightyAmp Buffer Ver.2 10 μL，primer1 1 μL，primer2 1 μL，DNA 粗提液2 μL，MightyAmp DNA Polymerase 0.5 μL，dH2O 5.5 μL。

擴增產(chǎn)物測序:PCR 產(chǎn)物純化后，利用ABI 3730xl 96-capillary DNA 分析儀(Applied Biosystems，USA，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司廣州分公司)進行雙向測序。

序列比對、分析:通過 Seqman 5.01(DNASTAR，Inc.1996)軟件對雙向測序結(jié)果進行拼接、校對、切去引物得到 658 bp;應(yīng)用DNAMAN 5.2.2(Lynnon Biosoft，Quebec，Canada)軟件檢驗是否能正確翻譯蛋白質(zhì)以確保序列的正確性;在GENBANK 中進行BIAST 確定所獲序列為蚜蟲序列以排除其他物種的干擾;使用MEGA 5.0(Tamura et al.，2007)對序列進行多重比對。通過DAMBE 程序(Xia and Xie，2001)進行序列飽和性分析，以轉(zhuǎn)換、顛換為縱軸，以TN93 模型(Tamura and Nei，1993)校正的距離為橫軸做散點圖。如果這些點隨序列間距離的增大而呈線性分布，說明序列間的替換沒有達到飽和，這些序列可以用于后續(xù)的分析;利用MEGA 5.0 查看核酸組成;基于K2P 模型(Kimura-2-parameter distance，Kimura，1980)，計算序列差異，構(gòu)建鄰接樹(Neighbour-Joining tree，NJ tree)，并對各分支節(jié)點進行Bootsrap 檢驗(檢測1000 次，每次檢測隨機加樣重復(fù)100 次);應(yīng)用EXCEL 軟件(Microsoft Office Excel 2003)計算各差異頻次，繪制頻次圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品鑒定結(jié)果

所獲64 份蚜蟲樣本經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子學(xué)鑒定，共涉及3 屬5種，見表1。

表1 研究所用蚜蟲樣品信息Table 1 List of aphid samples used in this study

(續(xù)上表)

(續(xù)上表)

2.2 COI 序列特征分析

實驗獲得全部樣品的64 條序列，經(jīng)MEGA 比對后每個序列得到649 bp，編碼216個氨基酸。堿基平均含量為40.9% T，14.0% C，34.8% A，10.3%G。A+T 含量為75.7%，C+G 含量為24.3%，存在明顯的A、T 堿基偏好性。其中，有保守位點521個，可變位點128個，簡約位點110個，單個突變位點18個。

2.3 COI 序列飽和性分析

運用DAMBE 軟件對64個序列進行飽和性分析，結(jié)果顯示(圖1)，序列間轉(zhuǎn)換、顛換數(shù)隨距離增加呈線性增長趨勢，未表現(xiàn)出飽和態(tài)勢，因此所有數(shù)據(jù)都可被用于后續(xù)分析。

2.4 NJ 樹結(jié)構(gòu)分析

運用鄰接法和K2P 模型構(gòu)建了所有樣本序列的NJ 樹(圖2)。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹與形態(tài)鑒定的結(jié)果，共鑒定出木槿植物上蚜蟲5種，分屬2個亞科，即蚜亞科Aphidinae(3種)和長管蚜亞科Macrosiphinae(2種)。

從NJ 樹可以看出，所有同一物種的樣品都有效地聚為一支，支持率達99%。僅具有一個樣品的物種也與其他物種明顯地區(qū)分開。

2.5 遺傳距離分析

圖1 基于649 bp 線粒體基因COI 的序列飽和性分析散點圖Fig.1 Saturation plots for the mitochondrial COI sequences with 649 bp

基于K2P 模型，計算了64 條COI 序列間的平均遺傳距離為2.95%，標準差為5.45%，距離范圍為0-10.90%。主要集中在0-1.20% 和6.60%-11.00%范圍內(nèi)，種內(nèi)遺傳距離和種間遺傳距離之間形成明顯的“Barcoding gap”(圖3)。種內(nèi)遺傳距離為0-2.30%，平均距離為0.30%，標準差為1.17%。選取分別有3個以上樣品的4個物種，計算了每個物種的平均種內(nèi)遺傳距離(表2)，桃蚜的種內(nèi)遺傳距離最小，為0;蘋果蚜的種內(nèi)遺傳距離最大，為1.90%。種間遺傳距離為3.30%-10.90%，平均遺傳距離為9.00%，標準差為3.81%。5個物種間的平均遺傳距離表明(表3)，蘋果蚜和繡線菊蚜之間的遺傳距離最小，為3.68%;蘋果蚜和月季長管蚜之間的遺傳距離最大，為10.15%。

圖2 基于COI 序列和K2P 模型構(gòu)建的NJ 樹(自舉檢驗支持率標注于分支基部)Fig.2 Neighbour-Joining(NJ)tree based on COI sequences and Kimura's two parameter(bootstrap percentages shown on the base of branches)

表2 各種種內(nèi)遺傳距離Table 2 Mean and range of intraspecific genetic distance

表3 各種種間遺傳距離Table 3 Mean and range of interspecific genetic distance

3 結(jié)論與討論

3.1 基于COI 基因的條形碼對木槿蚜蟲的鑒定效力

COI 基因作為條形碼技術(shù)的分子標記，能否鑒定出物種取決于種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離的差異程度(Aliabadian et al.，2009)，在種間遺傳距離與種內(nèi)遺傳距離存在“Barcoding Gap”時，鑒定成功率較高。Hebert 等(2003)對脊椎動物和無脊椎動物的線粒體COI 基因序列分析得出結(jié)論:除腔腸動物外，98%物種的種內(nèi)遺傳距離差異為0-2.00%，種間遺傳距離差異平均可達11.30%。本研究收集了廣州市越秀區(qū)、天河區(qū)、海珠區(qū)和大學(xué)城木槿植物上64個蚜蟲樣品，種內(nèi)平均差異為0.30%，種間平均差異為9.00%，種間平均差異是種內(nèi)平均差異的30 倍，物種間沒有重疊(圖3)。所有的樣品鑒定效率達99%，說明所擴增的COI 基因作為鑒定木槿蚜蟲的條形碼是可行的。這一結(jié)論也與已有蚜蟲條形碼研究相一致(Pelletier et al.，2012;陳睿等，2013;Rebijith et al.，2013;王哲，2013;汪珍春等，2013;溫娟等，2013;Armelle et al.，2014;)。

3.2 基于COI 基因的條形碼有助于了解物種的多樣性

圖3 基于線粒體COI 649 bp 序列和K2P 距離的種間序列差異頻次圖Fig.3 Histogram of genetic divergence using mitochondrial COI 649 bp sequences.Divergences were calculated using Kimura's two parameter model(K2P)

從NJ 樹上可以看出，木槿蚜蟲在地理分布上存在一定的規(guī)律，所有區(qū)的木槿植物上都有棉蚜寄生，且聚為一支，沒有出現(xiàn)種下分化，是為害木槿植物的主要種類。而桃蚜、蘋果蚜、月季長管蚜主要分布在珠江以南的海珠區(qū)和大學(xué)城，尤以大學(xué)城的種類豐富，同時分布有4種。這主要與大學(xué)城的地理位置有關(guān)。廣州大學(xué)城位于廣州市番禺區(qū)小谷圍島，東經(jīng)113°40'，北緯23°06'，面積17.9 km2，擁有南亞熱帶季風氣侯，溫暖多雨、光熱充足、夏季長、霜期短等特征。大學(xué)城擁有綠化面積上千畝，植被500 余種，擁有完整而良好的生態(tài)環(huán)境，所以蚜蟲的種類較豐富。而其他3個區(qū)為中心城區(qū)，植被多為人工栽培品種，較為單一，所以蚜蟲種類也較單一，主要以棉蚜為主，且種群數(shù)量較大。木槿是棉蚜的主要冬寄主，夏寄主以黃瓜等蔬菜為主(Liu et al.，2000;Zhang et al.，2001)，當木槿秋季被棉蚜大范圍為害后易造成夏季蔬菜的蚜蟲蟲害。因此，對COI基因序列的分析和研究可以為物種多樣性研究提供信息。

3.3 基于COI 基因的條形碼有助于蚜蟲的鑒定

蚜蟲具有非常復(fù)雜的多型現(xiàn)象，同時不同的生物型也存在不同的季節(jié)型或者顏色型。棉蚜在木槿的葉、莖、花上都有寄生，體色有白色、白綠色、黃色、粉綠色、墨綠色和黑色(圖1)，僅根據(jù)形態(tài)學(xué)的鑒定很容易混淆，基于COI 基因的DNA 條形碼能有效地將同一寄主同一器官或不同器官上顏色不同的蚜蟲進行準確地鑒定。

因此，基于COI 基因的DNA 條形碼可以幫助解決常見危害木槿上不同種蚜蟲易被混淆的問題，同時還可以避免將特征差異較大(例如:體型不等、體色不同)的同種蚜蟲鑒定為不同物種的錯誤，對非專業(yè)分類人員的快速準確鑒定蚜蟲物種起到了極大的幫助，可為提高木槿蚜蟲的防治效率，降低防治成本做出貢獻。

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