胃癌轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在胃癌發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)性研究

唐明武 陳文習(xí)

胃癌轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在胃癌發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)性研究

唐明武 陳文習(xí)

目的篩選胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的差異表達(dá)基因，構(gòu)建差異調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。方法在本文的研究中，我們從公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO數(shù)據(jù)庫(kù)）中下載胃癌相關(guān)表達(dá)譜數(shù)據(jù)GSE2685的基因芯片（7個(gè)正常組織樣本，23個(gè)胃癌組織樣本），篩選胃癌和正常胃組織的差異基因（P＜0.05及差異值＞2或＜-2）；計(jì)算差異基因與靶基因間的皮爾森相關(guān)系數(shù)（∣PCC∣＞0.75），構(gòu)建差異調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；GO富集方法分析差異調(diào)控網(wǎng)絡(luò)基因的功能。結(jié)果在這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，一些轉(zhuǎn)錄因子（TFs）和靶基因在之前的相關(guān)研究中已經(jīng)被證實(shí)與胃癌相關(guān)。此外我們也發(fā)現(xiàn)一些新的轉(zhuǎn)錄因子和靶基因與胃癌相關(guān)。有效的整合以往的研究結(jié)果，讓我們對(duì)應(yīng)用轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)識(shí)別胃癌相關(guān)基因的方法有了新的認(rèn)識(shí)。結(jié)論基于轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的方法識(shí)別胃癌相關(guān)基因具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

胃癌；轉(zhuǎn)錄因子；轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

全球每年新發(fā)胃癌100余萬(wàn)，中國(guó)占42%，死亡約80萬(wàn)，中國(guó)占35%，是胃癌發(fā)病率和死亡率最高的國(guó)家之一。在消化系統(tǒng)惡性腫瘤死亡病例中，約半數(shù)死于胃癌。早期胃癌經(jīng)足夠的治療后，90%以上患者能生存5年以上或治愈，而晚期胃癌患者，治療后5年生存率不足5%[1]。因此，早發(fā)現(xiàn)是改善療效、提高生存率的關(guān)鍵[2]。研究表明，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常與細(xì)胞的分化、凋亡、擴(kuò)增密切關(guān)，也與腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有著直接的關(guān)系[3]。近來(lái)基于蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的研究，已揭示了腫瘤狀態(tài)與正常狀態(tài)間局部的信號(hào)調(diào)控差別[4]。細(xì)胞功能可通過(guò)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，對(duì)外界的刺激做出反應(yīng)[5]，可顯著提高腫瘤轉(zhuǎn)移的識(shí)別效能[6-7]。為了從系統(tǒng)角度理解癌癥的信號(hào)調(diào)控模式，本文綜合多種信息，構(gòu)建人類信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，分析其網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩?。?duì)這些轉(zhuǎn)錄因子及通路上新進(jìn)展的理解，有助于我們對(duì)胃癌的創(chuàng)新性復(fù)合型方法的研發(fā)鋪平道路。在本研究中，我們?cè)噲D應(yīng)用轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)篩選幾種潛在的和胃癌相關(guān)的基因，并探索幾種新的具有預(yù)測(cè)性的生物標(biāo)志物和靶基因。

材料和方法

一、數(shù)據(jù)來(lái)源

1.Affymetrix基因芯片數(shù)據(jù)

從公共功能基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)GEO（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/geo/）[8]中下載一個(gè)胃癌轉(zhuǎn)錄譜的基因芯片，編號(hào)為GSE2685[9]。此數(shù)據(jù)集包含7個(gè)正常組織的樣本，23個(gè)胃癌組織的樣本?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus,GEO）是基于美國(guó)昂飛公司平臺(tái)數(shù)據(jù)建立的一個(gè)公用數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)。平臺(tái)信息：GPL80（Affymetrix人類基因組U133 2.0芯片）。芯片的探針注釋信息來(lái)自A ffymetrix公司，包含所有A ffymetrix ATH1（25K）芯片的探針信息。下載原始文件以及該平臺(tái)探針注釋信息文件。

2.通路數(shù)據(jù)

KEGG（京都基因和基因組百科全書）是一個(gè)與基因組，酶通路和生化制品相關(guān)的在線的數(shù)據(jù)庫(kù)集合（Kanehisa，2002），其中PHTHWAY數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄了細(xì)胞內(nèi)分子間相互作用的網(wǎng)絡(luò)和和它們?cè)谔囟ńM織中的突變體（http://www.genome.jp/kegg/）。從KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中總共收集了130個(gè)通路，包含2 287條基因。

3.基因本體論（GeneOntology,GO）

數(shù)據(jù)：通過(guò)收集和整理生物學(xué)過(guò)程對(duì)應(yīng)的GO功能注釋以及對(duì)應(yīng)的基因，最終得到11 726個(gè)生物學(xué)過(guò)程的GO功能注釋，在這些生物學(xué)過(guò)程中共涉及了21 553個(gè)基因。

4.調(diào)控?cái)?shù)據(jù)

轉(zhuǎn)錄因子和靶基因調(diào)控關(guān)系數(shù)據(jù)，來(lái)自TRED和TRANSTAC數(shù)據(jù)庫(kù)。從TRANSFAC數(shù)據(jù)庫(kù)中收集到219個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和265個(gè)靶基因之間的774對(duì)調(diào)控關(guān)系。從TRED數(shù)據(jù)庫(kù)中收集到102個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和2 920個(gè)的靶基因之間的5 722對(duì)調(diào)控關(guān)系。將兩組數(shù)據(jù)集進(jìn)行整合，得到276個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和3 002個(gè)靶基因間的6 328對(duì)調(diào)控關(guān)系。

二、方法

1.數(shù)據(jù)預(yù)處理及差異基因分析

利用穩(wěn)健多序列平均法（Robust Multiarray Averaging,RMA）對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，刪除那些對(duì)應(yīng)多個(gè)基因的探針和沒(méi)有對(duì)應(yīng)基因的探針，對(duì)于有多個(gè)探針的基因，取均值。用R語(yǔ)言的limma包對(duì)胃癌相對(duì)于正常樣本進(jìn)行差異表達(dá)值計(jì)算，并用貝葉斯方法進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正。選取P值＜0.05及差異值＞2或＜-2作為顯著性閾值，得到差異表達(dá)基因。

2.差異調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了構(gòu)建胃癌差異調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將得到的差異表達(dá)基因與從TRED和TRANSTAC數(shù)據(jù)庫(kù)收集到的調(diào)控?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行匹配。通過(guò)計(jì)算差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子和靶基因之間的皮爾森相關(guān)系數(shù)（PCC）來(lái)構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。若PCC＞0.75或PCC＜-0.75，則保留該轉(zhuǎn)錄因子與其靶基因的調(diào)控關(guān)系，最后用Cytoscape軟件進(jìn)行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)繪制。

3.GO富集分析

用DAVID在線分析軟件對(duì)差異調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的基因進(jìn)行功能富集分析。

結(jié)果

一、胃癌差異表達(dá)基因的篩選

基于t檢驗(yàn)對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)中的胃癌樣本和正常對(duì)照樣本進(jìn)行差異表達(dá)分析，P值利用FDR進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正?；陲@著性水平FDR=0.01，mRNA表達(dá)譜的差異表達(dá)分析識(shí)別了2 966個(gè)異常的基因。這些差異表達(dá)基因可能與胃癌的發(fā)生，發(fā)展密切相關(guān)。具有最顯著差異表達(dá)的前10個(gè)基因見(jiàn)表1 。

表1 最顯著差異表達(dá)的前10個(gè)基因

二、胃癌差異調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)計(jì)算胃癌差異基因與靶基因間的皮爾森相關(guān)系數(shù)，得到了介于9個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和82個(gè)靶基因中有87對(duì)調(diào)控關(guān)系。在圖中，轉(zhuǎn)錄因子MYC和FLI1在該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置，和另外4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子以及73個(gè)靶基因存在調(diào)控關(guān)系，在這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，JUN，SMAD2，ETS2，XBP1具有更核心的位置，這些事實(shí)表明，這些基因可能在胃癌的發(fā)生中起著重要作用。見(jiàn)圖1。

圖1 胃癌差異調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

三、差異調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的GO功能富集

為了闡明轉(zhuǎn)錄水平的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，分別對(duì)胃癌與正常組織中差異調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了GO功能富集分析。對(duì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中基因進(jìn)行功能富集分析，多個(gè)GO條目被富集，包括對(duì)胞內(nèi)細(xì)胞信號(hào)通路，細(xì)胞程序性死亡，細(xì)胞死亡，對(duì)刺激物的反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞外刺激因子的反應(yīng)，生物發(fā)生的正調(diào)節(jié)作用等等。表2 是胃癌差異調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的GO富集結(jié)果（顯著富集的前15項(xiàng)，其中FDR值越小，富集性越顯著）。

表2 差異調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的GO功能富集

討論

對(duì)胃癌中相關(guān)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果分析可知，許多轉(zhuǎn)錄因子和通路與胃癌緊密相關(guān)。我們構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的JUN，F(xiàn)li-1，ETS2，XBP1和其它的一些調(diào)控基因與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)也經(jīng)之前相關(guān)研究證實(shí)。

JUN是公認(rèn)的禽類肉瘤病毒17的變體基因。這個(gè)基因編碼一個(gè)與病毒蛋白具有高度相似性的蛋白，編碼的蛋白與特定的靶向基因序列相互作用來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。當(dāng)正常的細(xì)胞轉(zhuǎn)染M iRNA（m iR）-146后，c-Jun的表達(dá)量明顯下調(diào)，c-Jun在免疫和炎癥反應(yīng)中起著負(fù)調(diào)節(jié)作用，并且在胃癌中具有高表達(dá)[9]。

Fli-1，是一個(gè)ETS家族的核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子成員，它參與細(xì)胞的增殖和腫瘤的形成。Fli1敲出的老鼠由于失去了血管的完整性而導(dǎo)致大腦出血，易死于胚胎發(fā)育過(guò)程中，表明Fli1參與血管的重構(gòu)過(guò)程中起關(guān)鍵作用基因的調(diào)控[10]。

MYC轉(zhuǎn)錄因子家族有3個(gè)成員，分別是NMYC基因、L-MYC基因和C-MYC基因。這三種基因都編碼一種細(xì)胞核內(nèi)的，與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的DNA結(jié)合蛋白。相關(guān)報(bào)道顯示用核酸雜交和免疫組化方法檢測(cè)了胃癌中c-myc基因的擴(kuò)增和表達(dá)，初步闡明了c-myc基因結(jié)構(gòu)異常與胃癌發(fā)生的關(guān)系[11]。國(guó)外Ureshino等[12]用小鼠模型證實(shí)了MYC基因在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中的作用。E2F1是E2F轉(zhuǎn)錄因子家族中的一個(gè)成員。E2F1參與細(xì)胞周期調(diào)控，同時(shí)也誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。研究發(fā)現(xiàn)E2F1過(guò)表達(dá)可以導(dǎo)致大鼠胚胎成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變成腫瘤細(xì)胞，這表明E2F1作為一個(gè)癌基因發(fā)揮作用[14]；然而也有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對(duì)E2F1進(jìn)行功能缺失時(shí)，腫瘤的發(fā)生率明顯升高，表明E2F1對(duì)腫瘤又存在抑制的作用[15]。TP53參與細(xì)胞周期的調(diào)控，DNA的修復(fù)和細(xì)胞凋亡。研究已經(jīng)證實(shí)TP53蛋白在人類許多腫瘤，如乳腺癌、結(jié)腸癌等中都有高表達(dá)[16]。ESR1基因編碼一類配體激活的轉(zhuǎn)錄因子雌激素受體ERα。ERα被發(fā)現(xiàn)在人和小鼠的前列腺組織中有表達(dá)，并且參與調(diào)控上皮組織生長(zhǎng)[17]。Kameda等的研究表明，ERα的表達(dá)能夠增加患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)。然而，對(duì)于雌激素受體對(duì)于患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)的影響，仍然存在爭(zhēng)議[18]。

本文研究發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與胃癌發(fā)生與進(jìn)展相關(guān)的基因，包括MYC、E2F1、TP53、ESR1等。對(duì)差異基因的研究有助于進(jìn)一步了解胃癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，并為胃癌的診斷和治療提供新的標(biāo)志物和靶標(biāo)。

1 Ali Z,Deng Y,Ma C.Progress of research in gastric cancer.J NanosciNanotechnol,2012,12(11):8241-8248.

2 Pietrantonio F,De Braud F,Da PratV,etal.A review on biomarkers for prediction of treatment outcome in gastric cancer.Anticancer Res,2013,33(4):1257-1266.

3 Klinke DJ.Signal transduction networks in cancer:quantitative parameters influence network topology.Cancer res,2010,70(5):1773-1782.

4 Jiang Y,Huang T,Chen L,etal.Signal propagation in protein interaction network during colorectal cancer progression.Biomed Res Int,2013;2013:287019.

5 Zhang Y,Xuan J,Reyes BG,etal.Networkmotif-based identification of breast cancer susceptibility genes//Engineering in M edicine and Biology Society,2008.EMBS 2008.30th Annual International Conference of the IEEE.IEEE,2008:5696-5699.

6 Kim MS,Kim JR,Kim D,etal.Spatiotemporal network motif reveals the biological traits of developmental gene regulatory networksin Drosophilamelanogaster.BMCSystBiol,2012,6:31.

7 De Craene B,Berx G.Regulatory networks defining EMT during cancer initiation and progression.NatRev Cancer,2013,13(2):97-110.

8 JiZ,JiH,JiMZ,etal.Package‘Affyhgu133A2Expr’.Biostatistics, 2014,11(3):242-253.

9 Wang G,Hu N,Yang HH,etal.Comparison of globalgene expression of gastric cardia and noncardia cancers from a high-risk population in china.PloSone,2013,8(5):e63826.

10 Riggi N,SuvàML,De VC,et al.EWS-FLI-1 modulates miRNA145 and SOX2 expression to initiatemesenchymal stem cell reprogramming toward Ew ing sarcoma cancer stem cells.Gene Dev, 2010,24(9):916-932.

11 M urakam iY,WatariK,Shibata T,et al.N-myc downstream-regulated gene 1 promotes tumor inflammatory angiogenesis through JNK activation and autocrine loop of interleukin-1αby human gastric cancer cells.JBiolChem,2013,288(35):25025-25037.

12 Ureshino H,M urakam iY,W atari K,et al.N-myc downstream regulated gene 1(NDRG1)promotesmetastasis of human scirrhous gastric cancer cells through epithelialmesenchymal transition.PloS one,2012,7(7):e41312.

13 Guo X,Guo L,Ji J,etal.miRNA-331-3p directly targetsE2F1 and induces grow th arrest in human gastric cancer.Biochem bioph res co,2010,398(1):1-6.

14 Salisbury TB,M orris GZ,Tomblin JK,et al.A ryl hydrocarbon receptor ligands inhibit igf-iiand adipokine stimulated breast cancer cellproliferation.ISRNEndocrinol,2013,2013:104850.

15 Chen J,Zhu F,Weaks RL,etal.E2F1 promotes the recruitmentof DNA repair factors to sites of DNA double-strand breaks.Cell Cycle,2011,10(8):1287-1294.

16 Spizzo R,Nicoloso MS,Lupini L,etal.miR-145 participatesw ith TP53 in a death-promoting regulatory loop and targetsestrogen receptor-αin human breast cancer cells.Cell Death Differ,2009,17 (2):246-254.

17 Coss CC,Jones A,Parke DN,et al.Preclinical Characterization of a Novel Diphenyl Benzam ide Selective ERαAgonist for Hormone Therapy in Prostate Cancer.Endocrinology,2012,153(3):1070-1081.

18 Xu CY,Guo JL,Jiang ZN,etal.Prognostic role of estrogen receptor αand estrogen receptorβin gastric cancer.Ann Surg Oncol, 2010,17(9):2503-2509.

Study of transcriptional regulatory network on the progress of human gastric cancer

TANGMing-wu, CHENWen-xi.
DepartmentofGastroenterology,Central Hospitalof Ezhou,HubeiProvince 436000

Objective The purposeof thisstudywas to construct transcriptional regulatory networksusing differentially expressed genes in gastric cancer screened by DNA microarray.Methods We downloaded the gene expression profile of gastric cancer from Gene Expression Omnibus database GSE2685 which included 7 normal tissuesand 23 gastric cancer tissues.Then,we identified the differentially expressed genes(DEGs) between gastric cancer and normal sam ple tissuew ith the threshold of P＜0.05 and fold change value＞2 or＜-2.We calculated the Pearson Correlation Coefficient(PCC)between DEGs and their targetgenes to construct regulatory networksw ith the cutoff criterion of∣PCC∣＞0.75.GO enrichmentmethod wasused to analyze the function of genes in regulatory networks.Results In this regulatory network,some transcription factorsand targetgeneshad been confirmed in the previous related research associatedw ith gastric cancer.In addition,we also found some new transcription factorsand targetgenesassociated with gastric cancer.An effective integration of previous research results broughtus confidence on the application of transcriptional regulatory network for identifying gastric cancer associated genes.Conclusion We identified the thatDEGswere associated w ith progression of gastric cancer.The findingsm ightprovide the ground work for the further study of themolecularmechanism of gastric cancer.

Gastric cancer;Transcriptional factors;Transcriptional regulatory network

2014-07-08）

（本文編輯：白楊）

10.3969/j.issn.1672-2159.2015.01.002

436000湖北省鄂州中心醫(yī)院消化內(nèi)科

陳文習(xí)，E-mail：964494093@qq.com