角蛋白裂解法治療亞臨床階段人乳頭瘤病毒感染的臨床試驗(yàn)研究

劉永浩??王玉玲??姚勇??肖鳳華

[摘要] 目的 探討角蛋白裂解法治療亞臨床階段人乳頭瘤病毒感染的臨床效果。 方法 自行配置藥物治療亞臨床階段人乳頭瘤病毒感染尖銳濕疣患者31例，涂擦整個(gè)外陰表皮和肛周表皮，每周記錄皮損情況，并記錄是否有病理復(fù)發(fā)情況。同時(shí)在皮膚的第二個(gè)增殖周期是做HPV-DNA-PCR檢查，并記錄檢查的結(jié)果。 結(jié)果 31例患者在用藥過(guò)程中，在一個(gè)皮膚增殖周期內(nèi)有約20例復(fù)發(fā)，在第一個(gè)皮膚增殖周期中未見(jiàn)有疣體長(zhǎng)出皮膚表面。HPV-DNA-PCR、陰性率為35.5%。第二個(gè)周期是為74.2%。第三個(gè)周期時(shí)為80.6%。仍然約有20%的病理查出HPV-DNA陽(yáng)性，但是未見(jiàn)有疣體長(zhǎng)出。在檢驗(yàn)出的DNA分型中其中HPV6型陽(yáng)性率最高，HPV6，HPV11，HPV42，HPV18，HPV52，HPV56這六種DNA分型出現(xiàn)約95%的概率。 結(jié)論 本法治療亞臨床階段人乳頭瘤病毒感染效果良好，副作用小。

[關(guān)鍵詞] 角蛋白；角蛋白相關(guān)中間絲聚合蛋白；人乳頭瘤病毒；過(guò)氧二酰胺；乙酸；甘油

[中圖分類(lèi)號(hào)] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2015）17-181-04

Clinical experimental study of keratin lysis method treatment of human papillomavirus infection duiring subclinical stage

LIU Yonghao WANG Yuling YAO Yong XIAO Fenghua

Linyi Traditional Chinese Medicine Hospital，Linyi 276002，China

[Abstract] Objective To study the clinical effect of keratin lysis method in the treatment of human papillomavirus infection duiring subclinical stage. Methods 31 patients with condyloma acuminatum，who were infected by human papillomavirus duiring subclinical stage，were treated with drugs made by oneself，were embrocate on the whole vulvar epithelium and perianal epithelium.To record the skin lesions situation every week，and to record the situation of pathological recurrence or not.At the same time to make HPV-DNA-PCR inspection on skin during the second proliferation cycle，and to record examination results. Results The process of medication on the 31 patients，there were approximately 20 cases recurrence in every skin proliferation cycle.The HPV-DNA-PCR negative rate was 35.5% during the first skin proliferation cycle without wart outgrown on skin surface，which was 74.2% during the second cycle，and which was 80.6% during the third cycle with 20% of positive pathological without wart outgrown.The highest positive rate was HPV6 of all the docimastic DNA typing，the 95% probability appearance on the six type of DNA were HPV6，HPV11，HPV42，HPV18，HPV52，HPV56. Conclusion Keratin lysis method in the treatment of human papillomavirus infection duiring subclinical stage has better effect and little side effect.

[Key words] Keratin；Intermediate filament protein；Human papillomavirus；Peracetic diamide；Acetic acid；Glycerol

尖銳濕疣（condyloma acuminatum，CA）主要發(fā)生于生殖器部位的表皮，具有相當(dāng)高的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率。皮膚經(jīng)過(guò)摩擦和揉搓后表面的角質(zhì)層會(huì)出現(xiàn)微裂痕，HPV病毒顆粒經(jīng)過(guò)表皮的微裂痕侵染正常的組織，最終定居在真皮的層棘和基底層[1]，在此復(fù)制繁衍并改變了正常皮膚組織的結(jié)構(gòu)，感染的皮膚病灶離散型分布，有的能融合成一個(gè)整體形成一個(gè)區(qū)域。在做醋酸白檢驗(yàn)時(shí)，病變的區(qū)域太過(guò)于小，由于局部的組織的角質(zhì)層吸光能力不明顯，變色不明顯。因此感染初期和沒(méi)有明顯的疣體生長(zhǎng)出來(lái)時(shí)的HPV病變是不能通過(guò)手術(shù)清除。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)化，HPV病毒可以已經(jīng)進(jìn)化出免疫逃逸機(jī)制，使得病毒得以在人體生存[2]。經(jīng)過(guò)HPV-DNA-PCR檢驗(yàn)陽(yáng)性的患者，未發(fā)現(xiàn)疣體就可以認(rèn)為處于亞臨床階段。利用HPV 感染過(guò)的表皮角蛋白結(jié)構(gòu)與正常相關(guān)性蛋白表達(dá)之間的對(duì)于特定小分子化學(xué)物質(zhì)的吸收特性的差異，為治療和藥物的研發(fā)提供了一種新的途徑。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年3月～2015年2月在我院門(mén)診就診的患者31例，所有患者均為人乳頭瘤病毒第一次發(fā)病患者?；颊吣苊鞔_提供從發(fā)現(xiàn)肉瘤生長(zhǎng)之前能回溯追查有野游史的病例。到我院就診前沒(méi)有經(jīng)過(guò)其他的治療。選取外觀(guān)形態(tài)能確定為典型尖銳濕疣的病例?；颊邲](méi)有皮損和其他明顯的皮膚病變。排除患者為過(guò)敏性體質(zhì)?；颊叩哪挲g不限。研究對(duì)象均為男性。疣體生長(zhǎng)的部位選在生長(zhǎng)在陰莖上，肛門(mén)周?chē)∽兊幕颊?。患者?jīng)過(guò)離子刀行外科手術(shù)治療。大約經(jīng)過(guò)一周至半個(gè)月，創(chuàng)口愈合后。收集皮膚表面脫落皮屑做HPV-DNA-PCR檢驗(yàn)仍為陽(yáng)性的患者。確定為有亞臨床感染繼續(xù)存在。

1.2 藥物配置

藥物為自行配置，藥物的主要成分為乙酸、乙酸鈉（別名醋酸鈉，本實(shí)驗(yàn)中因?yàn)樾枰么姿岚追磻?yīng)的機(jī)理，考慮到研究的需要統(tǒng)一用乙酸鈉標(biāo)注）、甘油（1，2，3-三羥基丙醇）、過(guò)氧碳酰胺。以上藥物的純度均為分析純藥物試劑，嚴(yán)格把關(guān)確保嚴(yán)格進(jìn)行無(wú)菌操作。

1.3 方法

1.3.1 患者確定為亞臨床患者標(biāo)準(zhǔn)和方法 選取門(mén)診就診的在外陰部肉眼明顯識(shí)別能確定為乳頭瘤病毒感染的男性患者，年齡21～69歲。排除有皮膚過(guò)敏和其他皮膚病的患者作為施治對(duì)象。對(duì)外陰皮膚表面有疣體生長(zhǎng)的局部皮膚消毒局麻后，把疣體切除。囑咐患者自行用碘伏消毒外陰皮膚表面每天一次。連續(xù)用大約十天左右。待皮膚傷口愈合后。用沾有0.9%氯化鈉鹽水的棉棒，在患部的局部皮膚表面擦拭。取到表面脫落細(xì)胞后做HPV-DNA-PCR檢驗(yàn)。檢查結(jié)果為陽(yáng)性的患者可以認(rèn)為為亞臨床感染患者。

1.3.2 患者局部皮膚表面的處理 用無(wú)菌用水清洗干凈外陰部。用75%的酒精棉球擦拭干凈，晾干。

1.3.3 藥物的配制 用甘油作溶劑配制5%的過(guò)氧碳酰胺溶液，加入少量乙酸鈉，隨后按質(zhì)量比加入36%乙酸溶液，配制成乙酸濃度為3%的溶液，再加入少量的焦磷酸鈉。用攪拌機(jī)攪拌均勻，形成乳化液待用。

1.3.4 藥物的應(yīng)用方法 局部皮膚表面處理好后，用棉棒沾取配置好的溶液，均勻的擦整個(gè)外陰表皮和肛周表皮。以擦拭完后皮膚表面不粘稠為度。涂完后自然晾干不用包覆。每天涂用兩次，早晚各一次。以30天為1個(gè)治療周期?？偣灿涗浫齻€(gè)周期。

1.3.5 試驗(yàn)對(duì)象的用藥方法 根據(jù)皮膚表層細(xì)胞的生長(zhǎng)周期約為28天設(shè)計(jì)用藥周期。以7d為1個(gè)觀(guān)察周期。每周記錄皮損情況。并記錄是否有病理復(fù)發(fā)情況。考慮到自身病毒顆粒的擴(kuò)散情況，在皮膚的第二個(gè)增殖周期是做HPV-DNA-PCR檢查。并記錄檢查的結(jié)果。如果HPV-DNA-PCR為陰性不在作為下一個(gè)治療周期的研究對(duì)象。病例的發(fā)病部位選在陰莖、陰囊、腹股溝和肛周。

1.3.6 效果的記錄和確定的標(biāo)準(zhǔn) 藥物濃度選在3%～8%沒(méi)有明顯的皮損，記錄DNA分型，用藥時(shí)間及皮損出現(xiàn)情況，病情變化。

2 結(jié)果

31例研究對(duì)象在用藥過(guò)程中，第一個(gè)用藥周期內(nèi)部分患者表皮有微癢和灼熱感，主要發(fā)生在陰囊和腹股溝部位。在陰阜區(qū)和陰莖涂藥的皮膚區(qū)域上，皮損表現(xiàn)為變淡白和微紅，輕微的有些水腫。在一個(gè)皮膚增殖周期內(nèi)有約20例復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)的疣體外觀(guān)呈現(xiàn)萎縮狀（如圖1）。說(shuō)明藥物影響到了病理細(xì)胞的增殖。在第一個(gè)皮膚增殖周期中沒(méi)見(jiàn)有疣體長(zhǎng)出皮膚表面。HPV-DNA-PCR 陰性率為35.5%（11/31）。第二個(gè)周期是為74.2%（23/31）。第三個(gè)周期時(shí)為80.6%（25/31）。仍然約有20%的病理查出HPV-DNA陽(yáng)性。但是未見(jiàn)有疣體長(zhǎng)出。在檢驗(yàn)出的DNA分型中其中HPV6型陽(yáng)性率最高，HPV6，HPV11，HPV42，HPV18，HPV52，HPV56這六種DNA分型出現(xiàn)約95%的概率。見(jiàn)表1。

3 討論

人類(lèi)乳頭瘤病毒是一類(lèi)感染表皮和黏膜鱗狀

表1 治療效果及確定的標(biāo)準(zhǔn)

HPV分型 用藥周期

（d） 皮損癥狀出現(xiàn) 皮損體征 治療期間復(fù)發(fā)和中斷用藥 最終PCR結(jié)果

6，11，16，18，42，52，56 1～7 感覺(jué)微癢，灼熱感 皮膚淡白嬌嫩 復(fù)發(fā)13例。疣體生長(zhǎng)不旺盛 不做PCR考核周期

8～14 未見(jiàn)明顯皮損 皮膚淡白嬌嫩 復(fù)發(fā)6例。疣體生長(zhǎng)不旺盛 不做PCR考核周期

15～30 未見(jiàn)明顯皮損 皮膚淡白嬌嫩 復(fù)發(fā)1例。疣體明顯萎縮狀增生 不做PCR考核周期

31～50 未見(jiàn)明顯皮損 皮膚呈淡紅色 肉眼未見(jiàn)疣體生長(zhǎng) HPV-DNA-PCR 陽(yáng)20例，陰11例

18，42 ，52 50～70 未見(jiàn)明顯皮損 皮膚呈淡紅色 肉眼未見(jiàn)疣體生長(zhǎng) HPV-DNA-PCR 陽(yáng)8例，陰12例

18，52 70～90 未見(jiàn)明顯皮損 皮膚呈淡紅色 肉眼未見(jiàn)疣體生長(zhǎng) HPV-DNA-PCR 陽(yáng)6例，陰2例

a

b

圖1 復(fù)發(fā)的疣體外觀(guān)

上皮的小DNA病毒，具有高度種屬特異性和特殊嗜上皮性[3-4]。表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和黏膜鱗狀上皮細(xì)胞的是其天然宿主[5]。人表皮的角質(zhì)層位于表皮的最外層，由10～20層扁平的角化細(xì)胞組成[6]，無(wú)細(xì)胞核或者其他細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，只殘余有角蛋白絲和基質(zhì)。角質(zhì)層細(xì)胞內(nèi)含有直徑約為6～8nm的a-角蛋白絲及鑲嵌在無(wú)定型基質(zhì)中的纖維蛋白中，新生細(xì)胞向上移動(dòng)產(chǎn)生堅(jiān)韌的纖維角蛋白[7]。表皮層組織每層的蛋白質(zhì)種類(lèi)有差異?；准?xì)胞主要表達(dá)具有增殖特異性角蛋白cK5，cK14，進(jìn)入棘層后分化特異性角蛋白cK1，cK10的表達(dá)不斷增加[8]。角蛋白相關(guān)蛋白filaggrin的表達(dá)出現(xiàn)于分化特異性角蛋白cK1，cK10表達(dá)之后，主要位于顆粒層細(xì)胞中，它與cK1，cK10均為角質(zhì)形成細(xì)胞分化的標(biāo)志[9]。cK16在正常表皮中不表達(dá)，是角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖的標(biāo)志[10]。病毒進(jìn)入細(xì)胞后，僅在一定分化程度的上皮細(xì)胞內(nèi)增殖，感染表皮細(xì)胞中有增殖能力的基底細(xì)胞，并嚴(yán)格跟隨角質(zhì)形成細(xì)胞的角化過(guò)程而分化成熟。在被感染的角質(zhì)形成細(xì)胞中進(jìn)行病毒早期和晚期基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，組裝形成病毒顆粒。被HPV感染的病理組織中角蛋白cK10的表達(dá)缺失[11]，和正常的皮膚組織相對(duì)比cK14 在顆粒層中仍有較強(qiáng)的表達(dá)并且分布不均勻，提示病理細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的功能受到了影響[8]。角質(zhì)層增厚角化不全細(xì)胞有輕度異型性棘層細(xì)胞明顯增生，上皮釘突增厚延長(zhǎng)在上皮層中上部可見(jiàn)多少不等的散在或成群的挖空細(xì)胞，核大而且大小不等.可見(jiàn)雙核[11]。在生殖器和肛周以 HPV6、11、16、18為常見(jiàn)[12]。HPV16、18、31、33、35-39、45、51-52、56、58?？蓪?dǎo)致皮膚癌變[13-15]。endprint

乳頭瘤病毒感染皮膚后破壞了皮膚的完整性，亞臨床階段的感染，難以準(zhǔn)確的定位，不能通過(guò)外科手術(shù)的辦法清除。被感染的表皮細(xì)胞，細(xì)胞器架構(gòu)被破壞，細(xì)胞間質(zhì)橋聯(lián)角蛋白變性。角蛋白的組分和三維螺旋折疊結(jié)構(gòu)與正常表皮的角蛋白明顯不同。極性小分子物質(zhì)滲入表皮后，藥物滲入的劑量和速度的差異，表皮可見(jiàn)光譜吸收不均勻有顯色反應(yīng)。本研究依據(jù)這一機(jī)制合成強(qiáng)滲透性和生物學(xué)毒性的藥物過(guò)氧二酰胺，在配制成乙酸甘油溶液。乙酸浸潤(rùn)皮膚后，過(guò)氧二酰胺潤(rùn)脹病變組織。過(guò)氧基裂解被感染區(qū)域的角蛋白和病變細(xì)胞器。滅活病毒微粒和被感染的真皮層細(xì)胞，阻止了潛伏期病毒的復(fù)制傳染。

本研究方法采用裂解法治療，本身患病皮膚缺失有效組織成分的表皮發(fā)生了錯(cuò)構(gòu)弱化了正常表皮的屏障作用，使得帶電的小分子化學(xué)物質(zhì)有了進(jìn)入深層組織的通道。由于大量負(fù)電荷引起強(qiáng)烈的分子推斥力導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的溶脹和裂解，部分埋藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的羧基、酚羥基和巰基離子化，這些離子化基團(tuán)趨向于將自己暴露在水環(huán)境中，因此造成角蛋白多肽鏈的散開(kāi)[16]。過(guò)氧乙酸滲入角蛋白分子內(nèi)部，打開(kāi)角蛋白二硫鍵和氫鍵的作用力增大，拆分的分子增多，滲入病變組織中的藥物就會(huì)提高，同樣帶有細(xì)胞毒性的其他帶電小分子也可以進(jìn)入，用過(guò)氧碳酰胺和乙酸分子協(xié)同應(yīng)用時(shí)藥物可以比正常組織高的多濃度的滲入病變組織中裂解病變的角蛋白，溶膠細(xì)胞間質(zhì)脂質(zhì)膜。同時(shí)還能滅活細(xì)胞器和細(xì)胞核，達(dá)到治療的效果。

綜上，本法治療亞臨床階段人乳頭瘤病毒感染尖銳濕疣患者31例，臨床上治療有效率為100%，轉(zhuǎn)陰率能達(dá)到80%，效果良好，副作用小。

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（收稿日期：2015-06-03）endprint