灰氈毛忍冬對LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞炎癥因子的影響

白仲杰，任群利，俸婷婷，趙 致，周 英，林 冰*

(1.貴州大學(xué)貴州省中藥民族藥創(chuàng)制工程中心，貴州 貴陽 550025;2.貴州省藥食同源植物資源研究開發(fā)中心，貴州 貴陽 550025)

灰氈毛忍冬 Lonicera macranthoides Hand-Mazz.屬于忍冬科忍冬屬常綠藤本植物，《中國藥典》2005年版一部將其作為新收載品種，與紅腺忍冬、華南忍冬一同列入新增的山銀花項下［1-2］。主要含綠原酸、木犀草素等成分，具有清熱解毒、抗菌消炎的功效。被廣泛應(yīng)用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫熱發(fā)病等疾病的治療［3-5］。在2005與2010年版《中國藥典》中，山銀花與金銀花藥用部位、性味歸經(jīng)、功能主治和用法用量都完全一致。

炎癥反應(yīng)作為眾多疾病的一個早期反應(yīng)，在疾病的發(fā)生發(fā)展中占有著重要的位置，而巨噬細胞則是調(diào)節(jié)炎性疾病的一個靶細胞，當免疫系統(tǒng)受到自身抗體或者特殊抗原的刺激時，巨噬細胞釋放各種炎癥因子和趨化因子，如白介素(interleukin，IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF- α)、前列腺素 E2(prostaglandin E2，PGE2)等［6］，引起細胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡失調(diào)，在炎癥過程中起著重要的作用。目前關(guān)于山銀花對炎癥因子的調(diào)控作用的研究較少。本實驗通過脂多糖(LPS)刺激RAW264.7小鼠巨噬細胞系建立炎癥細胞模型，測定灰氈毛忍冬不同極性萃取部位對該炎癥模型細胞中炎癥因子分泌量的影響，從細胞水平研究灰氈毛忍冬抗炎活性，為研究灰氈毛忍冬的抗炎活性及其作用機制提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 細胞

RAW264.7細胞系購自中國科學(xué)院昆明動物研究所細胞庫。

1.2 試劑與藥材

供試藥材灰氈毛忍冬來自于貴州，經(jīng)鑒定為忍冬科忍冬屬灰氈毛忍冬的花。а-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)、PBS、L- 谷氨酰胺、二甲基亞砜(DMSO)、脂多糖(LPS)、ELISA試劑盒(sigma)、地塞米松(sigma)。

1.3 儀器

高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司，1260);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器公司，RE-52AA);真空干燥箱(BZF-50 VACUUM OVEN);電子天平(FA1004);循環(huán)水式多用真空泵(GZX-9146MBE);低速大容量離心機(Heal Force Neofμge23R);CO2培養(yǎng)箱(3111，Thermo Fisher Scientific)，倒置熒光顯微鏡(XD20-RFL，寧波舜宇儀器有限公司)，超凈工作臺(SW-CJ-1FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司);酶標儀(1510，Thermo Fisher Scientific)。

2 方法

2.1 灰氈毛忍冬不同極性萃取部位的制備

取灰氈毛忍冬過2號篩粉末20 g，按1∶10的料液比加入200 mL 75%甲醇回流提取兩次，每次2 h，過濾后合并濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮成浸膏狀。然后加入200 mL蒸餾水溶解制成混懸液，依次加入100 mL石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和的正丁醇萃取，連續(xù)萃取2次，萃取剩余部分為水部分，回收各部位萃取溶劑于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，再于真空干燥箱內(nèi)烘干。最終依照極性大小順序得到水、水飽和的正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚等5個萃取部位樣品粉末。將5個萃取部位樣品粉末用DMSO溶解后，于實驗前用а-MEM培養(yǎng)液分別配制成濃度為100、200、400 μg/mL的樣品溶液。

2.2 RAW 264.7細胞培養(yǎng)

小鼠單核巨噬細胞系 RAW 264.7細胞在37℃、5%CO2條件下，用含10%胎牛血清的 α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，2天換一次培養(yǎng)基，至對數(shù)生長期備用。

2.3 不同極性萃取部位對RAW 264.7細胞活性的影響

采用MTT法檢測不同極性萃取部位對RAW264.7細胞活性的影響。待RAW264.7細胞生長至對數(shù)期后，加1 mL 0.25%胰酶消化40 s，再加入3 mLα-MEM培養(yǎng)基吹打消化，調(diào)整細胞密度為8×105mL-1，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔定容 100 μL。于37℃、5%CO2條件培養(yǎng)4 h 后，每孔加100 μL配制好的濃度分別為100、200和400 μg/mL的五個萃取部位的樣品溶液，同時設(shè)立正常組(只加細胞和培養(yǎng)基)、LPS組(加入LPS刺激)和調(diào)零孔(不加細胞，只加培養(yǎng)基)，每組設(shè)3個復(fù)孔，同時每孔加100 μL濃度為 10 μg/mL的LPS刺激，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h加入20 μL濃度為5 mg/mL MTT溶液，37℃培養(yǎng)4 h后，小心吸取上清液，加入150 μL的DMSO，充分震蕩使結(jié)晶溶解后，于570 nm下測各孔的OD值，并計算細胞相對增殖率［7］。

細胞相對增殖率(%)=(實驗孔-調(diào)零孔)/(對照孔-調(diào)零孔)×100%

2.4 ELISA法檢測不同極性萃取部位對IL-6和TNF-α的抑制作用

待RAW264.7細胞生長至對數(shù)期后，加1 mL 0.25%胰酶消化40 s，再加入3 mL α-MEM培養(yǎng)基吹打消化，調(diào)整細胞密度為8×105mL-1，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔定容100 μL。于37℃、5%CO2條件培養(yǎng)4 h后，每孔加100 μL配制好的濃度分別為100、200和400 μg/mL的五個萃取部位的樣品溶液，同時設(shè)立正常組、LPS組、地塞米松組(20 μg/mL)和調(diào)零孔，每組設(shè)3個復(fù)孔，同時每孔加100 μL濃度為10 μg/mL的 LPS刺激，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測IL-6和TNF-α的表達量。

3 結(jié)果

3.1 不同極性萃取部位對RAW264.7細胞活性的影響

五個萃取部位對RAW264.7細胞相對增殖率的影響見表1。細胞毒性分級［8］見表2。

表1 五個極性萃取部位對RAW264.7細胞相對增殖率的影響(x- ± s，n=3)Tab.1 The effect of concentrations of five extraction parts with different polarities on the RGR of RAW264.7 cell(x-±s，n=3)

表2 細胞相對增殖率和細胞毒性分級Tab.2 Relative cell proliferation rate and cell toxicity grading

表3 五個極性萃取部位對RAW264.7細胞毒性分級Tab.3 Five polar extraction parts on the toxicity grading of RAW264.7 cell

由表1、2、3可知，五個萃取部位不同濃度(100、200、400 μg/mL)作用 RAW 264.7 細胞72 h，與正常組比較，水部位和水飽和正丁醇部位(200、400 μg/mL)對細胞的活力有一定的抑制，其細胞毒性分級為1，并且有濃度依賴性。而水飽和正丁醇部位(100 μg/mL)和其它組在此濃度下對細胞活力無抑制作用。說明在大的極性萃取部位，所含的多種化學(xué)成分對于RAW264.7細胞有相對較大的抑制作用。

3.2 IL-6標準曲線的建立

IL-6標準曲線繪制結(jié)果見圖1。

圖1 IL-6標準曲線Fig.1 IL-6 standard curve

由圖1可知，OD值在IL-6濃度為15 ng/L到480 ng/L范圍之間的線性關(guān)系良好，回歸方程為y=285.71x-51.26，相關(guān)系數(shù)R2=0.993 8。

3.3 TNF-α標準曲線的建立

TNF-α標準曲線繪制結(jié)果見圖2。

圖2 TNF-α標準曲線Fig.2 TNF-αstandard curve

由圖2可知，OD值在TNF-α濃度為20 ng/L到640 ng/L范圍之間的線性關(guān)系良好，回歸方程為y=357.14x-66.86，相關(guān)系數(shù)R2=0.993 3。

3.4 不同極性萃取部位對IL-6和TNF-α的表達量的影響結(jié)果

五個部位、三個樣品濃度對RAW264.7細胞炎癥模型中IL-6和TNF-α的表達量的測定結(jié)果見表4和表5。表中IL-6和TNF-α的表達量用±s(ng/L)表示，組間的顯著性差異用one-way ANOVA顯著性分析。

表4 五個極性萃取部位不同樣品濃度對IL-6表達量的影響(x- ± s，n=3)Tab.4 The effect of concentrations of five polar extraction parts on the expression of IL-6(x- ± s，n=3)

由表4可知，LPS對照組IL-6的表達量極顯著性高于正常組的表達量，P＜0.01;同時與LPS對照組IL-6表達量199.94 μg/mL相比，地塞米松組IL-6 表達量為137.88 μg/mL，P ＜0.01，說明地塞米松對IL-6表達量有極顯著地抑制作用;各個萃取部位中，除了石油醚部位(100 μg/mL)對IL-6表達量沒有顯著性的抑制作用外，石油醚部位(200 μg/mL)對IL-6表達量有顯著性的抑制作用，P＜0.05;其它各個部位對IL-6表達量均有極顯著地抑制作用，P＜0.01，并且其抑制作用都有濃度依賴性。相比較而言，其中以乙酸乙酯部位和二氯甲烷部位對IL-6表達量的抑制作用最為明顯。

由表5可知，LPS對照組TNF-α的表達量極顯著性高于正常組的表達量，P＜0.01;同時與LPS對照組TNF-α表達量200.96 μg/mL相比，地塞米松組 TNF-α表達量156.98 μg/mL，P＜0.01，說明地塞米松對TNF-α表達量有極顯著地抑制作用;各個萃取部位中，除了水部位(100 μg/mL)對TNF-α表達量沒有顯著性的抑制作用外，其它各個部位對IL-6表達量均有極顯著地抑制作用，P＜0.01，并且其抑制作用都有濃度依賴性。相比較而言，其中以水飽和正丁醇部位和乙酸乙酯部位對TNF-α表達量的抑制作用最為明顯。

表5 五個極性萃取部位不同樣品濃度對TNF-α表達量的影響(x- ± s，n=3)Tab.5 The effect of concentrations of five polar extraction parts on the expression of TNF-α(x-±s，n=3)

4 討論

4.1 RAW264.7細胞作為一種巨噬細胞，受到脂多糖外界刺激后能夠啟動體內(nèi)炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，并啟動機體抵抗炎癥系統(tǒng)的功能［9］。RAW264.7細胞在受到LPS刺激后，通過脂多糖結(jié)合蛋白 CD14受體和Toll樣受體4等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活轉(zhuǎn)錄因子細胞核因子κB(NF-κB)和活化蛋白-1，引起各種細胞因子和炎癥介質(zhì)的過度表達，觸發(fā)機體內(nèi)的炎癥瀑布連鎖反應(yīng)，進一步引起全身炎癥反應(yīng)綜合征［10］。

4.2 本實驗選擇RAW264.7細胞作為研究對象，采用LPS刺激，建立炎癥模型以研究灰氈毛忍冬各個極性萃取部位對炎癥因子的調(diào)控。經(jīng)LPS刺激后，炎癥因子IL-6和TNF-α的表達量明顯上調(diào)，表明此炎癥細胞模型成功構(gòu)建。在應(yīng)用灰氈毛忍冬各個極性萃取部位后，可以劑量依賴性的抑制炎癥因子IL-6和TNF-α的表達，說明灰氈毛忍冬各個極性萃取部位均可通過抑制炎癥因子參與炎癥反應(yīng)的過程。

4.3 在此次實驗之前，本課題組對NO的表達也進行了研究，發(fā)現(xiàn)灰氈毛忍冬各個極性萃取部位對NO的表達有明顯的劑量依賴性和萃取部位的極性依賴性。表明灰氈毛忍冬各個極性萃取部位可以通過調(diào)控炎癥因子NO、IL-6和TNF-α的表達而參與炎癥反應(yīng)的過程。已知在巨噬細胞系統(tǒng)中有眾多的信號通路和炎癥介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)，如通過抑制信號通路 CD14［11］、PKC［12］、NF- κB［13］、AP-1等多層次、多靶點調(diào)控IL-6、TNF-α和IL-β等炎癥介質(zhì)的表達，從而發(fā)揮抗炎作用?；覛置潭泻卸鄠€化學(xué)成分，其抗炎功效的具體有效成分，以及其保護作用是否涉及其他的分子作用機制，還有待繼續(xù)研究。

［1］中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:21.

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