腹腔內(nèi)注射脂多糖對(duì)大鼠黑質(zhì)ROS含量及NADPH酶的影響

白麗娟 姜 新 陳曉虹 任 艷 羅曉光

(1.遼寧省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽(yáng)110016;2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽(yáng)110001)

小膠質(zhì)細(xì)胞被激活后能夠產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，稱(chēng)為氧化應(yīng)激反應(yīng)。大量研究［1-3］表明，氧化應(yīng)激在帕金森病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，而抗炎物質(zhì)能夠抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，具有神經(jīng)保護(hù)作用。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH)酶廣泛表達(dá)于中胚層來(lái)源的細(xì)胞中，如小膠質(zhì)細(xì)胞、粒細(xì)胞和血管細(xì)胞。在外界刺激下，NADPH氧化酶激活，將電子從 NADPH傳遞給氧分子，從而產(chǎn)生ROS。本研究以SD大鼠為研究對(duì)象，觀察了經(jīng)腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)后，大鼠黑質(zhì)NADPH氧化酶的表達(dá)及ROS的產(chǎn)生情況。旨在探討小膠質(zhì)細(xì)胞被激活后的氧化應(yīng)激機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

取健康SD雄性大鼠，共200只，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部門(mén)提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(遼)2013-0001。分別將大鼠分為實(shí)驗(yàn)青年組、老年組，對(duì)照青年組、老年組4組，各組大鼠均為50只;其中，青年組為雄性?xún)稍慢g大鼠(體質(zhì)量250～350 g)，老年組為雄性12月齡(體質(zhì)量450～600 g)。

各組又根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分為5個(gè)亞組，每個(gè)亞組分別為10只SD大鼠，分別于給藥后6 h、12 h、24 h、48 h及1周時(shí)處死。各組中有25只檢測(cè)ROS產(chǎn)生情況，另外25只檢測(cè)NADPH酶在胞質(zhì)蛋白和膜蛋白的表達(dá)情況。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)組均給予腹腔注射LPS 1 mg/kg，對(duì)照組均給予腹腔注射0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液1 mg/kg，各組大鼠分別于給藥后 6 h、12 h、24 h、48 h 及 1周時(shí)快速斷頭取腦黑質(zhì)。DCFH-DA探針檢測(cè)各組大鼠ROS產(chǎn)生情況。采用Western blotting法檢測(cè)各組大鼠NADPH酶情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行析因方差分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠活性氧(ROS)產(chǎn)生情況

老年組與青年組相比，各時(shí)間點(diǎn)老年組ROS含量相對(duì)較高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);對(duì)照老年組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照老年組6 h相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);對(duì)照青年組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照青年組6 h相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。但實(shí)驗(yàn)老年組、實(shí)驗(yàn)青年組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與各自實(shí)驗(yàn)老年組、實(shí)驗(yàn)青年組6 h相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ROS在12 h達(dá)到最高，之后并逐漸下降;實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1，圖1)。

表1 各組大鼠ROS的量Tab.1 ROS content of the rats in each group n=5

圖1 各組ROS的量Fig.1 ROS content in each group

2.2 檢測(cè)各組大鼠NADPH酶表達(dá)情況

2.2.1 各組大鼠胞質(zhì)中NADPH酶表達(dá)情況

實(shí)驗(yàn)老年組及實(shí)驗(yàn)青年組在腹腔注射LPS 12 h均可見(jiàn)胞質(zhì)中NADPH酶表達(dá)增多，達(dá)高峰，之后隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少;而對(duì)照組胞質(zhì)中NADPH酶表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)明顯變化(圖2)。

2.2.2 各組大鼠胞膜上NADPH酶表達(dá)情況

實(shí)驗(yàn)老年組及實(shí)驗(yàn)青年組在腹腔注射LPS 12 h均可見(jiàn)胞膜上有NADPH少量表達(dá)，而對(duì)照組未見(jiàn)胞膜上有NADPH酶的表達(dá)(圖3)。

圖2 各組胞質(zhì)中NADPH酶表達(dá)情況Fig.2 Expression of NADPH oxidase in cytoplesm

3 討論

機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生活性氧的途徑很多，其中包括線(xiàn)粒體呼吸鏈和促氧化酶類(lèi)。已知激活的小膠質(zhì)細(xì)胞能生成大量的活性自由基(包括活性氧、活性氮)，參與氧化應(yīng)激反應(yīng)［4］。NADPH氧化酶是小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生ROS的主要介質(zhì)，其活性變化對(duì)局部組織器官乃至全身活性氧水平的高低具有重要影響。已有研究發(fā)現(xiàn)在LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞活化后，它通過(guò)激活NADPH氧化酶產(chǎn)生大量ROS。

NADPH酶廣泛表達(dá)于中胚層來(lái)源的細(xì)胞系中，如小膠質(zhì)細(xì)胞、粒細(xì)胞和血管細(xì)胞。它由多個(gè)亞基組成，包括位于胞膜的b558(gp91phox和p22phox)和胞質(zhì)亞單位 p47phox、p67phox、p40phox和 GTPase。在外界的刺激下，其胞質(zhì)中的亞基(主要是p47phox)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上，與位于膜上的亞單位 b558結(jié)合，NADPH氧化酶激活，催化電子從NADPH傳遞到氧分子，同時(shí)產(chǎn)生 ROS［5］。

圖3 各組胞膜上NADPH酶表達(dá)情況Fig.3 Expression of NADPH oxidase in membrane

中腦黑質(zhì)是腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞密度最高的區(qū)域，同時(shí)在DA合成過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的對(duì)神經(jīng)元有毒性的易受氧化的DA代謝物，加之多巴胺能神經(jīng)元的抗氧化能力低，因此，黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元對(duì)氧化應(yīng)激尤為敏感［6］。研究［7］發(fā)現(xiàn)，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中NADPH酶產(chǎn)生的氧化自由基可能是導(dǎo)致DA能神經(jīng)元變性壞死的“重犯”。已有研究［8］提出PHOX-ROS通路參與了LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。胞質(zhì)亞單位p47phox是NADPH氧化酶最重要的調(diào)節(jié)亞基，它在NADPH酶釋放過(guò)氧化物粒子中起關(guān)鍵作用［9-12］，p47phox在胞膜上的表達(dá)水平是提示PHOX活性的重要指征［13-14］。

本實(shí)驗(yàn)中，腹腔注射LPS 12 h，大鼠黑質(zhì)內(nèi)ROS活性達(dá)到高峰，但老年組與青年組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示LPS刺激后(12 h)無(wú)論在老年組與青年組均有小膠質(zhì)細(xì)胞活化，即發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)。并且，腹腔注射LPS 12 h，老年組及青年組NADPH酶表達(dá)均增加，達(dá)到高峰，此后逐漸下降，但兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而在12 h之后亦可見(jiàn)老年組及青年組NADPH酶由胞質(zhì)向細(xì)胞膜移位，這提示LPS刺激后(12 h)，無(wú)論在老年組與青年組氧化應(yīng)激反應(yīng)均可能是通過(guò)激活NADPH氧化酶途徑而發(fā)生的。

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