同步輻射X線相襯成像技術(shù)在兔髕骨-髕腱連接點(diǎn)纖維軟骨細(xì)胞的三維可視化應(yīng)用研究

陳華斌 胡建中 周京泳 鄭 成,3 王占穩(wěn) 陳 燦 曹 勇 殷憲振 呂紅斌

1（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科 中南大學(xué)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究中心 長(zhǎng)沙 410008）2（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院脊柱外科 長(zhǎng)沙 410008）3（武漢體育學(xué)院醫(yī)院 武漢 430079）4（中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所 藥物釋放系統(tǒng)研究中心 上海 201203）

同步輻射X線相襯成像技術(shù)在兔髕骨-髕腱連接點(diǎn)纖維軟骨細(xì)胞的三維可視化應(yīng)用研究

陳華斌1胡建中2周京泳1鄭 成1,3王占穩(wěn)1陳 燦1曹 勇2殷憲振4呂紅斌1

1（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科 中南大學(xué)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究中心 長(zhǎng)沙 410008）2（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院脊柱外科 長(zhǎng)沙 410008）
3（武漢體育學(xué)院醫(yī)院 武漢 430079）4（中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所 藥物釋放系統(tǒng)研究中心 上海 201203）

利用同步輻射X射線相襯成像技術(shù)(Synchrotron Radiation-based X-ray Phase-contrast Computed Tomography, SR-XPCT)對(duì)兔髕骨-髕腱連接點(diǎn)(Patella-Patellar Tendon Junction, PPTJ)移行區(qū)的纖維軟骨細(xì)胞進(jìn)行三維可視化及量化表征。正常骨成熟的新西蘭PPTJ經(jīng)多聚甲醛固定、梯度酒精脫水后，于上海光源X射線成像與生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用光束線站進(jìn)行掃描；采集的原始圖像經(jīng)數(shù)字減影、相位恢復(fù)、切片重構(gòu)、位數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行三維重構(gòu)分析；標(biāo)本掃描后進(jìn)行傳統(tǒng)組織學(xué)驗(yàn)證。SR-XPCT能成功獲取PPTJ及其移行區(qū)纖維軟骨細(xì)胞的三維高清圖像，并對(duì)移行區(qū)纖維軟骨細(xì)胞進(jìn)行了量化表征：平均直徑為(10.139±1.265) μm；平均體積為(291.187±87.283)μm3，體積分布在200?400 μm3之間的占75.4%；平均球形度為0.711±0.079，球形度在0.605?0.805之間的纖維軟骨細(xì)胞約占84.9%。SR-XPCT作為一種先進(jìn)的、直觀準(zhǔn)確的可視化骨腱連接點(diǎn)的三維微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)研究方法，為骨腱連接點(diǎn)損傷修復(fù)的三維形態(tài)學(xué)研究提供了新方法、新思路。

同步輻射，相位襯度成像，骨腱連接點(diǎn)，纖維軟骨細(xì)胞，三維

骨腱連接點(diǎn)是肌腱、韌帶等與骨相接合的部位，具有復(fù)雜的梯度解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，如兔髕骨-髕腱連接點(diǎn)(Patella-Patellar Tendon Junction, PPTJ)由髕骨、鈣化的纖維軟骨層、未鈣化纖維軟骨層和髕腱典型的4層結(jié)構(gòu)構(gòu)成[1]。這種獨(dú)特的組織結(jié)構(gòu)依靠纖維軟骨層使骨與腱很好地錨定在一起，從而分散骨與腱之間的應(yīng)力負(fù)荷，有利于骨與腱之間力學(xué)負(fù)荷的傳導(dǎo)，從而維持骨肌系統(tǒng)聯(lián)動(dòng)過程中的穩(wěn)定和平衡[2]。當(dāng)骨腱連接點(diǎn)損傷時(shí)，移行區(qū)纖維軟骨層被破壞，由于該部位血供差，再生能力弱，使得骨腱連接點(diǎn)的損傷修復(fù)十分緩慢而困難[1,3?4]。有研究顯示，前交叉韌帶重建術(shù)后兩年仍未見移植腱與骨隧道界面很好的融合在一起[5]，而肩袖修補(bǔ)術(shù)的失敗率則高達(dá)20%?94%不等[6?7]。

骨腱連接點(diǎn)損傷后的愈合是三維形態(tài)的，組織形態(tài)學(xué)方法是評(píng)估骨腱連接點(diǎn)損傷修復(fù)有效直觀的研究手段。傳統(tǒng)組織形態(tài)學(xué)研究方法借助組織學(xué)切片染色技術(shù)從二維角度來觀察組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，無法提供其內(nèi)部三維特征，并且在切片過程中會(huì)伴隨著組織結(jié)構(gòu)的損失。對(duì)此，迫切需要一種既能實(shí)現(xiàn)樣本無損觀察，又能清晰呈現(xiàn)樣本三維形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究手段。

自1895年德國(guó)科學(xué)家倫琴首次發(fā)現(xiàn)X射線[8]以來，X射線隨即被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷及醫(yī)學(xué)研究。然而，以記錄吸收襯度為主的傳統(tǒng)X射線成像方法因其空間分辨率低、對(duì)X射線弱吸收的物體成像質(zhì)量不佳等缺點(diǎn)，已遠(yuǎn)不能滿足研究學(xué)者們愈來愈高的成像需求?；诘谌捷椛涔庠吹腦射線相襯CT成像(Synchrotron Radiation-based X-ray Phase-contrast Computed Tomography, SR-XPCT)技術(shù)利用X射線透過樣品后攜帶的相位變化信息對(duì)樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行無損成像，是近年來國(guó)內(nèi)外用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一種新的成像技術(shù)。它可獲得X射線弱吸收樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)的二維或三維圖像，是研究X射線弱吸收樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)的強(qiáng)有力的工具[9?10]。

上海同步輻射光源作為我國(guó)首臺(tái)第三代中能同步輻射裝置，得益于其高亮度、高光子通量、高準(zhǔn)直性、高極化性、高相干性及寬頻譜范圍的特性，同時(shí)結(jié)合高分辨率的X射線成像CCD (Charge Coupled Device) 探測(cè)器，SR-XPCT技術(shù)突破了傳統(tǒng)X射線吸收成像的瓶頸，成為迄今為止探測(cè)輕元素材料或生物組織的微米級(jí)甚至亞微米級(jí)結(jié)構(gòu)最好的工具[11]，使得對(duì)細(xì)胞水平的成像成為可能[12]，現(xiàn)已成功運(yùn)用于微脈管系統(tǒng)[13?16]、肺細(xì)支氣管[17]、材料[18]以及化石考古[19]等領(lǐng)域的研究中。因此，我們?cè)噲D利用該先進(jìn)技術(shù)來研究PPTJ的三維形態(tài)結(jié)構(gòu)，構(gòu)建一種新的骨腱連接點(diǎn)三維微觀形態(tài)評(píng)估方法。

1 材料和方法

1.1 樣品準(zhǔn)備

本實(shí)驗(yàn)已獲得中南大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

健康骨成熟的新西蘭兔3只（雌性，(3.0±0.1)kg，中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供）。3%戊巴比妥麻醉過量致死，取右后肢髕骨-髕腱連接點(diǎn)，4%多聚甲醛固定24 h，蒸餾水沖洗2 h，分別置于濃度為75%、85%、95%、100%的酒精中梯度脫水，每個(gè)濃度梯度脫水4 h，自然風(fēng)干，干燥環(huán)境下真空保存。

1.2 同步輻射成像

本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所上海光源(Shanghai Synchrotron Radiation Facility, SSRF) X射線成像與生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用光束線站(BL13W1，圖1)完成。BL13W1提供了能量在8.0?72.5 keV的高相干單色光束，最大光斑尺寸48 mm(H)×5 mm(V)，樣品臺(tái)固定于光源下游34 m處，CCD探頭位于一個(gè)可調(diào)控的導(dǎo)軌上[20]。

圖1 上海光源BL13W1光束線實(shí)驗(yàn)站示意圖Fig.1 Schematic of BL13W1 beamline experimental station at SSRF.

1.2.1 成像參數(shù)

為獲得較高的圖像分辨率和對(duì)比度，設(shè)定光子能量15 keV，樣品距探測(cè)器10 cm，曝光時(shí)間1.0 s。將標(biāo)本切割至滿足掃描視場(chǎng)大小要求（標(biāo)本寬度＜1.3 mm），牢靠固定于連續(xù)旋轉(zhuǎn)的載物臺(tái)中央進(jìn)行0°?180°顯微CT成像，采用16 bit X射線探測(cè)器CCD采集原始投影圖像(Tomo)、背景圖像(Flat)及暗場(chǎng)圖像(Dark)，CCD的分辨率為0.65 μm。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

如圖2所示，原始投影圖像經(jīng)Image-Pro Plus 6.0軟件（National Institutes of Health，美國(guó)）行對(duì)比度調(diào)整、低通濾波、銳化增強(qiáng)和背景減影等優(yōu)化處理，通過PITRE軟件（BL13W1組編寫）使用相位-吸收二重性Paganin算法(Phase-attenuation Duality Paganin Algorithm, PAD-PA)相位恢復(fù)算法[21?22]對(duì)原始投影圖像進(jìn)行相位恢復(fù)處理，再使用濾波反投影算法對(duì)相位恢復(fù)后的投影數(shù)據(jù)進(jìn)行切片重構(gòu)，獲取的16位斷層圖像經(jīng)位數(shù)轉(zhuǎn)換后得到8位的斷層圖像。將8位斷層圖像導(dǎo)入VG Studio Max 2.1（Volume Graphics GmbH，德國(guó)）軟件進(jìn)行三維重構(gòu)分析，獲取PPTJ高清三維形態(tài)結(jié)構(gòu)圖像。通過基于灰度值的閾值分割及賦色渲染，獲得纖維軟骨層軟骨細(xì)胞圖像，測(cè)量其直徑，利用軟件獲取纖維軟骨細(xì)胞的體積和球形度等量化形態(tài)參數(shù)。

圖2 成像及圖像處理過程Fig.2 Scanning and image processing.

1.3 番紅-快綠染色

標(biāo)本掃描完成后，依次置于100%、95%、85%、75%梯度酒精入水（每個(gè)梯度2 h）。置于20% EDTA液脫鈣中脫鈣兩個(gè)月，每三日更換一次脫鈣液。經(jīng)X線檢測(cè)脫鈣完全后行石蠟包埋、切片、番紅-快綠（Sigma，美國(guó)）染色，置于光學(xué)顯微鏡（Olympus CX31，日本）下觀察采圖進(jìn)行組織學(xué)驗(yàn)證。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有定量數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將SR-XPCT技術(shù)獲得的圖像與組織學(xué)圖像對(duì)比證實(shí)，該技術(shù)不僅能實(shí)現(xiàn)PPTJ的三維高清可視化，同時(shí)還能對(duì)其內(nèi)部纖維軟骨細(xì)胞進(jìn)行量化描述。

2.1 投影圖像及斷層圖像

SR-XPCT方式下的成像同時(shí)包含了X射線吸收像和相襯像。在投影圖像上(圖3(a))，髕骨-髕腱連接點(diǎn)標(biāo)本與空氣之間、標(biāo)本內(nèi)部各組織結(jié)構(gòu)之間形成較明顯的襯度信息，骨質(zhì)(圖3(a) ?Ι?)因?qū)射線吸收效應(yīng)明顯而呈現(xiàn)灰黑顏色，髕腱(圖3(a) Ι)為X射線弱吸收組織，成像呈亮白顏色。髕骨區(qū)骨質(zhì)排布緊密，髕骨與髕腱之間的移行區(qū)(圖3(a) ?Ι)可見大量條索狀、串珠樣走形的結(jié)構(gòu)，從髕骨側(cè)到髕腱側(cè)，呈現(xiàn)梯度漸變形態(tài)。

在橫斷層圖上(圖3(b))，髕骨與髕腱分界明顯。髕骨骨質(zhì)區(qū)(圖3(b) ?Ι?)灰度值集中在110?255之間，其內(nèi)散在分布大小、形狀不一的腔隙結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可能為骨髓腔，腔隙內(nèi)軟組織的灰度值在65?100之間；髕腱區(qū)(圖3(b) Ι)灰度值在40?90之間，區(qū)域內(nèi)可見大量腱纖維樣結(jié)構(gòu)分布；髕骨與髕腱之間的移行區(qū)(圖3(b) ?Ι)有近似圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)排布，該結(jié)構(gòu)可能為移行區(qū)纖維軟骨細(xì)胞或軟骨陷窩，將其進(jìn)行放大如圖3(c)所示，結(jié)構(gòu)內(nèi)物質(zhì)灰度值在70?135之間，測(cè)量其直徑為11.315 μm；結(jié)構(gòu)周圍灰度值在100?235之間，提示其周圍軟骨基質(zhì)鈣化程度不一。在移行區(qū)的不同位置隨機(jī)選取10個(gè)單個(gè)的圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)并測(cè)量其直徑，其平均直徑為(10.454±2.104) μm。

圖3 同步輻射X射線投影圖像(a)、圖(a)的黑色方框位置的橫斷層圖(b)和圖(b)中的感興趣區(qū)放大圖(c) Ι：髕腱區(qū)，?Ι：移行區(qū)，?Ι?：髕骨區(qū)Fig.3 (a) X-ray projection image, (b) reconstructed tomography located in the black box of picture (a), (c) magnified image of the ROI in picture (b). Ι: Patellar tendon zone, ?Ι: Transition zone, ?Ι?: Patella zone

2.2 髕骨-髕腱連接點(diǎn)的三維高清圖像

基于灰度值進(jìn)行閾值分割和賦色渲染，獲得兔髕骨-髕腱連接點(diǎn)的三維高清圖像(圖4(a))。圖4(a)中左下角為灰度值較高的髕骨骨質(zhì)區(qū)(圖4(a) IV)，右上角為灰度值較低髕腱區(qū)(圖4(a) I)，纖維軟骨細(xì)胞、骨髓腔軟組織等組織結(jié)構(gòu)位于髕骨區(qū)和髕腱區(qū)之間的移行區(qū)(圖4(a) II、III)，其灰度值也介于髕骨和髕腱之間。

圖4 PPTJ三維可視化圖像(a)、組織學(xué)番紅-快綠染色圖(b)、圖(b)感興趣區(qū)放大圖(c)、圖(a)感興趣區(qū)單獨(dú)提取軟骨細(xì)胞渲染后圖像(d)以及圖(d)感興趣區(qū)放大的軟骨細(xì)胞(e、f) I：髕腱區(qū)，II、III：移行區(qū)，IV：髕骨區(qū)Fig.4 (a) Rendered 3D image of rabbit PPTJ, (b) safranin O/Fast-green staining image, (c) magnified image of the ROI in picture (b), (d) rendered 3D image of extracted chondrocytes in the ROI of picture (a), (e, f) magnified 3D image of the ROI in picture (d). I: Patellar tendon zone, II and III: Transition zone, IV: Patella zone

在PPTJ三維高清圖像中，髕骨顯示區(qū)域(圖4(a) IV)內(nèi)可見大小、形狀各異的空腔結(jié)構(gòu)散在分布，其寬度與組織學(xué)圖像(圖4(b))中的骨髓腔相當(dāng)。球形及橢球形結(jié)構(gòu)密集分布于骨與肌腱之間的移行區(qū)(圖4(a) ?Ι、?Ι?)，經(jīng)測(cè)量得：該區(qū)域的平均厚度為(272.36±1.03) μm。此外，這些球形及橢球形結(jié)構(gòu)大小不一，呈現(xiàn)單顆、成對(duì)、成群及串珠樣排列。再者，這些球形及橢球形結(jié)構(gòu)在圖4(a) ?Ι?所示區(qū)域內(nèi)，直徑大小較在圖4(a) ?Ι所示區(qū)域內(nèi)大。經(jīng)與原位組織學(xué)切片番紅-快綠染色結(jié)果(圖4(b))對(duì)比驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)這些球形及橢球形結(jié)構(gòu)的形態(tài)、大小和排布與組織學(xué)圖片中的纖維軟骨細(xì)胞有一致性。將在移行區(qū)感興趣內(nèi)的纖維軟骨細(xì)胞信息單獨(dú)提取(圖4(d))，可見移行區(qū)纖維軟骨細(xì)胞的三維空間排布形態(tài)，其整體排布方向與組織學(xué)染色結(jié)果(圖4(c))一致；選取其中的纖維軟骨細(xì)胞進(jìn)一步放大，得到單個(gè)(圖4(f))及成對(duì)(圖4(e))的纖維軟骨細(xì)胞的三維形態(tài)。

2.3 量化描述纖維軟骨細(xì)胞的三維微觀形態(tài)

利用軟件測(cè)量工具，可以測(cè)得單個(gè)纖維軟骨細(xì)胞的直徑。如圖5(a)所示，測(cè)得該纖維軟骨細(xì)胞的最短徑L1=9.521 μm，最長(zhǎng)徑L2=11.291 μm，則該細(xì)胞的平均直徑d=1/2(L1+L2)=10.406 μm。在移行區(qū)不同位置隨機(jī)選取20個(gè)單個(gè)纖維軟骨細(xì)胞，測(cè)量每個(gè)細(xì)胞的最長(zhǎng)徑和最短徑，計(jì)算其平均直徑，并將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得兔髕骨髕腱移行區(qū)單個(gè)纖維軟骨細(xì)胞平均直徑為(10.139±1.265) μm。利用軟件獲取移行區(qū)感興趣內(nèi)纖維軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)量化參數(shù)，對(duì)不同體積及球形度的纖維軟骨細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果(圖5(b)、(c))顯示：移行區(qū)纖維軟骨細(xì)胞的平均體積為(291.187±87.283) μm3，有75.4%的纖維軟骨細(xì)胞體積分布在200?400 μm3之間，體積表征高者可能提示軟骨細(xì)胞以二連體、三連體等多連體的形式存在。移行區(qū)軟骨細(xì)胞的平均球形度為0.711±0.079，球形度在0.605?0.805之間的纖維軟骨細(xì)胞約占84.9%，提示大部分纖維軟骨細(xì)胞形態(tài)比較規(guī)則，為近似球形或橢球形。

圖5 纖維軟骨細(xì)胞直徑測(cè)量圖(a)、纖維軟骨細(xì)胞體積(b)和細(xì)胞球形度(c)的頻數(shù)統(tǒng)計(jì)圖Fig.5 Image of diameter measurement (a), frequency statistics figure of the chondrocytes' volume (b) and sphericity (c).

3 討論

骨腱連接點(diǎn)損傷是骨科和運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域十分常見的損傷之一，常發(fā)生于前后交叉韌帶、肩袖、跟腱、髕腱等與骨相連接的部位[23?26]。在美國(guó)，每年有超過10萬例前交叉韌帶損傷[27]和27萬例肩袖損傷[28]需手術(shù)修復(fù)，由于骨腱連接點(diǎn)獨(dú)特的解剖結(jié)構(gòu)，使得其損傷后愈合十分緩慢低效。研究正常骨腱連接點(diǎn)的三維形態(tài)結(jié)構(gòu)有助于我們進(jìn)一步了解骨腱連接點(diǎn)損傷愈合過程中纖維軟骨細(xì)胞等微觀結(jié)構(gòu)的三維形態(tài)學(xué)變化，為其生物功能學(xué)研究提供形態(tài)學(xué)理論基礎(chǔ)。

研究骨腱連接點(diǎn)形態(tài)學(xué)的方法有很多，如：蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin, H&E)染色法、番紅-快綠染色法(Safranin O/Fast-green staining)、甲苯胺藍(lán)染色法(Toluidine blue staining)、戈德納三色染色(Goldner's trichrome staining)、偏振光顯微鏡分析(Polarizing microscope analyse)、免疫組織化學(xué)技術(shù)(Immunohistochemistry)等。其中，番紅-快綠是軟骨組織的常用染色方法之一，它能使骨-腱連接點(diǎn)纖維

軟骨層中的蛋白多糖著色呈現(xiàn)橙紅色，從而較好地提示骨腱連接點(diǎn)中纖維軟骨細(xì)胞的排布和蛋白多糖含量[29]。本研究將同步輻射掃描后的樣本脫鈣后原位組織切片行番紅-快綠染色，以驗(yàn)證利用SR-XPCT技術(shù)成像的三維可視化結(jié)果，二者一致。二者不能完全匹配的原因可能是脫鈣、切片、染色過程中樣本細(xì)節(jié)信息的丟失，以及二維的組織學(xué)切片與三維重建圖片在比較過程中存在空間上的不對(duì)應(yīng)。

隨著影像學(xué)和軟件處理技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的新技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用到骨腱連接點(diǎn)的三維形態(tài)研究中。高分辨率外周骨定量CT (High-resolution peripheral quantitative computed tomography, HR-pQCT)能對(duì)肢體末端的骨組織進(jìn)行三維可視化，通過軟件可進(jìn)一步獲取其骨礦化度、骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)目、骨小梁厚度及骨小梁間隙等量化信息，然而其空間分辨率只有80 μm級(jí)[30]。后來發(fā)展起來的微計(jì)算機(jī)斷層掃描(Micro-CT)不僅可通過軟件獲取骨小梁的定量參數(shù)，還將成像分辨率提至10 μm級(jí)[31]，并已廣泛應(yīng)用于骨和骨腱連接點(diǎn)的研究中[32]，但micro-CT也是基于傳統(tǒng)的X射線成像，其對(duì)肌腱等軟組織的成像效果不佳。高分辨核磁共振成像(High-resolution Magnetic Resonance Imaging, HR-MRI)通過記錄檢測(cè)樣本中水分子的氫元素在強(qiáng)磁場(chǎng)中的共振信息來實(shí)現(xiàn)成像[33]，Benjamin等[34]利用磁共振成像UTE脈沖序列實(shí)現(xiàn)了骨腱連接點(diǎn)不同層次結(jié)構(gòu)的成像，這種成像技術(shù)對(duì)骨髓等軟組織能達(dá)到相對(duì)良好的襯度成像效果，然而其分辨率卻遠(yuǎn)未達(dá)到細(xì)胞級(jí)。本研究利用SR-XPCT技術(shù)，結(jié)合高分辨(0.65 μm)的CCD探測(cè)器，利用相關(guān)圖形處理軟件，成功對(duì)骨腱連接點(diǎn)纖維軟骨細(xì)胞進(jìn)行三維可視化及量化表征，將骨腱連接點(diǎn)的研究提升至細(xì)胞級(jí)水平。

本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象PPTJ標(biāo)本，既包括對(duì)X射線有強(qiáng)吸收效應(yīng)的髕骨，也包括髕腱和纖維軟骨等X射線弱吸收組織，傳統(tǒng)的成像技術(shù)難以同時(shí)獲得吸收系數(shù)相差較大的物質(zhì)的高質(zhì)量成像圖像。實(shí)驗(yàn)前期，我們嘗試了在不同能量、不同曝光時(shí)間及不同探測(cè)距離等條件下骨腱連接點(diǎn)成像效果，以期獲得最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)。能量過高、曝光時(shí)間過長(zhǎng)均會(huì)導(dǎo)致成像曝光過度，嚴(yán)重影響后續(xù)的軸心校準(zhǔn)；反之，則導(dǎo)致曝光不足，樣本成像顯像不充分。SR-XPCT技術(shù)的成像既包括相襯成像，也包含有吸收成像，有研究表明，樣品與探測(cè)器之間的距離對(duì)相襯成像質(zhì)量的影響巨大，當(dāng)距離過小時(shí)，成像以吸收像為主，達(dá)不到理想的相襯襯度；隨著距離的增大，相襯信息逐漸變得豐富；當(dāng)距離超過某個(gè)臨界值時(shí)，相襯度反而下降，由于邊緣展寬效應(yīng)而使得成像邊界變得模糊[35]。對(duì)于同時(shí)包含強(qiáng)、弱X射線吸收的骨腱連接點(diǎn)標(biāo)本的成像，我們?cè)趪L試不同成像距離后，反復(fù)比照成像質(zhì)量，認(rèn)為樣本與探測(cè)器距離為10 cm時(shí)，可獲得最佳的相襯成像襯度，從而將骨腱連接點(diǎn)標(biāo)本內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)進(jìn)行高分辨的三維可視化，并將成像直達(dá)細(xì)胞級(jí)，同時(shí)對(duì)移行區(qū)的纖維軟骨細(xì)胞進(jìn)行三維形態(tài)學(xué)量化表征，得到單個(gè)纖維軟骨細(xì)胞的平均直徑，以及移行區(qū)纖維軟骨細(xì)胞的體積分布和球形度分布。

雖然本方法有上述諸多優(yōu)點(diǎn)，但是仍存在著一定的局限性。首先，高耀度、高相干性的同步輻射光源的產(chǎn)生需要一個(gè)龐大的造價(jià)昂貴的設(shè)備，因此這些都極大的限制了普通實(shí)驗(yàn)室的廣泛應(yīng)用以及在臨床診療中的推廣；其次，本研究采用的是分辨率為0.65 μm CCD探測(cè)器，其視場(chǎng)范圍最大寬度為1.3mm，這給樣本準(zhǔn)備帶來困難，也限制了大樣本的成像需求；再者，掃描過程中水份蒸發(fā)導(dǎo)致樣本組織形變，進(jìn)而影響后續(xù)圖形軸心校準(zhǔn)及三維重建，故本研究采用嚴(yán)格的梯度酒精脫水來消除該組織形變，但也因此不能還原樣本的自然狀態(tài)，該問題將在我們的后續(xù)實(shí)驗(yàn)中探討。隨著影像學(xué)技術(shù)和圖形軟件技術(shù)的不斷發(fā)展，上述問題也將會(huì)得到很好的解決。

4 結(jié)語(yǔ)

同步輻射X射線相襯成像技術(shù)可用于骨腱連接點(diǎn)三維微觀結(jié)構(gòu)的高清成像，并可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)其三維形態(tài)學(xué)量化表征，豐富了骨腱連接點(diǎn)的三維微觀解剖學(xué)認(rèn)識(shí)，為骨腱連接點(diǎn)損傷修復(fù)的三維形態(tài)學(xué)研究提供了新的方法及思路。

致謝 感謝上海光源BL13W1 光束線站提供的科學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)；感謝上海光源肖體喬、彭冠云、付亞楠、杜國(guó)浩、陳榮昌、和友、王玉丹等老師在實(shí)驗(yàn)過程中提供的幫助。

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Three-dimensional visualization of fibrochondrocytes in rabbit patella-patellar tendon junction using synchrotron radiation-based X-ray phase contrast tomography

CHEN Huabin1HU Jianzhong2ZHOU Jingyong1ZHENG Cheng1,3WANG Zhanwen1CHEN Can1CAO Yong2YIN Xianzhen4LYU Hongbin1

1(Department of Sports Medicine and Research Center of Sports Medicine, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China) 2(Department of Spine Surgery, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China)
3(Hospital of Wuhan Sports University, Wuhan 430079, China) 4(Center for Drug Delivery System, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China)

Background: Synchrotron radiation-based X-ray phase-contrast computed tomography (SR-XPCT) is an advanced tool for nondestructive analysis of three dimensional inner microstructure of samples, and plays an important part in the researches such as spinal cord microvasculature and lung bronchium. Purpose: This study was to investigate the three-dimensional morphology of fibrochondrocytes in rabbit patella-patellar tendon junction (PPTJ) using SR-XPCT, and develop an advanced imaging method. Methods: Three PPTJs were harvested from healthy mature female New Zealand rabbits. The specimens were scanned by SR-XPCT at BL13W1 of Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF) in China. The tomographic image was captured by Charge Coupled Device (CCD) detector with a 0.65-μm resolution. The three-dimensional visualization images of PPTJ were reconstructed by VG Studio Max. After that, the specimens were embedded by paraffin for Safranin O/Fast-green staining. Results: High-resolution three-dimensional visualization images of PPTJ and the parameters of the chondrocytes in fibrocartilage zone were successfully obtained via the SR-XPCT. With spherical and ellipsoidal morphologic features and its configuration characteristics in three dimension, the fibrochondrocytes revealed by SR-XPCT were consistent with the results of traditional histological staining. The parameters of chondrocytes showed that the mean diameter of chondrocyte was (10.139±1.265) μm, the mean volume was (291.187±87.283) μm3and 75.4% of the chondrocytes' volume ranged from 200 μm3to 400 μm3, the mean sphericity degree was 0.711±0.079, and 84.9% of chondrocytes' sphericity degree ranged from 0.605 to 0.805. Conclusion: The three-dimensional microstructure of the PPTJ was intuitively, accurately and undistortedly realized by the SR-XPCT, which may act as a novel instrument to access the three-dimensional microstructure changes during the PPTJ healing process.

Synchrotron radiation, Phase contrast imaging, Bone-to-tendon junction, Fibrochondrocytes, Three-dimensional

TL99

10.11889/j.0253-3219.2015.hjs.38.110101

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.8117169、No.84172072)資助

陳華斌，男，1990年出生，2013年畢業(yè)于華中科技大學(xué)，現(xiàn)為碩士研究生，研究方向?yàn)楣请爝B接點(diǎn)的損傷與修復(fù)

呂紅斌，E-mail: hongbinlu@hotmail.com

2015-09-01，

2015-10-14

CLC TL99