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    近年無(wú)錫市奶牛結(jié)核病的流行病學(xué)調(diào)查

    2015-12-02 06:52:43顧舒舒范鋒江蘇省無(wú)錫市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心214000
    中國(guó)畜禽種業(yè) 2015年3期
    關(guān)鍵詞:無(wú)錫市結(jié)核結(jié)核病

    顧舒舒 范鋒(江蘇省無(wú)錫市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 214000)

    近年無(wú)錫市奶牛結(jié)核病的流行病學(xué)調(diào)查

    顧舒舒 范鋒(江蘇省無(wú)錫市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 214000)

    結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌引起的一種人畜共患慢性傳染病。牛結(jié)核病主要是由牛分枝桿菌所引起,主要特征為在多種組織器官形成干酪樣壞死、肉芽腫(結(jié)核結(jié)節(jié))和鈣化結(jié)節(jié)病變。該病危害嚴(yán)重,被國(guó)際獸醫(yī)局(OIE)列為B類(lèi)動(dòng)物疫病[1],我國(guó)列為二類(lèi)傳染病。本病可經(jīng)呼吸道、消化道、交配等方式感染。在家畜中,牛最易感染結(jié)核病,尤以奶牛多見(jiàn),其次是水牛和黃牛[2]。近年來(lái),隨著人們生活水平的提高,對(duì)奶制品特別是牛奶需求量的增加,帶動(dòng)了奶牛業(yè)的迅猛發(fā)展,牛結(jié)核病也日益受到了密切關(guān)注。目前江蘇省奶牛結(jié)核病按照現(xiàn)階段國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)計(jì)劃分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)屬二類(lèi)地區(qū),奶牛結(jié)核病不治療,而采取嚴(yán)格的隔離、撲殺患病牛的政策。

    牛結(jié)核病的檢測(cè)方法大體可分為三類(lèi):第一類(lèi)是病原學(xué)檢查法,如涂片染色鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)等,該法是最確實(shí)的方法之一,但由于染色法檢出的細(xì)菌只能說(shuō)明有抗酸桿菌,不能準(zhǔn)確鑒定出結(jié)核分枝桿菌和非典型分支桿菌,因而缺乏特異性[3];而細(xì)菌培養(yǎng)檢出率低,結(jié)核菌生長(zhǎng)緩慢,一般需10~30d才能看到菌落[4],且有10~20%的病例結(jié)核菌培養(yǎng)失敗[5,6],因此,該法在牛結(jié)核菌的臨床診斷中不易推廣。第二類(lèi)是免疫學(xué)方法,如皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、膠體金和ELISA等方法,PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)是目前最常用的奶牛結(jié)核病檢測(cè)方法,我國(guó)普遍采用單純頸部皮試變態(tài)反應(yīng)(SCT)進(jìn)行檢測(cè),歐盟(EU)國(guó)家廣泛使用比較皮試變態(tài)反應(yīng)(CCT)進(jìn)行檢測(cè)[7],而膠體金和ELISA檢測(cè)雖然簡(jiǎn)單易行,但目前實(shí)際價(jià)格昂貴,大規(guī)模實(shí)施的成本過(guò)高。第三類(lèi)是分子生物學(xué)方法,如核酸探針、PCR和DNA圖譜等方法,該法需特殊的儀器設(shè)備,對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件以及操作人員的技術(shù)要求較高,只適用于實(shí)驗(yàn)室研究,不適用于基層的推廣應(yīng)用。有報(bào)道稱(chēng),新型的γ-干擾素(IFN-γ)體外釋放試驗(yàn)相比SCT和CCT而言,能保持較高的靈敏度和較好的特異性[8]。

    于2011~2013年間,對(duì)無(wú)錫市所有存欄的奶牛進(jìn)行了奶牛結(jié)核病的流行病學(xué)調(diào)查,本文旨在為無(wú)錫市奶牛結(jié)核病的診斷和防治提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 儀器

    精密電子天平、高速低溫離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、顯微鏡、微量可調(diào)移液器、超純化水機(jī)、電動(dòng)推毛剪、微量金屬注射器、注射獸用16#針頭、游標(biāo)卡尺、酶標(biāo)儀等。

    1.2 試劑與耗材

    牛型PPD、禽型PPD購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)監(jiān)察所。BOVIGAMTM試劑盒購(gòu)自瑞士Prionics公司。

    1.3 被檢動(dòng)物

    2011~2013年間,無(wú)錫市所有存欄的奶牛,除初生犢牛、懷孕后期母牛及隔離病牛外,其余均為調(diào)查對(duì)象。

    1.4 試驗(yàn)方法

    1.4.1 單純頸部皮試變態(tài)反應(yīng)(SCT)

    參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)(GB/T18645-2002)》,對(duì)無(wú)錫市所有存欄奶牛采用SCT進(jìn)行檢測(cè),使用國(guó)產(chǎn)牛型PPD,劑量為2000U(IU)/頭,分別于注射前和注射后72h測(cè)量皮膚厚度,并計(jì)算出皮厚差,依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果,對(duì)粗篩和二次復(fù)核均為可疑的判定為陽(yáng)性。

    1.4.2 γ-干擾素(IFN-γ)體外釋放試驗(yàn)

    對(duì)所有規(guī)模奶牛場(chǎng)(存欄100頭以上)隨機(jī)挑選部分奶牛,同時(shí)采用IFN-γ釋放試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。奶牛尾靜脈無(wú)菌采血5ml/頭,將采集的血液置于肝素鈉抗凝管中,輕輕顛倒混勻,使肝素鈉溶解。室溫下將血樣運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室,在采血后8h內(nèi)進(jìn)行刺激培養(yǎng)。將全血樣品無(wú)菌分裝至24孔板中,每份血樣分裝3孔,1.5ml/孔。向各孔中分別無(wú)菌加入100μl PBS、禽型PPD、牛型PPD,震蕩混勻1min。將含有血液與抗原的24孔板置于37℃濕溫培養(yǎng)箱中孵育24h。次日從各培養(yǎng)孔吸取500μl血漿上清轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中,即為刺激產(chǎn)生的γ-干擾素上清。以Prionics公司購(gòu)得的試劑盒檢測(cè)牛全血上清液中的γ-干擾素,具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

    結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值≥0.1,且牛型PPD刺激上清的0D值-禽型PPD刺激上清的0D值≥0.1判為陽(yáng)性;牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值<0.1或牛型PPD刺激上清的0D值-禽型PPD刺激上清的0D值<0.1,則判為陰性。

    2 結(jié)果

    2.1 SCT檢測(cè)結(jié)果

    2011~2013年間,對(duì)全市7個(gè)區(qū)、2個(gè)縣的奶牛用SCT檢測(cè)奶牛結(jié)核病發(fā)病情況,共檢測(cè)奶牛25613頭次,其中結(jié)核陽(yáng)性奶牛292頭,結(jié)核陰性奶牛25321頭次,陽(yáng)性率為1.14%;2011年共檢測(cè)奶牛9020頭,其中結(jié)核陽(yáng)性奶牛147頭,結(jié)核陰性奶牛8873頭,陽(yáng)性率為1.63%;2012年共檢測(cè)奶牛8796頭,其中結(jié)核陽(yáng)性奶牛89頭,結(jié)核陰性奶牛8707頭,陽(yáng)性率為1.01%;2013年共檢測(cè)奶牛7797頭,其中結(jié)核陽(yáng)性奶牛56頭,結(jié)核陰性奶牛7741頭,陽(yáng)性率為0.72%。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

    2.2 兩種方法檢測(cè)結(jié)果

    對(duì)其中13個(gè)規(guī)模奶牛場(chǎng),分別采用SCT和IFN-γ體外釋放試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),共計(jì)檢測(cè)奶牛14000頭次。

    SCT檢測(cè)結(jié)果為:結(jié)核陽(yáng)性奶牛105頭,結(jié)核陰性奶牛13895頭次,其中初篩可疑牛15頭次,陽(yáng)性率0.75%,其中2011年檢測(cè)出結(jié)核陽(yáng)性奶牛56頭,結(jié)核陰性奶牛3944頭,陽(yáng)性率1.40%;2012年檢測(cè)出結(jié)核陽(yáng)性奶牛34頭,結(jié)核陰性奶牛4966頭,陽(yáng)性率0.68%;2013年檢測(cè)出結(jié)核陽(yáng)性奶牛15頭,結(jié)核陰性奶牛4985頭,陽(yáng)性率0.30%。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

    IFN-γ體外釋放試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示:ELISA判定陽(yáng)性奶牛72頭,ELISA判定陰性奶牛13928頭次,陽(yáng)性率0.51%,其中2011年檢測(cè)出結(jié)核陽(yáng)性奶牛45頭,結(jié)核陰性奶牛3955頭,陽(yáng)性率1.13%;2012年檢測(cè)出結(jié)核陽(yáng)性奶牛21頭,結(jié)核陰性奶牛4979頭,陽(yáng)性率0.42%;2013年檢測(cè)出結(jié)核陽(yáng)性奶牛6頭,結(jié)核陰性奶牛4994頭,陽(yáng)性率0.12%。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

    3 分析與討論

    3.1 奶牛結(jié)核病的發(fā)病情況

    2011~2013年間,無(wú)錫市奶牛結(jié)核病的陽(yáng)性率呈現(xiàn)逐年降低的趨勢(shì)(見(jiàn)圖1)。結(jié)核病陽(yáng)性率從2011年的1.63%降到2012年的1.01%,同比降低了38.04%,2013年的陽(yáng)性率從2012年的1.01%降至0.72%,同比降低了28.71%,下降幅度逐漸縮小。

    圖1 2011~2013年間無(wú)錫市奶牛結(jié)核病發(fā)病情況

    表1 2011~2013年間無(wú)錫市奶牛結(jié)核病SCT監(jiān)測(cè)結(jié)果

    表2 2011~2013年間無(wú)錫市規(guī)模奶牛場(chǎng)部分奶牛結(jié)核病SCT檢測(cè)結(jié)果

    表3 2011~2013年間規(guī)模奶牛場(chǎng)部分奶牛結(jié)核病IFN-γ體外釋放試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

    通過(guò)對(duì)奶牛結(jié)核病進(jìn)行定期監(jiān)測(cè)和篩查,對(duì)入境奶牛進(jìn)行嚴(yán)格檢疫,及時(shí)淘汰病牛,隔離可疑牛,堅(jiān)持檢疫與淘汰相結(jié)合的原則,三年來(lái),無(wú)錫市奶牛結(jié)核病的發(fā)病率在一定程度上得到了控制。結(jié)核病陽(yáng)性率下降幅度逐漸縮小,可能是由于全市奶牛的飼養(yǎng)量逐年減少,同時(shí)陽(yáng)性牛在每年的篩查中被淘汰,結(jié)核病傳染的風(fēng)險(xiǎn)降低,因此陽(yáng)性率在降低的同時(shí),下降幅度也逐漸縮小。

    3.2 兩種檢測(cè)方法的對(duì)比

    2011~2013年間,采用SCT和IFN-γ體外釋放試驗(yàn)兩種方法,對(duì)13個(gè)規(guī)模奶牛場(chǎng)的檢測(cè)結(jié)果顯示,SCT的陽(yáng)性檢出率明顯高于IFN-γ試驗(yàn),而其陽(yáng)性、陰性符合數(shù)卻低于IFN-γ試驗(yàn),因此IFN-γ試驗(yàn)具有更強(qiáng)的特異性。

    IFN-γ體外釋放試驗(yàn)的陽(yáng)性數(shù)與SCT檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)的比值呈現(xiàn)逐年減小的趨勢(shì)(見(jiàn)圖2),一方面說(shuō)明SCT檢測(cè)法存在較多的假陽(yáng)性,而IFN-γ體外釋放試驗(yàn)很大程度上排除了這些假陽(yáng)性,提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確率;另一方面,由于陽(yáng)性檢出準(zhǔn)確率的提高,陽(yáng)性奶牛被及時(shí)淘汰、撲殺,因此陽(yáng)性奶牛數(shù)逐年減少,陽(yáng)性率呈現(xiàn)逐年下降的趨勢(shì)(見(jiàn)圖3)。

    4 結(jié)論

    2011~2013年間,無(wú)錫市奶牛結(jié)核病的陽(yáng)性率總體呈下降趨勢(shì),通過(guò)堅(jiān)持檢疫與淘汰相結(jié)合的原則,結(jié)核病陽(yáng)性率的下降幅度也逐漸縮小。調(diào)查發(fā)現(xiàn),及時(shí)淘汰、撲殺結(jié)核病陽(yáng)性奶牛,對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格消毒,降低奶牛群的飼養(yǎng)密度,加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,提高奶牛自身免疫力等措施,可以有效降低奶牛結(jié)核病的發(fā)病率。經(jīng)檢測(cè)確診為結(jié)核病陽(yáng)性的奶牛被及時(shí)撲殺,據(jù)統(tǒng)計(jì),三年來(lái)共撲殺奶牛292頭。此次調(diào)查中發(fā)現(xiàn),多數(shù)奶牛結(jié)核病檢測(cè)陽(yáng)性的牛為從外地新購(gòu)入奶牛,在隔離觀(guān)察期內(nèi)未出現(xiàn)明顯癥狀,但SCT和IFN-γ體外釋放試驗(yàn)均檢測(cè)為陽(yáng)性,因此,下一步要加強(qiáng)調(diào)入管理,防止疫病傳入,嚴(yán)格執(zhí)行調(diào)入動(dòng)物審批制度,調(diào)入的奶牛經(jīng)調(diào)出地動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督機(jī)構(gòu)檢測(cè)合格的同時(shí),在調(diào)入本地后要采取嚴(yán)格完善的隔離措施,隔離飼養(yǎng)45d后方可混群飼養(yǎng)。

    通過(guò)對(duì)SCT和IFN-γ體外釋放試驗(yàn)兩種方法連續(xù)三年的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比,IFN-γ試驗(yàn)顯示出了簡(jiǎn)單、快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn),使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為客觀(guān)、可靠,可以有效解決基層動(dòng)物監(jiān)督、疫病防控機(jī)構(gòu)在實(shí)施奶牛結(jié)核病檢疫、隔離、撲殺措施過(guò)程中的一系列問(wèn)題,諸如多次繁瑣的測(cè)量觀(guān)察,大量的人力物力參與、主觀(guān)判定陽(yáng)性實(shí)施撲殺的困難等,因此非常適宜結(jié)核病檢疫和監(jiān)測(cè)技術(shù)的推廣。但是,IFN-γ試驗(yàn)仍存在成本較高等問(wèn)題,且國(guó)內(nèi)目前尚無(wú)正規(guī)批準(zhǔn)試劑盒,但農(nóng)業(yè)部2013年國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃“對(duì)監(jiān)測(cè)陽(yáng)性的動(dòng)物,可用外周血IFN-γ體外釋放檢測(cè)法(按試劑盒說(shuō)明書(shū))進(jìn)行確診”[9]的建議,在本研究的基礎(chǔ)上,將探討采用結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)初篩,初篩陽(yáng)性或疑似的進(jìn)行IFN-γ試驗(yàn)確診的方法。

    圖2 IFN-γ體外釋放試驗(yàn)的陽(yáng)性數(shù)與SCT檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)的比值

    圖3 2011~2013年間無(wú)錫市規(guī)模奶牛場(chǎng)奶牛結(jié)核病的發(fā)病情況

    [1]Wedlock D N,Skinner M A,Lisle G W,et al.Review:Control of Mycobacterium bovis infections and the risk to human populations[J].Microbes Infect,2002,4(4):471-480.

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    [9]農(nóng)業(yè)部關(guān)于印發(fā)《2013年國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃》的通知(農(nóng)醫(yī)發(fā)【2013】9 號(hào)).

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