南海南部海域異養(yǎng)浮游細菌生長對外源營養(yǎng)物的響應*

侯 瑞，白 潔，劉小沙，高會旺，趙陽國

（中國海洋大學海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島 266100）

海洋異養(yǎng)細菌是海洋物質循環(huán)和能量流動中的重要組成部分［1］，是海洋生態(tài)系統(tǒng)有機質的分解者以及重要的二次生產(chǎn)者［2］，在海洋中數(shù)量大、繁殖速度快、轉換效率高，生物量循環(huán)迅速，在海洋生態(tài)環(huán)境中占有重要地位［3］。海洋異養(yǎng)細菌生長也是海洋碳、氮、磷等元素的生物化學過程的重要環(huán)節(jié)［4－6］，其中異養(yǎng)細菌的生產(chǎn)會消耗海水中的溶解性有機碳DOC和營養(yǎng)鹽（無機氮DIN、磷酸鹽P）并轉換為自身的生物量，而細菌的呼吸會代謝自身產(chǎn)物并轉化為CO2，它們之間的關系會決定異養(yǎng)細菌的轉換效率，進而影響細菌的生長［7］。因此，海水和營養(yǎng)鹽等營養(yǎng)物質是影響異養(yǎng)細菌生長的重要限制因子［8－9］。

南海是中國面積最大的海域，屬于貧營養(yǎng)海區(qū)，其表層水溫終年較高（25℃以上）［10］，葉綠素和初級生產(chǎn)力水平較低［11］。由于受海水營養(yǎng)的限制，南海異養(yǎng)浮游細菌出現(xiàn)數(shù)量較少、分布不均［12－14］。南海屬于陸間海，面臨著大氣沉降、近岸陸源輸入和船舶排放等外來營養(yǎng)源的影響［15］，這勢必對海洋異養(yǎng)細菌種群數(shù)量、群落結構和功能產(chǎn)生一定的影響［9，16］。然而，對于南海異養(yǎng)浮游細菌與營養(yǎng)鹽關系的研究主要集中于南海北部上升流區(qū)域和珠江口及大陸架海區(qū)，發(fā)現(xiàn)南海北部上升流區(qū)域和珠江口區(qū)域異養(yǎng)細菌主要受磷限制，而大陸架海區(qū)異養(yǎng)細菌主要受DOC限制［12－13］，對南海南部異養(yǎng)浮游細菌的研究還要追溯到1986［17］和2009年［18］，主要是對異養(yǎng)細菌分布的研究。南海南部海域的環(huán)境條件與南海北部類似，但是其還受不同內部物理過程和外部河流輸入的影響［19］，所以進行外源營養(yǎng)物對南海南部海域異養(yǎng)細菌生長代謝影響的研究具有著重要意義。

本研究于2012年8月利用現(xiàn)場觀測和模擬培養(yǎng)相結合的方法對南海南部兩個典型站位海水中異養(yǎng)浮游細菌生長的影響因素進行了研究。通過單獨和聯(lián)合投加DOC和N、P等營養(yǎng)要素，觀察異養(yǎng)細菌生物量、細菌比生長速率和呼吸速率的響應，研究南海貧營養(yǎng)鹽區(qū)域異養(yǎng)細菌生長的限制因子，探討外源營養(yǎng)物對細菌物質轉換效率和異養(yǎng)細菌生態(tài)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 現(xiàn)場觀測、培養(yǎng)與樣品采集

在南海南部海域選取兩個有代表性的海盆區(qū)域站位S1站（112°39.140′E，6°36.052′N）和陸架區(qū)域S2站（111°16.647′E，10°29.709′N）進行現(xiàn)場觀測和模擬培養(yǎng)（見圖1）。由船載自容式CTD（Seabird 25，USA）采集表層1m處海水，同時測定現(xiàn)場水溫、鹽度、pH和溶解氧（DO）。水樣采集后，部分樣品置于已加入多聚甲醛的10mL無菌螺口管中，用于細菌生物量的測定；部分水樣過濾后用于營養(yǎng)鹽、DOC測定；部分水樣立即用65μm的篩絹過濾以除去浮游動物的攝食干擾，分裝于1.5L的無菌PET瓶中，裝滿水并加入外源營養(yǎng)物質后用半透膜封口，防止外界干擾但可保持瓶內外交換。將培養(yǎng)瓶置于甲板，在通過循環(huán)海水的恒溫條件下培養(yǎng)6d。

培養(yǎng)實驗共設5組：1個對照組和4個營養(yǎng)物添加組，其中C組為對照組、D組只添加DOC、DN組添加DOC和N、DP組添加DOC和P、DNP組同時添加DOC、N和P，每組均設3個平行。添加的DOC為葡萄糖、N為KNO3、P為KH2PO4，實驗分組和添加營養(yǎng)物質的摩爾質量見表1。分別在第0、1、2、3和第6天中午定時取各培養(yǎng)組的水樣用于細菌和環(huán)境因子的測定，同時測定培養(yǎng)瓶中的溫度、鹽度、pH和DO。每次均取平行樣。

圖1 南海采樣站位Fig.1 Sampling stations of South China Sea

表1 實驗分組及營養(yǎng)物質添加量Table 1 Ambient nutrient concentration /μmol·L－1

1.2 現(xiàn)場環(huán)境因子及營養(yǎng)鹽和DOC的測定

現(xiàn)場水溫、鹽度和pH等數(shù)據(jù)由CTD測得，溶解氧（DO）由WTW 500i便攜水質分析儀測得。

DOC樣品用高溫燃燒氧化法由島津TOC-V型總有機碳測定儀測定［20］。

營養(yǎng)鹽測定使用BRAN＋LUEBBE AA3型營養(yǎng)鹽自動分析儀進行。N-N用次氯酸鈉氧化靛酚藍法［20］，N-N用銅—鎘柱還原后鹽酸萘乙二胺絡合顯色法，N-N用鹽酸萘乙二胺絡合顯色法［21］。

1.3 細菌活性的測定

1.3.1 細菌生物量 將細菌樣品過濾到0.22μm的核孔膜上，經(jīng)過DAPI染色后，用Leica全自動熒光顯微鏡對異養(yǎng)細菌進行計數(shù)［23］。用換算因子20fg C/cell將異養(yǎng)細菌豐度換算為以碳單位表示的細菌的生物量［1］。

1.3.2 細菌比生長速率 根據(jù)公式p＝（lnN2－lnN1）/T計算培養(yǎng)3d前后細菌比生長速率，其中N1和N2是培養(yǎng)時間T前后的細菌總數(shù)［24］。

1.3.3 細菌呼吸速率 參照Vazquez-Dom在2007年的方法，根據(jù)每一時段前后DO濃度的變化量并換算成C消耗量來計算1d前后和3d前后細菌的呼吸速率［25］。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行多因素方差分析（Multivariate Analysis of Variance），計算顯著差異性，其中sig.＜0.05代表結果在不同分組上的差異具備顯著性。

應用SPSS17.0的Correlate程序計算分析不同指標類型結果之間的相關性。

2 結果與討論

2.1 不同站位的環(huán)境特征分析

本研究所在的S1站位于南海南部南沙群島南部區(qū)域，屬于貧營養(yǎng)程度大的海盆區(qū)域，受人為影響較小；S2站位于南海西南部近岸陸架區(qū)域，靠近湄公河河口區(qū)，附近航線比較集中，受人為影響較大。2個站位表層海水的水溫、鹽度、pH、營養(yǎng)鹽現(xiàn)場監(jiān)測結果見表1，可以看出2個站位均具有南海典型的高水溫、高鹽度、高pH、寡營養(yǎng)鹽特征，其DOC、DIN和磷酸鹽水平大致與Yuan在2011年在南海北部得到的數(shù)值（DOC 70μmol/L，DIN 4μmol/L，P0.1μmol/L）相近［12］。因為S2站靠近湄公河河口區(qū)，鹽度和營養(yǎng)鹽稍低于S1站，而DOC則高于S1站。S1的N∶P比值為15.87，S2的N∶P比值為17.57，S1站的N∶P比值與Redfield比值接近［26］，S2站的N∶P比值高于S1站。S1站和S2站表層水體的異養(yǎng)細菌豐度分別為1.45×105和2.15×105cell/mL，均低于Yuan在南海北部貧營養(yǎng)鹽區(qū)域測得的表層海水異養(yǎng)細菌豐度值（6±1）×105cells/mL的結果［12］，說明南海南部異養(yǎng)細菌生長受到環(huán)境因子的限制高于北部海區(qū)。

2.2 異養(yǎng)細菌生物量及對外源營養(yǎng)物的響應

2個站位表層海水異養(yǎng)細菌的生物量見圖2。在S1站，培養(yǎng)期間對照組細菌生物量一直呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢；而只添加DOC的D組，細菌生物量在培養(yǎng)1d內即達到最大值0.090 5mg C/L，是培養(yǎng)前的3.12倍；在培養(yǎng)2d后開始迅速下降。同時添加DOC和N或DOC和P的DN組和DP組的細菌生物量增長較D組緩慢，1d后開始迅速增長，在培養(yǎng)2d后分別達到最大值0.086 7和0.098 8mg C/L，分別為對照組的3.22和3.68倍。同時添加DOC、N和P的DNP組細菌生物量上升較其他組緩慢，在2d開始迅速增長，在3d達到最大值0.166 0mg/L，是對照組的8.89倍。在培養(yǎng)結束時的第6天，S1站DOC添加的D組異養(yǎng)細菌生物量較對照組有明顯增長（P＜0.05），DN組、DP組異養(yǎng)浮游細菌生物量大于D組但不明顯（P＞0.05），而DNP組細菌生物量則明顯大于D組（P＜0.05）；3種營養(yǎng)物聯(lián)合聯(lián)合添加使細菌生物量顯著增加的結果表明，在南海南部貧營養(yǎng)的S1站，細菌的生長除受DOC的限制外，受DOC、N和P等環(huán)境因子的聯(lián)合限制更為明顯。

在離岸相對較近的S2站，各實驗組異養(yǎng)細菌生物量的變化規(guī)律與S1站有所不同，各組生物量均在1d后快速增長，并在2d后達到最大值，D組、DN組、DP組、DNP組分別為0.085 8、0.170 8、0.237 6、和0.185 4 mg/L，分別為對照組的1.29 倍、2.56倍、3.56倍和2.78倍。其中，DP組細菌生物量的最大值。S2站各組細菌生物量均在培養(yǎng)第3d后開始逐漸降低。添加DOC的D組異養(yǎng)細菌生物量與對照組的差異不顯著（P＞0.05），說明DOC對S2站異養(yǎng)細菌生長的限制不明顯；添加P組的生物量較對照組的顯著增大（P＜0.05），表明離岸較近的S2站細菌生物量受P的限制更為明顯。

表2 不同站位的現(xiàn)場環(huán)境因子及細菌測定結果Table 2 Initial environmental factor of the stations

圖2 不同營養(yǎng)物添加組細菌生物量的變化Fig.2 Variation of bacterial biomass among different treatments

2.3 異養(yǎng)細菌呼吸速率及對外源營養(yǎng)物的響應

在培養(yǎng)期間的前3天內，S1站和S2站不同組異養(yǎng)細菌呼吸速率的變化結果見圖3。在遠海的S1站，培養(yǎng)期間對照組細菌呼吸速率呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢；添加DOC的D組細菌呼吸速率在1d即有明顯升高并達到最高值，為1.035mg/L·d；DN、DP和DNP組的細菌呼吸速率則在培養(yǎng)期間一直呈現(xiàn)出上升趨勢，在第3天分別為對照組的3.44、3.02和4.01倍。

S2站的細菌呼吸速率與其細菌生物量的變化趨勢比較相似，其中DOC、DN組均在2d達到最大值，分別為0.818和1.155mg/L·d，為對照組的1.28倍和1.81倍，之后稍有下降。而DP組和DNP組的細菌呼吸速率在培養(yǎng)第3d達到最大值，分別為1.288和1.241mg/L·d，是對照組的2.01倍和3.06倍。

隨著營養(yǎng)物質的增加，異養(yǎng)細菌的生長需要更多的能量進行物質合成，所以異養(yǎng)細菌的呼吸作用出現(xiàn)了增大的態(tài)勢［26］。在S1站，DOC對異養(yǎng)細菌呼吸速率的促進作用較為明顯（P＜0.05），并且在添加DOC的基礎上，聯(lián)合添加N、P對異養(yǎng)細菌呼吸速率的作促進用更為顯著（P＜0.05）；氮的添加對細菌呼吸速率的促進效果比磷的添加更為顯著（P＜0.05），同樣表明該海域細菌生長以DOC限制為主，同時可能受氮的限制。

在離岸相對較近的S2站，營養(yǎng)物質添加對細菌呼吸速率的增加與S1有所不同，添加DOC組細菌呼吸效率的增長對照組差異不顯著（P＞0.05），聯(lián)合添加磷的DP組對細菌呼吸速率的促進效果最為顯著（P＜0.05），進一步表明該海域細菌活性受磷的限制更為明顯。

圖3 不同營養(yǎng)物添加組細菌呼吸速率的變化Fig.3 Variation of bacterial respiration rate among different treatments

2.4 異養(yǎng)細菌比生長速率及對外源營養(yǎng)物的響應

不同組異養(yǎng)細菌在培養(yǎng)前3天的比生長速率見表3。在S1站，對照組在培養(yǎng)前3天異養(yǎng)細菌比生長速率為負值，說明不添加外源營養(yǎng)物質，由于營養(yǎng)缺乏會導致異養(yǎng)細菌數(shù)量在培養(yǎng)期間緩慢下降。而添加DOC的D組細菌比生長速率明顯大于對照組（P＜0.05），表明異養(yǎng)細菌數(shù)量的增長受到了DOC的限制；Yuan等在2011年和Kirchman等在2000年也得出海洋異養(yǎng)細菌在近岸海域主要受DOC限制的結論［5，12］；DN組、DP組和DNP組的細菌比生長速率明顯大于D組（P＜0.05），且DN組的比生長速率明顯大于DP組（P＜0.05），而DNP組的細菌比生長速率最大，主要因為當環(huán)境中DOC限制緩解后，氮和磷會成為細菌生長的限制因子［29］，表明在S1站異養(yǎng)細菌的生長主要受DOC的限制，同時也存在氮的限制。

在S2站，D組前3天的比生長速率比對照組大但不顯著（P＞0.05），這與S2站環(huán)境中的DOC濃度較高有關。DN、DP和DNP組的比生長速率明顯高于對照組（P＜0.05），其中DP組細菌比生長速率較對照組的增長最為明顯，進一步說明在S2站異養(yǎng)浮游細菌生長受磷的限制更為明顯。而DP組的細菌比生長速率大于DNP組；這可能是因為在S2站異養(yǎng)細菌是磷限制且浮游植物是氮限制的，同時加氮和磷會可能促進浮游植物的生長并使其與異養(yǎng)細菌競爭其它營養(yǎng)物質，一定程度上抑制了浮游細菌的生長［27］。

2.5 細菌生長效率及對外源營養(yǎng)物的響應

Pradeep-Ram在2002年曾報道，海水中細菌的呼吸速率與細菌生產(chǎn)之間有著緊密的關系［24］。異養(yǎng)細菌的比生長速率與細菌呼吸速率的比值可作為細菌物質轉換效率的指標。通過對2個站位培養(yǎng)期間前3d的異養(yǎng)細菌比生長速率和呼吸速率進行相關性分析，可見二者之間存在著顯著的正相關關系（r＝0.896，P＜0.01）。2個站位比生長速率與細菌呼吸速率的比值見表3；比值越大，說明細菌對物質的轉換效率越高，細菌異養(yǎng)程度越高［28］。在不同實驗組中，2個站位聯(lián)合添加DOC、氮和磷3種營養(yǎng)物質對于細菌轉換效率的促進作用最為明顯；此外，在S1站氮的添加對細菌轉換效率的促進作大于磷，而在S2站則相反。

外源營養(yǎng)物質在促使異養(yǎng)細菌生物量和呼吸速率增長的同時，使異養(yǎng)細菌的異養(yǎng)程度進一步增大，也增加了細菌的物質轉換效率，將有助于其在南海南部海域生態(tài)效率的提高。

表3 培養(yǎng)3d時異養(yǎng)細菌比生長速率（p）、呼吸速率（r）及二者比值的（p/r）Table 3 Bacterial special growth rate and bacterial respiration rate

3 結論

（1）南海南部2個站位S1、S2都屬貧營養(yǎng)狀態(tài)，其異養(yǎng)細菌生物量相對于其他海域較低。在海盆區(qū)的S1站，異養(yǎng)細菌生長的主要限制因子是DOC，其次是氮限制；而在近岸的S2站，異養(yǎng)細菌則主要受磷限制。

（2）當南海南部海域2個站位海水受外源營養(yǎng)物輸入時，異養(yǎng)細菌生物量和呼吸速率叫對照組明顯增高。在S1站，同時添加DOC、氮和磷時異養(yǎng)細菌生物量、比生長速率和呼吸速率的增加最為顯著；而近岸的S2站，同時添加DOC和磷時異養(yǎng)細菌生物量、比生長速率和呼吸速率增長最為顯著。外源營養(yǎng)物質的添加使2個站位異養(yǎng)細菌的異養(yǎng)程度明顯增加，將異養(yǎng)細菌的物質轉換效率明顯增加，顯著提高其在南海南部海域的生態(tài)作用效率和生態(tài)功能。

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