31例維吾爾族黏膜黑素瘤臨床與c-kit基因突變研究

柴莉 康曉靜 孫振柱 高峰 時曉輝 于世榮 陳文靜吳秀娟 丁媛 梁俊琴 劉文先 普雄明

31例維吾爾族黏膜黑素瘤臨床與c-kit基因突變研究

柴莉 康曉靜 孫振柱 高峰 時曉輝 于世榮 陳文靜吳秀娟 丁媛 梁俊琴 劉文先 普雄明

目的 分析維吾爾族黏膜黑素瘤臨床特點，檢測c-kit基因突變，探討與黏膜黑素瘤臨床特征之間的關系。方法 收集經(jīng)病理確診的31例維吾爾族黏膜黑素瘤患者的臨床資料，采用PCR及DNA直接測序法進行c-kit基因突變檢測。結(jié)果 維吾爾族黏膜黑素瘤男女性別比為1∶1.2，平均年齡61.35歲。60～70歲為高發(fā)年齡段，51～59歲為次高發(fā)年齡段。頭頸部為最常見的發(fā)病部位，其中以鼻腔黏膜居多；其次為泌尿生殖道和直腸黏膜。31例黏膜黑素瘤有4例發(fā)生c-kit基因突變（12.9%，4/31），突變均位于11外顯子，以L576P突變?yōu)橹鳌?例突變中，3例發(fā)生于直腸黏膜，1例發(fā)生于尿道黏膜。直腸黏膜與其他黏膜部位c-kit基因突變率分別為3/7、4.17%（1/24）。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者c-kit基因突變率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P=0.043）。c-kit基因突變與性別、年齡無相關性（P＞0.05）。結(jié)論 維吾爾族黏膜黑素瘤好發(fā)于老年人，發(fā)病部位以頭頸部黏膜為主。c-kit基因突變與黏膜黑素瘤發(fā)生部位、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關。

黑色素瘤；黏膜；維吾爾族；原癌基因蛋白質(zhì)c-kit；突變

黏膜黑素瘤是起源于呼吸道、消化道和泌尿生殖道黏膜的高度惡性腫瘤［1］。起病隱匿、臨床無特征性、不易早期發(fā)現(xiàn)，5年生存率為 25%［2］；若發(fā)生轉(zhuǎn)移，其3年生存率不到15%［3］。腫瘤的發(fā)生與介導細胞增殖及凋亡的一些關鍵基因的突變有密切關系。對黏膜黑素瘤遺傳易感基因研究發(fā)現(xiàn)，參與MAPK、PI3K/Akt、JAK/STAT等多條信號轉(zhuǎn)導途徑的c-kit基因是黏膜黑素瘤中突變率較高的基因，也是目前黏膜黑素瘤特異性靶向治療研究熱點基因。與皮膚黑素瘤相比，黏膜黑素瘤相對少見。目前，關于黏膜黑素瘤的研究資料較少，且多集中于漢族人群［4］。本研究對31例維吾爾族黏膜黑素瘤臨床特點進行分析，并對c-kit基因進行突變篩查，探討與黏膜黑素瘤臨床特征之間的關系。

對象與方法

一、對象

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院病理科及皮膚科2004年1月至2013年12月明確診斷為黏膜黑素瘤的石蠟包埋組織31例及新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院整形科及泌尿外科因外傷或其他原因需切除的部分正常皮膚的石蠟包埋組織10例。所有標本均經(jīng)組織病理診斷證實。

二、臨床資料

1.年齡和性別：31例維吾爾族黏膜黑素瘤患者均無家族史。發(fā)病年齡38～83歲，平均年齡61.35歲。31～40歲1例，41～50歲5例，51～59歲 8例，60～70歲10例，71～80歲6例，81～90歲1例?！?0歲17例，＜60歲14例。其中，60～70歲為維吾爾族黏膜黑素瘤患者的高發(fā)年齡段，51～59歲為次高發(fā)年齡段。男性患者14例，占45.16%；女性患者17例，占54.84%；男∶女為1∶1.2。

2.原發(fā)部位：31例維吾爾族黏膜黑素瘤中，12例發(fā)生于頭頸部，該部位是最常見的原發(fā)部位（12/31，38.71%），其中鼻腔黏膜5例，在頭頸部黑素瘤中最為多見（5/12）；另有4例發(fā)生于口腔黏膜，3例見于眼脈絡膜。其他比較常見的部位為泌尿生殖道和直腸黏膜，分別為11例（11/31，35.48%）、7例（7/31，22.58%）。另外，還有少見的食管黏膜黑素瘤1例。17例女性患者中，10例發(fā)生于泌尿生殖道（10/17），是女性最常見的發(fā)病部位，其中發(fā)生于外陰5例，占女性泌尿生殖道5/10，宮頸、陰道各2例，尿道黏膜1例；另有5例發(fā)生于頭頸部（5/17），是女性患者的另一常見發(fā)病部位。男性陰莖患者1例。

3.臨床表現(xiàn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：發(fā)生于直腸黏膜的患者臨床表現(xiàn)主要為便血、大便性狀改變及排便習慣改變；鼻腔黏膜主要癥狀為鼻塞、鼻出血或涕中帶血、腫塊形成；口腔黏膜以腫塊形成、吞咽不適為主要表現(xiàn)；眼脈絡膜則以視力下降、流淚、疼痛為主。外陰部位的常見臨床表現(xiàn)為瘙癢、疼痛、出血、外陰腫物；發(fā)生于宮頸、陰道者主要表現(xiàn)為疼痛和出血；尿道黏膜表現(xiàn)為血尿和疼痛；陰莖臨床表現(xiàn)為腫物形成、疼痛。還有食管黏膜1例，患者主要臨床癥狀為咽部梗阻感。病程：黏膜黑素瘤起病隱蔽，患者多于癥狀出現(xiàn)數(shù)月后才被診斷?；颊叱霈F(xiàn)始發(fā)癥狀至明確診斷間隔時間1個月至4年，平均7個月。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：8例患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（8/31，25.81%），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者23例（23/31，74.19%）。

三、實驗方法

1.DNA的提?。菏灠窠M織DNA提取按試劑盒說明書進行（QIAamp DNA FFPE試劑盒，德國Qiagen公司），提取的DNA放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.PCR擴增：特異引物擴增c-kit基因11和13外顯子。引物參照文獻［5］，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應體系：總體系50 μl，其中上下游引物各 1 μl，模板 DNA 4 μl，Taq PCR Master Mix 25 μl，雙蒸水 19 μl。PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min，1個循環(huán)；95℃變性30 s，56.5℃退火30s，72℃延伸40s，共35個循環(huán)；72℃總延伸7 min，1個循環(huán)；溫度降至4℃終止反應。以雙蒸水代替模板DNA作為陰性對照。

3.電泳鑒定：為證實PCR產(chǎn)物中含有目的片段DNA，取PCR擴增產(chǎn)物5 μl，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳120 V 30 min，鑒定PCR擴增產(chǎn)量和特異性。

4.PCR擴增產(chǎn)物測序：將經(jīng)電泳鑒定的PCR擴增產(chǎn)物40 μl送上海生工生物工程技術服務有限公司雙向測序，所得結(jié)果與NCBI基因數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，確定突變位點。同時對10例正常皮膚石蠟包埋組織進行PCR擴增并將擴增產(chǎn)物測序。

四、統(tǒng)計學處理

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。采用Fisher精確概率法分析各臨床特征與c-kit基因突變之間的關系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、組織病理檢查

1.巨檢：腫瘤大小不等，最大為5.0 cm×4.0 cm×3.5 cm，最小體積為1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm。腫瘤呈扁平或結(jié)節(jié)狀或菜花狀，表面暗紅色或灰褐色，切面灰褐色或暗黑色，部分瘤體表面充血明顯，伴有糜爛或潰瘍，質(zhì)脆（圖1）。

2.鏡檢：鏡下見瘤細胞圓形或多邊形，胞質(zhì)淡染，細胞核大、深染，核分裂象可見，胞質(zhì)內(nèi)可含有色素顆粒。瘤細胞呈巢狀或散在彌漫分布，沿水平和垂直方向擴展（圖2）。

二、c-kit基因突變分析

1.目的片段鑒定電泳圖：黏膜黑素瘤、正常皮膚組織和陰性對照PCR擴增片段鑒定電泳圖（圖3，4）。c-kit基因11外顯子和13外顯子PCR擴增產(chǎn)物長度分別為225 bp、193 bp。

圖1 黏膜黑素瘤瘤體組織病理檢查 瘤體呈淺灰色，向直腸腔內(nèi)突出生長，占據(jù)管腔2/3，管腔明顯狹窄，表面充血

圖2 損害組織病理 瘤細胞呈圓形或多邊形，核大、深染，核分裂象可見，瘤細胞呈巢狀分布（箭頭，HE×400）

2.c-kit基因突變類型：31例黏膜黑素瘤中4例發(fā)生c-kit基因突變，均位于11外顯子。其中3例為L576P點突變：該突變中第1727位堿基C（胞嘧啶）替代了T（胸腺嘧啶），使其編碼的亮氨酸（Leu）被脯氨酸（Pro）取代；1例為W557R點突變：該突變中第1669位堿基T（胸腺嘧啶）被C（胞嘧啶）替代，其編碼的氨基酸由色氨酸（Trp）變?yōu)榫彼幔ˋrg）（圖5）。c-kit基因13外顯子及10例正常皮膚組織未見上述突變。

三、c-kit基因突變與臨床特征之間的關系

圖3 c-kit基因PCR擴增片段凝膠電泳圖 11外顯子：擴增產(chǎn)物長度為225 bp。M：標準參照物；1：正常皮膚組織；2～5：黏膜黑素瘤組織；6：陰性對照 圖4 13外顯子：擴增產(chǎn)物長度為193 bp。M：標準參照物；1：正常皮膚組織；2～4：黏膜黑素瘤組織；5：陰性對照

4例突變中，3例發(fā)生于直腸黏膜，1例見于尿道黏膜（表1）。直腸黏膜和其他黏膜部位c-kit基因突變率分別為3/7、1/24。8例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中檢測到3例發(fā)生c-kit基因突變3/8，23例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中1例發(fā)生突變1/23。不同性別及年齡之間c-kit基因突變差異無統(tǒng)計學意義，均Pgt;0.05。

討 論

黑素瘤是起源于表皮黑素細胞的一種高度惡性腫瘤。臨床上傾向?qū)⑵浞譃橹诵?、黏膜型、慢性日光損傷型和非慢性日光損傷型［6］。黏膜黑素瘤的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)相對較低，臨床資料缺乏［7］。但在亞洲人群中，黏膜黑素瘤的患病人數(shù)僅次于肢端黑素瘤，位居第二［4］。國內(nèi)［4，6，8］關于黑素瘤的研究報道較多，但大多集中于漢族人群，而維吾爾族黑素瘤的研究報道較少［9］，與c-kit基因相關研究報道更為少見。c-kit基因位于人染色體4q12，屬于原癌基因，編碼跨膜酪氨酸激酶受體，生理情況下與其配體干細胞因子（stem cell factor，SCF）結(jié)合后，觸發(fā)下游的信號轉(zhuǎn)導通路，調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化等。突變后的c-kit基因可以不依賴于SCF而自動磷酸化，持續(xù)活化并激活下游的多條信號傳導通路，導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。2004年,Went等［10］首次在黑素瘤中發(fā)現(xiàn)c-kit基因突變，有研究表明，c-kit基因是黑素瘤中常見的致癌基因，該基因突變不僅與分子靶向治療密切相關，而且認為是黑素瘤獨立的預后不良因素［6，11-12］。

本研究結(jié)果顯示,維吾爾族黏膜黑素瘤好發(fā)于老年患者；平均年齡為61.35歲，60～70歲為高發(fā)年齡段。這與國內(nèi)漢族人群的年齡分布類似［6］，但與白種人相比［13］，本地區(qū)黏膜黑素瘤的發(fā)病有年輕化的趨勢，這是否與環(huán)境因素改變有關，尚待進一步研究。本研究顯示，維吾爾族黏膜黑素瘤在女性患者中更常見，推測發(fā)生這一現(xiàn)象的原因可能與泌尿生殖道系統(tǒng)來源的黑素瘤女性占絕大多數(shù)有關。頭頸部是維吾爾族黏膜黑素瘤最常見的發(fā)病部位，其中又以鼻腔黏膜為主，其次為泌尿生殖道系統(tǒng)和直腸黏膜。初始癥狀常與其原發(fā)病灶相關，不同部位的出血如，便血、鼻出血等是患者就診時最常見的癥狀。黏膜黑素瘤的發(fā)病部位隱匿，臨床癥狀因發(fā)病部位不同而表現(xiàn)各異，加之早期缺乏特異性的臨床特征，患者多于癥狀出現(xiàn)數(shù)月后才被診斷，極易導致誤診和漏診。提示在臨床診療行為中要提高對黏膜黑素瘤的認識，必要時結(jié)合組織病理學、免疫組化等相關檢查明確診斷，盡量避免誤診和漏診。

圖5 c-kit基因突變類型測序圖 5A：c-kit基因L576P正?；蛐停?B：c-kit基因 L576P雜合突變（CTT→CCT）；5C：c-kit基因L576P純合突變（CTT→CCT）；5D：c-kit基因 W557R正常基因型：5E：c-kit基因W557R雜合突變（TGG→CGG）

表1 c-kit基因突變患者臨床資料

Went等［10］在黑素瘤中發(fā)現(xiàn)，c-kit基因 11 外顯子L576P突變（T1727C），該突變導致膜旁結(jié)構(gòu)域第576位亮氨酸被脯氨酸取代。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，黑素瘤中c-kit基因突變主要發(fā)生于11和13外顯子，又以累及胞內(nèi)近膜結(jié)構(gòu)域的外顯子11最常見［14］。突變位點最常見于11外顯子的L576P（T1727C）突變，其次為W557R（T1669C），該突變位點也位于11外顯子［14］。值得注意的是，不同黑素瘤亞型c-kit基因突變率不同，在黏膜黑素瘤中該基因突變率可達39%［11-12，15］。本研究 31 例患者中有 4 例發(fā)生 c-kit基因突變，突變率為12.9%。突變均位于11外顯子，3例為L576P突變，1例為W557R突變，以雜合突變?yōu)橹鳌＿@些突變位點在以往的研究中均有報道，且與國內(nèi)漢族人群及白種人該基因常見突變位點及類型相一致［6，12］。另有報道顯示，不同黏膜部位 c-kit基因突變率不同［15］。維吾爾族黏膜黑素瘤c-kit基因突變率在不同發(fā)病部位亦存在差異，直腸黏膜c-kit基因突變率明顯高于其他黏膜部位，在本研究中高達 3/7。而 Omholt等［15］的研究結(jié)果表明，c-kit基因突變主要發(fā)生于外陰/陰道部位。提示黏膜黑素瘤c-kit基因突變的發(fā)生可能與地域、環(huán)境等因素有關。

［1］任丹陽,康曉靜.原發(fā)性黏膜黑素瘤研究進展［J］.國際皮膚性病學雜志,2013,39（5）：327-330.

［2］Mihajlovic M,Vlajkovic S,Jovanovic P,et al.Primary mucosal melanomas：a comprehensive review ［J］.Int J Clin Exp Pathol,2012,5（8）：739-753.

［3］Nikolaou VA,Stratigos AJ,Flaherty KT,et al.Melanoma：new insights and new therapies［J］.J Invest Dermatol,2012,132（3 Pt 2）：854-863.

［4］Chi Z,Li S,Sheng X,et al.Clinical presentation,histology,and prognoses of malignant melanoma in ethnic Chinese：a study of 522 consecutive cases［J］.BMC Cancer,2011,11：85.

［5］Ni S,Huang D,Chen X,et al.c-kit gene mutation and CD117 expression in human anorectal melanomas［J］.Hum Pathol,2012,43（6）：801-807.

［6］Kong Y,Si L,Zhu Y,et al.Large-scale analysis of KIT aberrations in Chinese patients with melanoma［J］.Clin Cancer Res,2011,17（7）：1684-1691.

［7］McLaughlin CC1,Wu XC,Jemal A,et al.Incidence of noncutaneous melanomas in the U.S.［J］.Cancer,2005,103（5）：1000-1007.

［8］Si L,Guo J.C-kit-mutated melanomas：the Chinese experience［J］.Curr Opin Oncol,2013,25（2）：160-165.

［9］郭芳,康曉靜,唐小輝,等.新疆80例惡性黑素瘤BRAF基因突變分析［J］.中華皮膚科雜志,2013,46（1）：33-36.

［10］Went PT,Dirnhofer S,Bundi M,et al.Prevalence of KIT expression in human tumors［J］.J Clin Oncol,2004,22（22）：4514-4522.

［11］Beadling C,Jacobson-Dunlop E,Hodi FS,et al.KIT gene mutations and copy number in melanoma subtypes［J］.Clin Cancer Res,2008,14（21）：6821-6828.

［12］Curtin JA,Busam K,Pinkel D,et al.Somatic activation of KIT in distinct subtypes of melanoma ［J］.J Clin Oncol,2006,24（26）：4340-4346.

［13］PostowMA,HamidO,CarvajalRD.Mucosalmelanoma：pathogenesis,clinical behavior,and management［J］.Curr Oncol Rep,2012,14（5）：441-448.

［14］時曉輝,康曉靜.黑素瘤與kit基因研究進展［J］.國際皮膚性病學雜志,2014,40（1）：59-61.

［15］Omholt K,Grafstr?m E,Kanter-Lewensohn L,et al.KIT pathway alterations in mucosal melanomas of the vulva and other sites［J］.Clin Cancer Res,2011,17（12）：3933-3942.

2014-09-19）

（本文編輯：吳曉初）

Mucosal melanoma:clinical assessment and mutation analysis of the c-kit gene in 31 Uygur patients

Chai Li*,Kang Xiaojing,Sun Zhenzhu,Gao Feng,Shi Xiaohui,Yu Shirong,Chen Wenjing,Wu Xiujuan,Ding Yuan,Liang Junqin,Liu Wenxian,Pu Xiongming.*Xinjiang Medical University,Urumqi 830001,China

Kang Xiaojing,Email：drkangxj666@163.com

ObjectiveTo analyze clinical characteristics of and c-kit gene mutations in Uygur patients with mucosal melanoma,and to explore the relationship between c-kit gene mutations and clinical characteristics of mucosal melanoma.MethodsClinical data were collected from 31 Uygur patients with pathologically confirmed mucosal melanoma.DNA was extracted from paraffin-embedded melanoma tissue samples from these patients.Then,PCR and direct DNA sequencing were performed to detect c-kit gene mutations.Statistical analysis was carried out by using Fisher′s exact test.ResultsOf the 31 Uygur patients,the male/female ratio was 1 ∶1.2,and the average age was 61.35 years.The incidence of mucosal melanoma was highest in the age group of 20-44 years,followed by the age group of 51-59 years.Head and neck,especially nasal mucosa,were the most common sites affected by mucosal melanoma,followed by genitourinary and rectal mucosa.C-kit gene mutations were detected in 4 （12.9%,4/31）out of the 31 mucosal melanoma cases,which were located in exon 11 and included L576P mutation in 3 cases and W557R mutation in 1 case.Of the 4 patients carrying C-kit gene mutations,3 had rectal mucosal melanoma and 1 urethral mucosal melanoma.The frequency of c-kit gene mutations was 3/7 in patients with rectal mucosal melanoma and 4.17%（1/24）in those with melanoma at the other mucosal sites.Additionally,the frequency of c-kit gene mutations was significantly higher in patients with lymph node metastasis than in those without（P=0.043）,but similar between male and female patients or between different age groups（bothP＞ 0.05）.ConclusionsMucosal melanoma mainly occurs in the elderly in Uygur population,with mucosa of the head and neck as the predilection sites.Mutations of the c-kit gene are closely associated with the site and lymph node metastasis of mucosal melanoma.

Melanoma;Mucous membrane;UYGUR NATIONALITY;Proto-oncogene proteins c-kit;Mutation

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.06.006

烏魯木齊市科學技術計劃項目（G131310001）；2012年度留學人員回國創(chuàng)業(yè)項目

830001烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學（柴莉）；新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科（康曉靜、時曉輝、于世榮、陳文靜、吳秀娟、丁媛、梁俊琴、劉文先、普雄明），病理科（孫振柱），消化科（高峰）

康曉靜，Email：drkangxj666@163.com