哈爾濱地區(qū)老年性耳聾與GRHL2基因SNP位點的相關(guān)性

周彬 徐平 崔忠濤 馮淼 柏智剛 馬肖男 李婷婷

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（哈爾濱150001）

哈爾濱地區(qū)老年性耳聾與GRHL2基因SNP位點的相關(guān)性

周彬 徐平 崔忠濤 馮淼 柏智剛 馬肖男 李婷婷

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（哈爾濱150001）

目的研究哈爾濱地區(qū)漢族人群老年性耳聾與GRHL2基因SNP位點的相關(guān)性，探討GRHL2基因與老年性耳聾的遺傳易感性的可能關(guān)系方法選擇哈爾濱市區(qū)或郊縣50歲以上449位中老年人作為研究對象，聽力下降至少25分貝以上的224例為病例（老年性耳聾）組，聽力下降小于25分貝的225例作為正常組。采用Sequenom MassARRAY特定SNP基因分析檢測的方法，計數(shù)rs10955255，rs2127034，rs1981361多態(tài)位點的各組基因型頻數(shù)和等位基因頻數(shù)，應(yīng)用卡方檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析判斷各組間差異。結(jié)果rs10955255與rs2127034多態(tài)位點病例組與對照組比較，基因型及等位基因分布差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；rs1981361多態(tài)位點病例組與對照組比較，基因型及等位基因分布差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論哈爾濱地區(qū)漢族老年性耳聾與GRHL2基因rs1981361SNP位點具有相關(guān)性，GRHL2基因可能是研究老年性耳聾遺傳易感性的一個有意義的基因，本結(jié)果為進(jìn)一步進(jìn)行大規(guī)模多中心的相關(guān)方面研究提供了基礎(chǔ)。

老年性耳聾；GRHL2；單核苷酸多態(tài)性

隨著社會人口的老齡化,老年性聾已成為人類常見的聽力疾病。老年性聾也稱作年齡相關(guān)性聾,主要是指隨著年齡的增加逐漸發(fā)生的以高頻聽力下降為主的感音神經(jīng)性聽力損失。老年性聾是環(huán)境因素及遺傳因素共同作用的結(jié)果[1-2]；有研究表明遺傳因素在老年性聾發(fā)生發(fā)展過程中所起作用的比例約為35%-55%[3，4]。

Van Laer L等[4]學(xué)者利用候選基因關(guān)聯(lián)分析的方法對GRHL2基因與老年性聾的關(guān)系進(jìn)行研究,結(jié)果顯示GRHL2基因的許多個SNPs，尤其是rs10955255, rs2127034和rs1981361的多態(tài)位點與歐洲人老年性聾遺傳易感性相關(guān)聯(lián)，因此，進(jìn)一步探討GRHL2是否為真正的老年性聾遺傳易感基因具有重要的研究意義。

本研究以中國哈爾濱地區(qū)漢族人群為遺傳背景，將GRHL2基因的rs10955255,rs2127034和rs1981361 SNP作為目標(biāo)位點，以探討GRHL2基因在老年性耳聾遺傳易感性方面的可能意義。

1　資料與方法

1.1一般資料

從1268名自愿者中隨機(jī)選取449例漢族中老年人，來自哈爾濱市區(qū)或郊區(qū)，年齡在50歲以上,均沒有吸煙及飲酒史,生活規(guī)律。病例組：224人，聽力下降至少25dBHL以上，正常組：225人，聽力下降小于25dBHL。兩組研究對象均排除傳導(dǎo)性聾（優(yōu)側(cè)耳在0.5、1.0、2.0kHz的平均氣骨導(dǎo)差超過10dBHL)、噪聲性聾(有明確的噪聲接觸史，且優(yōu)勢耳在4.0kHz下降，4.0kHz比8.0kHz閾值高20dB以上)、以及其他疾病導(dǎo)致的耳聾：包括藥物性聾、突發(fā)性耳聾、梅尼埃病、耳硬化癥、中耳粘連、聽神經(jīng)瘤及自身免疫性感音神經(jīng)性聾等,所有研究對象均無耳聾家族史。

本研究經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院倫理委員會論證同意，449例研究對象均簽署知情同意書，自愿參與本項研究。

1.2聽力檢查

聽力學(xué)檢查應(yīng)用GSI61雙通道診斷型聽力計對所選志愿者進(jìn)行純音測聽檢查，初步判斷聽力損失程度；應(yīng)用GSITympstar聲導(dǎo)抗檢測儀進(jìn)行鼓室壓力、聲順值、聲反射及鐙骨肌反射檢測，了解中耳傳導(dǎo)狀況；應(yīng)用GSIAudera腦干誘發(fā)電位測試系統(tǒng)進(jìn)行聽性腦干反應(yīng)檢測，確定聽覺閾值及排除聽神經(jīng)相關(guān)病變。以上測試設(shè)備均產(chǎn)自美國格雷森-斯塔德勒公司。

1.3耳聾表型的分析判斷標(biāo)準(zhǔn)

本研究的耳聾表型判斷標(biāo)準(zhǔn)參照NIH＆WTO（2000）標(biāo)準(zhǔn)，對聽力損失的評定：以相對好耳（優(yōu)側(cè)耳）0.5、1.0、2.0、4.0kHz頻率的氣導(dǎo)平均值（PTA）為基準(zhǔn)評定聽力損失的程度：<25dBHL為聽力正常，26-40dBHL為輕度，41-70dBHL為中度，71-95dBHL重度，>95dBH L為極重度。

1.4Sequenom MassARRAY特定SNP基因分析檢測

對所有研究對象采集外周靜脈血3-5m l用于基因組DNA的抽取。抽提志愿者DNA后，先通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，然后加入SNP序列特異延伸引物，在SNP位點上，延伸1個堿基。將制備的樣品分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶后在質(zhì)譜儀的真空管經(jīng)強(qiáng)激光激發(fā)，核酸分子解吸附為單電荷離子，電場中離子空管中的飛行時間而獲得樣品分析物的精確分子飛行時間與離子質(zhì)量成反比，通過檢測核酸分在真空管中的飛行時間與離子質(zhì)量成反比，通過檢測核酸分子真量，從而檢測出SNP位點信息（本部分工作在博奧生物技術(shù)有限公司完成）。引物序列如下：rs1981361A等位基因序列：5’-CAGAG?GCCTAGCGACC-3’rs1981361PCR上游引物1：5’–ACGTTGGATGGGGAAATGCACGTTTAGCAG-3’, rs1981361PCR上 游 引 物 2：5’-ACGTTGGAT?GTTTCACCAAACCACTGGCTC-3’,rs1981361延伸引物1：5’-CAGAGGCCTAGCGAC-3’,rs1981361延伸 引 物 2：5’-CAGAGGCCTAGCGACT-3’；rs2127034T等位基因序列：5’-CAGAGGCCTAGC?GACC-3’rs2127034 PCR上游引物1：5’–ACGTTG?GATGCAGAGTTGAGAAGGCTGCAC-3’,rs2127034 PCR上游引物2：5’-ACGTTGGATGGAGAAAAA?CAGTCCTCAAGC-3’,rs2127034延 伸 引 物 1：5’-CAAGCACACATTAACCCC-3’,rs2127034延伸引 物2：5’-CAAGCACACATTAACCCT-3’；rs10955255A等位基因序列：5’-AGACAATTTTGT?GAATCACTT-3’rs10955255PCR上游引物1：5’–ACGTTGGATGGTTCCCATTTTGTCTGTTTTC-3’, rs1095 5255PCR上游引物2：5’-ACGTTGGATG?GATGTGACAATTCTCTTCTG-3’,rs10955255延伸引物 1：5’-AGACAATTTTGTGAATCACTTC-3’, rs10955255延伸引物2：5’-AGACAATTTTGTGAAT?CACTTT-3’。

2　結(jié)果

2.1一般資料

所有志愿者都是來自哈爾濱市區(qū)或郊區(qū)的漢族老年人，均沒有吸煙及飲酒史,生活規(guī)律,沒有致耳聾藥物應(yīng)用史。病例組（老年耳聾組）224人，平均年齡61.92歲，聽力下降至少25dB以上，正常組225人，平均年齡57.88歲，聽力下降小于25dB。ANOVE分析結(jié)果顯示，病例-對照組間的年齡和性別分布均無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

2.2多態(tài)位點基因型和等位基因在各組間分布情況

選取GHRL2基因中的三個SNP位點：rs10955255,rs2127034和rs1981361作為研究對象。首先，對于rs1981361，GRHL2(AA/AG/GG)基因型分布在對照組和病例組存在顯著差異，如表1，圖1所示。

表1　兩組GRHL2基因rs1981361多態(tài)性基因型分布及等位基因分布與比較（n=449）

圖1　GRHL2基因rs1981361多態(tài)性基因型分布及等位基因分布圖

其次，對于rs1981361，GRHL2(CT/CC/TT)基因型分布在對照組和病例組不存在顯著差異，如表2，圖2所示。

表2　兩組GRHL2基因rs2127034多態(tài)性基因型分布及等位基因分布與比較（n=449）

圖2　GRHL2基因rs2127034多態(tài)性基因型分布及等位基因分布圖

再次，對于rs 10955255，GRHL2(AA/GA/GG)基因型分布在對照組和病例組不存在顯著差異，如表3，圖3所示。

表3　兩組GRHL2基因rs10955255多態(tài)性基因型分布及等位基因分布與比較（n=449）

圖3　GRHL2基因rs10955255多態(tài)性基因型分布及等位基因分布圖

3　討論

在未來的近半個世紀(jì)中，我國老年人口將呈迅速增長的發(fā)展趨勢，隨著我國老齡化社會的全面到來，老年性疾病的發(fā)病率及患病率也急速上升，其中，老年性聾是人類常見的聽力疾病。隨著年齡的增長，人體的不同組織和各類器官，逐漸發(fā)生老化，當(dāng)累積聽覺系統(tǒng)時，出現(xiàn)聽力下降、言語識別率降低，從而發(fā)生老年性耳聾。從宏觀的角度來講，老年性耳聾不是老年人特有的疾病，而是指與年齡相關(guān)而排除其他原因后所發(fā)生的聽力下降，發(fā)表年齡尚未有明確的界定。老年性耳聾的發(fā)病率很高，屬于多基因疾病范疇，具有高度異質(zhì)性，是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果[5，6]。據(jù)調(diào)查，15-20%的成年人及50%以上的超過80歲的老年人有25分貝或以上的聽力損失。聽力下降嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量,甚至導(dǎo)致老年人的心理、生理疾病[7]，嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量。

耳聾是一種具有顯著遺傳異質(zhì)性的疾病，耳聾的基因型和表型之間存在著一定的因果對應(yīng)關(guān)系，老年性耳聾并不是一種統(tǒng)一的疾病，可以由多種因素引起，其出現(xiàn)年齡、發(fā)展速度、聽力損失的程度及對生活的影響等方面因人而異。老年性耳聾是環(huán)境因素及遺傳因素共同作用的結(jié)果[1-2,8]，遺傳因素在老年性耳聾發(fā)病機(jī)制方面的作用越來越受到關(guān)注，有人估計40%-50%的老年性耳聾與遺傳有關(guān)[3]，認(rèn)為個體遺傳背景決定了老年性耳聾表型的差異。針對老年性聾遺傳易感性分子機(jī)制的研究相對較少,其進(jìn)展比較緩慢。

Grainyhead基因編碼果蠅屬的轉(zhuǎn)錄因子,在果蠅生長發(fā)育過程中有重要的調(diào)節(jié)作用。GRHL屬于果蠅屬基因Grainyhead基因的同系物[9],其家族中共有三個成員:GRHL1、GRHL2和GRHL3,這三種基因在胚胎發(fā)育過程中具有相同的重要性,但GRHL2對于內(nèi)耳功能的維持作用顯著,GRHL2編碼轉(zhuǎn)錄因子在許多上皮組織中廣泛表達(dá)[10],在內(nèi)耳,GRHL2主要在蝸管的細(xì)胞系中表達(dá),在胚胎發(fā)育階段起到至關(guān)重要的作用,同時在出生后的上皮細(xì)胞功能維持方面具有重要性[11]。現(xiàn)已明確 GHRL2基因的rs10955255與歐洲老年性聾遺傳易感因素具有強(qiáng)關(guān)聯(lián)性[4],同時有報道指出，GRHL2基因SNP位點與臺灣漢族人老年性耳聾遺傳易感的不具有相關(guān)性[12]。說明GRHL2基因的SNP位點有地域性差異，地區(qū)性篩查GRHL2的SNP位點，對于診療老年性耳聾，改善老年人的生活質(zhì)量，有重要意義。

本文資料顯示老年性耳聾組GRHL2基因rs1981361 SNP位點GA基因型頻率較正常對照組高，而GG基因型頻率較正常對照組低，其差別有顯著性，提示此位點可能與哈爾濱區(qū)域老年性耳聾的發(fā)病有關(guān)。另外，本文資料顯示老年性耳聾組rs2127034和rs10955255等位基因位點基因型頻率與正常對照組無顯著性差異，提示這兩個位點可能與老年性耳聾無相關(guān)性。但是該結(jié)果并不排除GRHL2基因的其他SNP位點與老年性耳聾的相關(guān)性，對于GRHL2基因的深入研究也許能夠進(jìn)一步說明這一問題。

有文獻(xiàn)報導(dǎo)，老年性耳聾疾病中存在一系列的易感基因。Van Eyken報導(dǎo)，KCNQ4基因與老年性耳聾具有相關(guān)性[13]。在解毒和新陳代謝過程中有一種由NAT2編碼的酶，該酶已有文獻(xiàn)證實與老年性耳聾具有相關(guān)性[14,15]。Yan-Han Lin等證實，在臺灣漢族人群中，GRHL2的單核苷酸多態(tài)性與老年性耳聾沒有相關(guān)性[12]。Van Laer所做的2418例病人的相關(guān)性分析證明，GRHL2基因內(nèi)含子1中的單核苷酸多態(tài)性與歐洲人老年性耳聾具有相關(guān)性[4]。

本文與上述文獻(xiàn)的報導(dǎo)不一致，主要原因可能在于群體的差異性和基因的變異性，但也不排除不同的生活環(huán)境所造成的適應(yīng)性改變等原因。這些相關(guān)性可能只適用于某些特定人群，同時也要考慮由于樣本量小而造成的結(jié)果偏差。另外，由于不同實驗組所使用的儀器和判定標(biāo)準(zhǔn)的誤差，所形成的數(shù)據(jù)誤差也是需要考慮的因素之一。

本文中，我們首次選取了哈爾濱地區(qū)漢族老年人，分別檢測對照組和老年性耳聾組GRHL2基因的三個SNP位點，篩查到GRHL2基因rs1981361 SNP位點與哈爾濱地區(qū)老年性耳聾遺傳易感性具有相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，在中國東北寒冷地區(qū)的哈爾濱市，GRHL2基因rs1981361的SNP位點與老年性聾的遺傳易感性有一定的關(guān)系，這為進(jìn)一步的大規(guī)模、多中心、多學(xué)科的研究老年性耳聾奠下了基礎(chǔ)。

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2Christensen K,Frederiksen H,Hoffman HJ.Genetic and environ?mental influences on self-reported reduced hearing in the old and oldestold.JAm Geriatr Soc,2001,49(11):1512-1518.

3Gates GA,Couropmitree NN,Myers RH.Genetic associations in age-related hearing thresholds.Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 1999,125(6):654-662.

4楊仕明,吳南.攻克感音神經(jīng)性耳聾治療難題的基礎(chǔ)研究.中華耳科學(xué)雜志.2013,11（3）:329-334.

5Van Laer L,Van Eyken E,Fransen E,et al.The grainyhead like 2 gene(grhl2),alias tfcp2l3,isassociated with age-related hearing im?pairment.Hum MolGenet,2008,17(2):159-227.

6viljanen A,Era P,Kaprio J,etal.Genetic and environmental influenc?es on hearing in older women.JGerontol A Bid SciMed Sci.2007, 62:447-452.

7Christensenk,Frederiksen H,Hoffman HJ.Genetic and environmental influences on self-reported reduced hearing in the old and oldest.J Geriatr Soc,2001,49(11):1512-1517

8Dalton DS,Cruickshanks KJ,Klein BE,etal.The impactof hearing loss on quality of life in older adults.Gerontologist,2003,43(5): 661-668.

9Viljanen A,Kaprio J,Pyykko I,et al.Genetic and environmental in?fluences on hearing at different frequencies separately for the better and worse hearing ear in older women.Int JAudiol,2007,46(12): 772-780.

10Auden A,Caddy J,Wilanowski T,et al.Spatial and temporal ex?pression of the grainyhead-like transcription factor family during murine development.Gene Expr Patterns,2006,6(8):964-1033.

11Wilanowski T,Tuckfield A,Cerruti L,etal.A highly conserved nov?el family ofmammalian developmental transcription factors related to drosophila grainyhead.Mech Dev,2002,114(1-2):37-50.

12Lin YH,Wu CC,Hsu CJ,et al.The grainyhead-like 2 gene(grhl2) single nucleotide polymorphism is not associated with age-related hearing impairment in han chinese.Laryngoscope,2011,121(6): 1303-1309.

13Gasparini P,Rabionet R,BarbujaniG,etal.High carrier frequency of the 35delg deafnessmutation in european populations.Genetic analysis consortium of gjb2 35delg.Eur JHum Genet,2000,8(1): 19-23.

14 Van Eyken E,Van LaerL,Fransen E,etal.Kcnq4:A gene forage-relat?edhearingimpairment?HumMutat,2006,27(10):1007-1022.

15UnalM,Tamer L,Dogruer ZN,etal.N-acetyltransferase2 gene poly?morphism andpresbycusis.Laryngoscope,2005,115(12):2238-2278.

16Lee CY,Hwang JH,Hou SJ,et al.Using cluster analysis to classify audiogram shapes.Int JAudiol,2010,49(9):628-660.

Correlation between presbycusisamong ethnic Han peop le in Harbin and single nuceotide polymorphism of GRHL2

ZHOUBin,XUPing,CUIzhongtao,FENGmiao,BAIzhigang,MAXiaonan,LITingting
DepartmentofOtolaryngology,Fourth Affiliated HospitalofHarbinMedicalUniversity
Corresponding author:XUPing,Email：hydxpdoctor@163.com

Objective To study the correlation between presbycusis among the Han ethnic group in Harbin area and single-nucleotide polymorphism(SNP)of GRHL2 and determ ine if there isGRHL2 genetic predisposition to presbycusis.M ethods Two hundred and twenty five normalhearing(audiometric thresholds at25 dB HL orbetter)ethnic Han people older than 50 years(the controlgroup)and 224 Han people older than 50 yearsw ith hearing thresholds greater than 25 dB HL(the study group)in urban or suburban areasof Harbinwere included in the study,The Sequenom MassARRAY specific SNPgene analysismethod was employed to analyze genotype frequency and allele frequency in each group.χ2-testwas used in statistical analysis to evaluate differencesbetween groups.Results Therewasno difference in respect to the distribution of genotypesor alleles between these two groups(P>0.05)byχ2-test.Distributions of genotypes and alleles of rs10955255 and rs2127034 SNP in both groups attained Hardy-Weinberg balance.Distributions of genotypes and alleles of rs1981361 SNP did notattain Hardy-Weinberg balance in the two groups(P<0.05 byχ2-test).Conclusion There appears to be a correlation between presbycusis among the Han people in Harbin and the GRHL2 rs1981361 SNP.The GRHL2 genemay be ameaningful gene for research on genetic susceptibility to presbycusis.Our results provide thebasis for future relevant large-scalemulticenterstudies.

Presbycusis,GRHL2,single-nucleotide polymorphism

R764.43

A

1672-2922（2015）03-529-04

10.3969/j.issn.1672-2922.2015.03.034

黑龍江省政府博士后資助基金項目編號LRB2010-320；黑龍江省青年科學(xué)基金項目編號QC2011C029

周彬，副主任醫(yī)師，副教授,醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：耳聾的臨床及基礎(chǔ)研究

徐平，Email：hydxpdoctor@163.com

2014-9-15 審核人：郭維維)