尼莫地平對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠P38MAPK信號(hào)通路的調(diào)控作用

陳旭如，張佳彥

（1復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院，上海200240；2上海市第八人民醫(yī)院，上海200235）

尼莫地平對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠P38MAPK信號(hào)通路的調(diào)控作用

陳旭如1，張佳彥2

（1復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院，上海200240；2上海市第八人民醫(yī)院，上海200235）

目的：研究尼莫地平對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷（ALI）的保護(hù)作用及其對(duì)P38MAPK信號(hào)通路的調(diào)控作用.方法：用LPS誘導(dǎo)免疫炎癥損傷來建立ALI動(dòng)物模型.40只健康昆明小鼠分成對(duì)照組（n＝8）、LPS模型組（n＝16）和尼莫地平干預(yù)組（n＝16）.除對(duì)照組外，其余小鼠腹腔注射LPS（5 mg／kg）；尼莫地平干預(yù)組在注射LPS 0.5 h前注射尼莫地平（20 mg／kg）；對(duì)照組注射等量生理鹽水.藥物注射完畢后1 h、3 h各取每組中的半數(shù)處死取肺組織，HE染色觀測(cè)病理改變，ELISA檢測(cè)血清中炎癥因子變化，Western Blotting方法檢測(cè)其肺組織絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、MKK3／6、活化轉(zhuǎn)錄因子ATF?2表達(dá)變化.結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)尼莫地平干預(yù)組能夠減輕肺病理損傷，降低血清中炎癥因子TNF?α和 IL?1β含量，抑制小鼠肺組織中的 p?P38MAPK、p?PMKK3／6、p?ATF?2的表達(dá)量.結(jié)論：尼莫地平能減輕LPS誘導(dǎo)的肺組織損傷，主要通過抑制P38MAPK信號(hào)通路的激活，減少炎癥因子的產(chǎn)生，從而發(fā)揮對(duì)ALI的保護(hù)作用.

尼莫地平；急性肺損傷；炎癥因子；P38MAPK信號(hào)通路

0　引言

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是各種肺內(nèi)、肺外因素引起的肺泡上皮細(xì)胞以及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷所導(dǎo)致的一種急性進(jìn)行性呼吸衰竭［1］.其病理特點(diǎn)為：肺泡上皮和毛細(xì)血管細(xì)胞發(fā)生廣泛性的損傷，導(dǎo)致肺泡毛細(xì)血管通透性增加，進(jìn)而出現(xiàn)血漿蛋白漏出，形成富含蛋白質(zhì)的肺透明膜，最終出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，形成了肺部水腫和微血栓［2］.最終臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的低氧血癥和持續(xù)加重的進(jìn)行性呼吸困難.

目前對(duì)于該病的治療主要以機(jī)械通氣為主，輔以藥物治療，但治療策略極為有限.近年來對(duì)該病的研究很多，但臨床發(fā)病率及死亡率仍居高不下，因此進(jìn)一步研究其發(fā)病機(jī)制及治療措施極為必要.在臨床上，與膿毒癥合并的ALI發(fā)病率較高，而膿毒癥感染的常見原因之一是革蘭陰性桿菌感染.革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的主要成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是主要的致病因素［3］，因此可利用LPS誘導(dǎo)ALI模型，探討ALI的發(fā)病機(jī)制及其治療措施.

尼莫地平在臨床上用于預(yù)防蛛網(wǎng)膜下隙出血后的血管痙攣，近年研究發(fā)現(xiàn)尼莫地平可調(diào)節(jié)免疫和細(xì)胞增殖，因此本研究利用腹腔注射LPS建立小鼠免疫炎癥模型，從免疫調(diào)節(jié)出發(fā)，考察尼莫地平是否對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI具有保護(hù)作用，以及其可能的作用機(jī)制，是否通過調(diào)控P38MAPK信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)作用，以期為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑 尼莫地平（Nimodipine，上海博蘊(yùn)生物科技有限公司）；LPS（E.coli serotype 055：B5，Sigma公司）；絲裂原活化蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase，MAPK）、活化轉(zhuǎn)錄因子（ATF?2）、MKK3／6和β?actin抗體（Bioworld Company）.

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制作健康昆明小鼠40只，雄性，體質(zhì)量35～40 g，將小鼠分籠喂養(yǎng)于室溫控制在25±2℃的室內(nèi)，自由進(jìn)食進(jìn)水，12 h光照.動(dòng)物適應(yīng)5 d后開始實(shí)驗(yàn).將動(dòng)物分成對(duì)照組（n＝8）、LPS模型組（n＝16）和尼莫地平干預(yù)組（n＝16）.LPS模型組和尼莫地平干預(yù)組小鼠腹腔注射LPS（5 mg／kg）；尼莫地平干預(yù)組在注射LPS 0.5 h前注射尼莫地平，劑量為20 mg／kg；對(duì)照組腹腔給予等量的生理鹽水.脂多糖注射1、3 h后各取每組中的半數(shù)動(dòng)物處死，取肺組織.

2　標(biāo)本處理及指標(biāo)測(cè)定

2.1血清收集 4%水合氯醛麻醉小鼠后，剪除小鼠胡須，采用眼球取血法收集血液約1 mL.在4℃冰箱靜置過夜，2000 g離心10 min后取上清，放置－80℃保存?zhèn)溆?

2.2肺組織收集 分離右肺葉，右肺上葉用4%多聚甲醛固定，蘇木素?伊紅（htoxylin eosin，HE）染色進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè).右肺中葉快速置于液氮中凍存，用于肺組織免疫印跡分析（Western Blot）檢測(cè).取右肺下葉用于肺組織濕干重比（W／D）的測(cè)量.

2.3HE病理染色 肺組織在4%多聚甲醛中固定，組織蠟塊包埋后切片，厚度為5 μm.將組織切片進(jìn)行HE染色，中性樹膠封片.

2.4ELISA法測(cè)血清中細(xì)胞因子水平 血清中細(xì)胞因子TNF?α和IL?1β的含量根據(jù)酶聯(lián)免疫試劑盒的說明書逐步進(jìn)行.

2.5肺組織濕干重（W／D）比值測(cè)定 取右肺下葉用于肺組織濕干重比測(cè)量.首先用吸水紙將肺組織表面的水漬吸干后再行稱重，此為肺組織濕重.之后置于80℃烘箱中烘烤24 h，再次稱量得到肺組織的干重，濕重／干重的比值即為肺組織的濕干重比.

2.6Western Blot法檢測(cè)肺組織P38MAPK信號(hào)通路各蛋白表達(dá) 將提取的肺組織用0.9%的生理鹽水研磨成組織勻漿，離心后取其上清液，利用bicincho?ninic acid（BCA）法測(cè)蛋白濃度.電泳每孔上樣量為50 μg，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、一抗、二抗孵育后，加入BeyoECL Plus混合發(fā)光液，用Clinx Science Instrucment成像系統(tǒng)采集圖像.利用Image J軟件進(jìn)行半定量分析，目的蛋白與β?actin條帶的灰度值之比即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量.

3　結(jié)果

3.1各組小鼠肺組織病理學(xué)變化 HE染色后利用光學(xué)顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)正常組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡壁比較薄，沒有炎性細(xì)胞滲出（圖1A），而LPS模型組小鼠的肺組織可見到肺泡壁增厚的現(xiàn)象，中性粒細(xì)胞滲出，富含蛋白質(zhì)的水腫液滲出，微血栓形成，透明膜形成（圖1B），尼莫地平干預(yù)組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞較模型組明顯減輕，與正常組相比肺泡壁略增厚，較模型組相比中性粒細(xì)胞滲出減少，富含蛋白質(zhì)的水腫液滲出減少，有少量紅細(xì)胞滲出（圖1C）.

圖1　肺組織病理學(xué)變化

3.2各組小鼠肺組織濕干重比（W／D） 如圖2所示，LPS模型組小鼠的肺組織濕干重比較對(duì)照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而尼莫地平干預(yù)組較模型組明顯降低（P＜0.01），其中1 h和3 h的作用時(shí)間點(diǎn)差異不明顯.

圖2　肺組織濕干重比變化

3.3各組小鼠血清中TNF?α水平 圖3顯示了尼莫地平對(duì)LPS誘導(dǎo)炎癥小鼠血清中TNF?α的影響.LPS組在注射LPS 1 h和3 h后TNF?α含量顯著性升高，與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而尼莫地平干預(yù)組在注射尼莫地平后較LPS組TNF?α顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）.

圖3　尼莫地平對(duì)LPS誘導(dǎo)炎癥小鼠血清中TNF?α的影響

3.4各組小鼠血清中IL?1β水平 尼莫地平對(duì)LPS誘導(dǎo)炎癥小鼠血清中IL?1β的影響如圖4所示：LPS組在注射LPS1 h和3 h后IL?1β含量顯著性升高，與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而尼莫地平干預(yù)組在注射尼莫地平后IL?1β含量顯著下降，與LPS組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）.

圖4　尼莫地平對(duì)LPS誘導(dǎo)炎癥小鼠血清中IL?1β的影

3.5P38MAPK蛋白磷酸化水平 如圖5所示，LPS模型組小鼠肺組織P38MAPK蛋白磷酸化水平較對(duì)照組升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），尼莫地平干預(yù)后發(fā)現(xiàn)肺組織的P38MAPK蛋白磷酸化水平，相對(duì)于模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）.

圖5　尼莫地平對(duì)LPS誘導(dǎo)炎癥小鼠肺組織P38MAPK蛋白表達(dá)的影響

3.6MKK3／6蛋白磷酸化水平 LPS模型組小鼠肺組織MKK3／6蛋白磷酸化水平，與正常對(duì)照組相比升高，而尼莫地平干預(yù)后該蛋白的磷酸化水平較模型組明顯降低（圖6），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），

圖6　尼莫地平對(duì)LPS誘導(dǎo)炎癥小鼠肺組織MKK3／6蛋白表達(dá)的影響

3.7肺組織核轉(zhuǎn)錄因子ATF?2表達(dá) 如圖7所示，LPS模型組肺組織ATF?2蛋白磷酸化水平較對(duì)照組升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），尼莫地平干預(yù)組較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）.

圖7　尼莫地平對(duì)LPS誘導(dǎo)炎癥小鼠肺組織ATF?2蛋白表達(dá)的影響

4　討論

炎癥反應(yīng)是維持組織穩(wěn)態(tài)、預(yù)防感染的重要保護(hù)措施，但失控的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致機(jī)體組織發(fā)生損傷［4］.ALI是全身炎癥反應(yīng)在肺部的表現(xiàn)，也是機(jī)體內(nèi)正常炎癥反應(yīng)過度表達(dá)造成的結(jié)果［5］.在LPS誘導(dǎo)的ALI氣道炎癥反應(yīng)中，LPS通過巨噬細(xì)胞膜表面上的Toll樣受體4（toll?like receptor 4，TLR4）激活巨噬細(xì)胞［6－7］.巨噬細(xì)胞一旦被激活，將會(huì)釋放多種細(xì)胞因子，其中最主要的是TNF?α和IL?1β.此類細(xì)胞因子的產(chǎn)生不僅可放大炎癥反應(yīng)，同時(shí)可以導(dǎo)致肺組織在內(nèi)的靶器官中多種效應(yīng)細(xì)胞的活化，募集并釋放活性氧代謝產(chǎn)物和蛋白酶，引起細(xì)胞損害［8］.在ALI的發(fā)病中，這些炎性細(xì)胞、炎癥介質(zhì)以及細(xì)胞因子的廣泛參與起到關(guān)鍵性作用.

LPS通過與TLR4結(jié)合可以激活下游信號(hào)通路，將細(xì)胞外刺激信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)［9］.絲裂原活化蛋白激酶（mitogen?activated protein kinases，MAPKs）信號(hào)通路與LPS引起的TLR4信號(hào)通路激活有關(guān)［10］.研究表明MAPKs在炎癥和氧化應(yīng)激的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用［11］，包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal?regulated kinas，ERK）信號(hào)通路、P38MAPK信號(hào)通路、JNK／SAPK通路.各種應(yīng)激、細(xì)胞生長(zhǎng)因子和炎性細(xì)胞因子均可激活P38MAPK信號(hào)［12］.P38 MAPK由MAP激酶（MKK）3／6選擇性地激活，同時(shí)MAPK信號(hào)通路可以激活下游的信號(hào)蛋白，將刺激信號(hào)傳導(dǎo)至核內(nèi)，活化核內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)錄活化因子（ATF）?2、c?jun、c?fos等，這些因子可以調(diào)節(jié)其與轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白的結(jié)合，進(jìn)而影響DNA的轉(zhuǎn)錄活性［13－14］.

本研究利用LPS腹腔注射建立ALI模型，誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)炎癥性肺損傷.癥狀與文獻(xiàn)報(bào)道相一致，肺組織切片利用HE染色進(jìn)行觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)有ALI的基本特征，如中性粒細(xì)胞聚集、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞破壞、肺水腫現(xiàn)象，符合ALI疾病特點(diǎn).ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清中細(xì)胞因子含量、肺W／D比均顯著增高，與正常對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)P38MAPK信號(hào)通路蛋白磷酸化水平在LPS模型組中表達(dá)升高，說明該通路被激活.應(yīng)用尼莫地平干預(yù)后，肺損傷明顯減輕，炎癥因子釋放減少，蛋白磷酸化水平下降，說明抑制了P38MAPK信號(hào)通路的激活.由于LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化主要由核內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)錄活化因子調(diào)控的炎癥反應(yīng)來調(diào)節(jié)，所以我們通過測(cè)量其水平檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子是否被尼莫地平抑制.在本研究中尼莫地平有效抑制了ATF?2的活化.

終上所述，尼莫地平應(yīng)用于LPS誘導(dǎo)的ALI后，可降低血清中的炎性細(xì)胞因子，減輕肺組織炎癥損傷，抑制P38MAPK信號(hào)通路蛋白以及核轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，因此尼莫地平可能通過P38MAPK信號(hào)通路來發(fā)揮對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI的保護(hù)作用.

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RegulatingeffectsofNimodipineonthe P38MAPK signaling pathways in lung tissue of ALI mice induced by lipopolysaccharide

CHEN Xu?Ru，ZHANG Jia?Yan
The Fifth People's Hospital of Shanghai，F(xiàn)udan University，Shanghai 200240，China；The Eighth People's Hospital of Shanghai，Shanghai 200235，China

AIM：To study the protective effects of nimodipine on the acute lung injury（ALI）induced by the bacterial endotoxin lipopolysaccharide（LPS）and its regulation on the P38MAPK signaling pathways.METHODS：ALI animal model was built by intraperitoneal injection of LPS to induced inflammatory immune injury.Forty healthy mice were divided into three groups：control group（n＝8），LPS model group（n＝16）and Nimodipine group（n＝16）.Mice were intraperitoneally injected with LPS（5 mg／kg）except control group mice.Nimodipine group mice were given nimodipine（20 mg／kg）half hour before LPS treatment.Control group mice were given equal saline.The lung tissue was collected after 1 h and 3 h of LPS treatment.HE staining was used to observe the pathological changes of lung tissue.TNF?α and IL?1β in the serum were measured by ELISA；MKK3／6，p38MAPK，ATF?2 and its phosphorylation were evaluated by Western blotting.RESULTS：The results showed that Nimodipine could reduce lung injury，decrease TNF?α and IL?1β in serum，and inhibit phosphorylation of P38MAPK，MKK3／6 and ATF?2.CONCLU?SION：Nimodipine could alleviate the LPS?induced inflammatory injury，probably associating with decrease of inflammatory factors level in serum and inhibition of P38MAPK activation in lung tissue.

Nimodipine；acute lung injury；inflammatory factors；P38MAPK signal pathways

R644

A

2095?6894（2015）10?001?04

2015－07－20；接受日期：2015－08－08

陳旭如.本科，住院醫(yī)師.研究方向：呼吸內(nèi)科.Tel：021?64308151－8499 E?mail：cxr1128＠163.com

張佳彥.E?mail：zjy＿wayne＠163.com