遼藁本及其混偽品DNA條形碼鑒定研究

李 雪，秦祎婷，董學會

（中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術(shù)學院，北京 100193）

遼藁本及其混偽品DNA條形碼鑒定研究

李 雪，秦祎婷，董學會*

（中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術(shù)學院，北京 100193）

文章對比分析不同DNA條形碼候選序列對遼藁本及其混偽品的鑒定能力。以遼藁本（Ligusticum jeholense Nakai et Kitag）、新疆藁本（Conioselinum vaginatium）及藁本混偽品白芷（Angelica dahurica）、石防風（Peucedanum terebinthaceum）、當歸（Radix angelica sinensis）為鑒定材料，提取總DNA，利用4對候選序列（NrITS、ITS2、accD和trnH-psbA）分別進行PCR擴增，產(chǎn)物進行雙向測序。得到的序列采用CodonCode Aligner V2.06進行拼接，Clustal X2.1進行多序列比對，MEGA 5.0計算K-2-P距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育NJ樹。結(jié)果表明，NrITS和ITS2序列能夠鑒別遼藁本與新疆藁本及其他混偽品。

遼藁本；混偽品；DNA條形碼；分子鑒定

網(wǎng)絡出版時間2015-4-30 14:44:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150430.1444.013.html

李 雪,秦祎婷,董學會.遼藁本及其混偽品DNA條形碼鑒定研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2015,46(5):22-31.

Li Xue,Qin Yiting,Dong Xuehui.DNA barcode identification ofLigusticum jeholenseand its adulterants[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(5):22-31.(in Chinese with English abstract)

遼藁本（Ligusticum jeholense Nakai et Kitag）是傘形科藁本屬多年生草本植物，以干燥根和根莖入藥，具有抑菌、散風、祛寒、祛濕止痛功效，主治風寒頭痛、寒濕腹痛、風濕肢節(jié)痹痛等癥[1-2]。目前市場上常用的藁本藥材主要來自遼藁本、藁本（Ligusticum sinense）和新疆藁本（Conioselinum vaginatium），還混有部分同科不同屬的其他植物。這些植物形態(tài)特征極為相似，容易被混淆，充當遼藁本或藁本藥材進行出售。而《中華人民共和國藥典（一部）》收載的只有遼藁本和藁本，新疆藁本由于藥理活性和化學成分區(qū)別于遼藁本，僅限當?shù)亓曈?。因此，遼藁本種質(zhì)資源及中藥材的正確鑒定工作十分重要。目前，關(guān)于遼藁本鑒定研究主要集中在形態(tài)[3-6]、顯微觀察[7]、色譜和光譜分析[8-9]等方面，鮮少有關(guān)于DNA分子鑒定方面研究報道。而分子鑒定技術(shù)作為研究藥用植物分類和親緣關(guān)系的重要手段，已經(jīng)在多種藥用植物分類鑒定中得到運用。其中，DNA條形碼序列在多種藥用植物鑒定中獲得較好結(jié)果。

DNA條形碼（DNA barcoding）由加拿大動物學家Hebert等2003年首次提出[10]，已在動物物種分類研究中應用廣泛，其中，CO1基因被認為是動物界中的標準DNA條形碼。近年來，DNA條形碼亦被植物分類學家廣泛應用于植物物種分類和遺傳進化研究中。但由于植物在進化過程中容易發(fā)生雜交、網(wǎng)狀進化等情況，同一基因在不同類群的進化速率不同，使植物DNA條形碼研究進展較為緩慢。迄今為止，仍未發(fā)現(xiàn)可作為植物通用條形碼的DNA序列。2009年，生命條形碼聯(lián)盟植物工作組（CBOL）推薦以rbcL+matK組成的復合序列作為整個植物界DNA條形碼序列，但其在物種水平的鑒定成功率僅為72%[11]。陳士林等研究藥用植物及其近緣種的4 800個物種的6 600個樣本，發(fā)現(xiàn)ITS2（Internal transcribed spacer 2）序列鑒定成功率高達90%以上[12-13]。高婷等運用ITS2序列對藁本及其常見混偽品骨緣當歸、長鞘當歸、細葉藁本、澤芹等進行分子鑒定，認為ITS2序列可用作藥材藁本的混偽品鑒定[14]?，F(xiàn)在，ITS2序列已被廣泛應用于菊科、蓼科、爵床科等藥用植物的分子鑒定研究中[15-17]。

本研究使用在植物鑒定上應用較多的ITS2、NrITS、trnH-psbA、accD四種DNA條形碼候選序列對遼藁本及其混偽品石防風、當歸和白芷進行鑒定研究，考查四種DNA條形碼候選序列的鑒定能力，以期為進一步的遼藁本種屬DNA分子鑒定研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

植物研究材料均為實地采集，并經(jīng)中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術(shù)學院董學會教授鑒定。具體樣品信息見表1。

表1 采集材料的樣品信息Table 1 Source of samples for Ligusticum jeholense and adulterants

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA提取

取新鮮植物葉片組織100 mg，加入液氮充分研磨。利用植物基因組DNA提取試劑盒（RransGen Biotech Co，China）提取總DNA。

1.2.2 PCR擴增和測序

試驗采用ITS2、NrITS、trnH-psbA、accD 4種序列引物對樣品DNA進行擴增。

反應體系為25 μL，分別包含2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL、5×PCR buffer 5 μL、10 μmol·L-1引物各0.25 μL、2.5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.4 μL和模板DNA約30 ng。引物對序列和擴增程序參照文獻[18-19]，詳見表2。

擴增完成后在凝膠成像分析儀下檢測擴增結(jié)果，然后將擴增成功的PCR產(chǎn)物送至Life technolo?gies公司北京合成部測序。

表2 引物序列和擴增程序Table 2 Primers sequence and amplification procedure

1.2.3 序列拼接和數(shù)據(jù)分析

測序峰圖采用序列拼接軟件CodonCode Align?er V2.06（CodonCode Co.,USA）校對拼接，去除低質(zhì)量序列區(qū)及引物區(qū)，進行多序列比對并人工校驗，得到完整的各DNA條形碼序列。利用DNA?STAR軟件分析得到各DNA序列長度及各堿基組成，利用Clustal X2.1進行多序列比對，用MEGA 5.0計算K-2-P距離，對不同序列種間、種內(nèi)變異大小進行比較，構(gòu)建其系統(tǒng)進化樹，評價不同序列的鑒定能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特點分析

運用MEGA 5.0等軟件分析得到的各序列特點見表3，序列比對結(jié)果見圖1～4。結(jié)果表明，4條考查序列長度為297～721 bp不等，其中trnH-psbA序列最短，為297～325 bp，NrITS序列最長，為712～721 bp。各序列GC含量各不相同，NrITS序列GC含量最高，達到53.65%～55.88%，trnH-psbA序列GC含量最低，為33.00%～35.20%。

表3 4條序列的序列特點Table 3 Sequencing information

2.1.1 NrITS序列特點分析

由表3可知，NrITS序列長度為712～721 bp， GC含量為53.65%～55.88%，具體序列比對結(jié)果見圖1。

圖1 不同產(chǎn)地遼藁本及其混偽品NrITS序列比對結(jié)果Fig.1NrITS blast results forLigusticum jeholenseand adulterants

2.1.2 ITS2序列特點分析

從表3中可以看出，ITS2序列長度為474～479 bp，GC含量為53.67%～55.46%，具體序列比對結(jié)果見圖2。

2.1.3 accD序列特點分析

從表3中可以看出，accD序列長度為395～409 bp，GC含量為38.31%～39.75%，具體序列比對結(jié)果見圖3。

2.1.4 trnH-psbA序列特點分析

從表3中可以看出，trnH-psbA序列長度為297～325 bp，GC含量為33.00%～35.20%，具體序列比對結(jié)果見圖4。

圖2 不同產(chǎn)地遼藁本及其混偽品ITS2序列比對結(jié)果Fig.2 ITS2 blast results for Ligusticum jeholense and adulterants

圖3 不同產(chǎn)地遼藁本及其混偽品accD序列比對結(jié)果Fig.3 accD blast results for Ligusticum jeholense and adulterants

圖4 不同產(chǎn)地遼藁本及其混偽品trnH-psbA序列比對結(jié)果Fig.4trnH-psbA blast results forLigusticum jeholenseand adulterants

2.2 種內(nèi)種間遺傳距離考查

利用MEGA 5.0軟件對試驗測得序列進行遺傳距離分析，采用K-2-P模型計算遺傳距離。分析結(jié)果表明，NrITS序列平均種間距離為0.046，ITS2序列平均種間距離為0.037，accD序列平均種間距離為0.004，trnH-psbA序列平均種間距離為0.030。各DNA條形碼序列的遺傳距離差異矩陣見表4～7。

表4 遼藁本及其混偽品NrITS序列的遺傳距離差異矩陣Table 4 Differences matrix of NrITS genetic distances for Ligusticum jeholense and adulterants

表5 遼藁本及其混偽品ITS2序列的遺傳距離差異矩陣Table 5 Differences matrix of ITS2 genetic distances for Ligusticum jeholense and adulterants

表6 遼藁本及其混偽品accD序列的遺傳距離差異矩陣Table 6 Differences matrix of accD genetic distances for Ligusticum jeholense and adulterants

表7 遼藁本及其混偽品trnH-psbA序列的遺傳距離差異矩陣Table 7 Differences matrix of trnH-psbA genetic distances for Ligusticum jeholense and adulterants

由表4～7可知，NrITS序列種間遺傳距離差異明顯，種內(nèi)遺傳距離差異較大；ITS序列種間遺傳距離差異較大，種內(nèi)遺傳距離差異較??；trnH-ps?bA序列種間遺傳距離差異明顯，種內(nèi)遺傳距離差異較大；accD序列種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離差異均不明顯。

2.3 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育NJ樹

利用MEGA 5.0對各樣品NrITS、ITS2、accD 和trnH-psbA序列進行分析，使用NJ法構(gòu)建基于Kimura 2-parameter模型算法的系統(tǒng)聚類分析樹，結(jié)果見圖5～8。

圖5 不同產(chǎn)地遼藁本及其混偽品NrITS序列的系統(tǒng)發(fā)育NJ樹Fig.5 NJ tree constructed with NrITS sequences for Ligusticum jeholense and adulterants

圖6 不同產(chǎn)地遼藁本及其混偽品ITS2序列的系統(tǒng)發(fā)育NJ樹Fig.6 NJ tree constructed with ITS2 sequences for Ligusticum jeholense and adulterants

圖7 不同產(chǎn)地遼藁本及其混偽品accD序列的系統(tǒng)發(fā)育NJ樹Fig.7 NJ tree constructed with accD sequences for Ligusticum jeholense and adulterants

圖8 不同產(chǎn)地遼藁本及其混偽品trnH-psbA序列的系統(tǒng)發(fā)育NJ樹Fig.8 NJ tree constructed with trnH-psbA sequences for Ligusticum jeholense and adulterants

由圖5～8可知，由NrITS、ITS2、accD和trnH-psbA序列構(gòu)建的聚類進化樹均明顯分為兩個部分。在NrITS序列的NJ樹中，藥植所遼藁本與白山遼藁本聚為一支，伊春遼藁本和清源遼藁本聚為一支，然后再與新疆藁本聚為一支為第一部分；石防風、白芷和當歸均各自一支，然后聚為一支為第二部分。在ITS2序列的NJ樹中，遼藁本和新疆藁本分支情況同NrITS序列，但石防風與當歸聚為一支后再與白芷聚為另外一支。與NrITS、ITS2序列不同的是，在accD序列的NJ樹中，伊春遼藁本和白山遼藁本聚為一支后，再與新疆藁本、當歸、藥植所遼藁本和白芷聚為一支；清源遼藁本和石防風聚為另外一支。在trnH-psbA序列的NJ樹中，不同產(chǎn)地遼藁本與新疆藁本聚為一支后，再與白芷和當歸聚為一支為第一部分；石防風單獨一支為第二部分。

因此，利用NrITS和ITS2序列能夠鑒別遼藁本與新疆藁本及其他混偽品種；trnH-psbA序列不能區(qū)分遼藁本與新疆藁本，但對鑒別藁本混偽品有參考價值；而accD序列不能鑒別遼藁本與新疆藁本及其他混偽品種。

3 討論與結(jié)論

本試驗使用四種候選條形碼序列（NrITS、ITS2、accD和trnH-psbA）對不同產(chǎn)地遼藁本、新疆藁本及其混偽品石防風、當歸、白芷的DNA進行擴增、測序，并對得到的序列進行拼接、比對和聚類分析，發(fā)現(xiàn)NrITS和ITS2序列能較好地區(qū)分遼藁本、新疆藁本及其混偽品，trnH-psbA序列對區(qū)分遼藁本及其混偽品有一定價值。這與高婷等認為ITS2序列能夠反映出藁本及其易混偽品間差異的結(jié)論相吻合，增加NrITS和trnH-psbA兩種序列用于遼藁本及其易混偽品的分子鑒別。結(jié)論可為遼藁本規(guī)范化種植過程中種源篩選和鑒定提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

但由于本試驗分析樣本數(shù)量較少，NrITS、ITS2以及trnH-psbA三種序列能否作為遼藁本種屬間鑒定條形碼序列，尚需后續(xù)大量樣本研究驗證。而accD序列對遼藁本及其混偽品鑒定效果不理想，后續(xù)研究意義不大。

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DNA barcode identification ofLigusticum jeholenseand its adulterants

LI Xue,QIN Yiting,DONG Xuehui(School of Agriculture and Biotechnology,China Agricultural University,Beijing 100193,China)

The article contrastively analyzed the abilities of different DNA barcodes to identify Ligusticum jeholenseand its adulterants.Total DNA was extracted fromLigusticum jeholense,Conioselinum vaginatiumand its adulterantsAngelica dahurica,Peucedanum terebinthaceumandRadix angelica sinensis. Their NrITS,ITS2,accD and trnH-psbA DNA sequences were amplified and PCR products were sequenced. Sequences assembly were performed using the CodonCode Aligner V2.06 and blasted using the Clustal X2.1.The Kimura 2-Parameter(K2P)distances were calculated using software MEGA 5.0 and then Neighbor-Joining(NJ)tree was constructed.The results indicated that the NrITS and ITS2 sequences could be effectively used as DNA barcodes for identifyingLigusticum jeholenseand its adulterants.

Ligusticum jeholense;adulterant;DNA barcode;molecular identification

S155.2＋6

A

1005-9369（2015）05-0022-10

2014-12-18

國家科技支撐計劃（2006BAI06A15-2）

李雪（1984-），女，博士研究生，研究方向為種子分子生物學。E-mail：rebeccayou@163.com

董學會，教授，博士生導師，研究方向為種子分子生物學。E-mail：xuehuidong@cau.edu.cn