內(nèi)皮素-1在不同月齡大鼠神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)

張春燕，叢 梅，楊 文，于曉紅，徐洪濤

內(nèi)皮素-1在不同月齡大鼠神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)

張春燕，叢 梅，楊 文，于曉紅，徐洪濤

目的 研究內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)在不同月齡大鼠神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)變化，為探討紋狀體易卒中機(jī)制、揭示腦血管病發(fā)病機(jī)制提供參考資料。方法 應(yīng)用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物免疫組化染色法觀測1～2個(gè)月齡、6～7個(gè)月齡及＞24個(gè)月齡3組共36只Wistar大鼠神經(jīng)細(xì)胞ET-1的表達(dá)。結(jié)果 隨大鼠月齡增加，ET-1在紋狀體、顳葉皮質(zhì)、海馬區(qū)表達(dá)增加，＞24個(gè)月齡組紋狀體、顳葉皮質(zhì)、海馬區(qū)ET-1陽性反應(yīng)強(qiáng)度與其他2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，同月齡組紋狀體、顳葉皮質(zhì)、海馬區(qū)的ET-1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論 ET-1在神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)，可能與老年人易發(fā)生腦血管病有關(guān)。

神經(jīng)細(xì)胞；內(nèi)皮素-1；老化；大鼠

衰老是導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病如帕金森病、阿爾茨海默病的主要危險(xiǎn)因素，也是腦血管病發(fā)病率、病死率明顯增加的主要因素，而紋狀體又是腦血管意外最常發(fā)生的部位。內(nèi)皮素(endothelin，ET)是Yanagisawa等[1]從豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中分離純化出的一種具有強(qiáng)烈縮血管作用的生物活性肽。ET不能透過血腦屏障，而研究表明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中都有ET、ET mRNA的廣泛分布，故大腦中出現(xiàn)的ET只能是腦組織自身合成的[2]。ET-1作為強(qiáng)血管收縮因子，對(duì)于維持血管穩(wěn)態(tài)有著重要的作用[3]。ET-1表達(dá)異常與高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、心血管病、腫瘤的發(fā)生有關(guān)[4-6]。內(nèi)皮素還與腦血管痙攣、腦缺血、腦梗死、腦出血的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。觀察隨著大鼠月齡增加ET-1在神經(jīng)細(xì)胞的變化規(guī)律，為揭示紋狀體易發(fā)生卒中的原因、臨床治療及腦血管病發(fā)病機(jī)制提供佐證。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 健康Wistar大鼠36只，雌雄不拘，按不同月齡分3組，第1組為1～2個(gè)月齡大鼠(80～120 g)、第2組為6～7個(gè)月齡大鼠(300～400 g)、第3組為＞24個(gè)月齡大鼠(450～600 g)，每組各12只。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 用1%戊巴比妥鈉(3 mg/kg)腹腔注射麻醉，主動(dòng)脈插管，生理鹽水灌注至流出液體變清亮，然后立即注入4℃的Zambonis固定液，灌注后將大鼠放入4℃冰箱1～2 h，取出腦組織移入20%蔗糖中，直至樣本沉入瓶底。冰凍切片(30 μm)收集在0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)備用。每個(gè)樣本隨機(jī)選取8張切片，根據(jù)鏈霉親和素-生物素復(fù)合物試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)染色步驟進(jìn)行染色。鼠抗ET-1工作濃度1∶1 000(美國Sigma公司)；二抗生物素化抗鼠免疫球蛋白G，工作濃度1∶100(武漢博士德生物工程有限公司)；三抗鏈霉親和素-生物素復(fù)合物，工作濃度1∶100(武漢博士德生物工程有限公司)。對(duì)照組用正常山羊血清替代一抗反應(yīng)。

1.2.2 染色 免疫組化染色判斷標(biāo)準(zhǔn)，無著色為陰性、淡黃色為弱陽性、棕黃色為中等陽性、深棕黃色為強(qiáng)陽性。所有切片，每張切片隨機(jī)選5個(gè)高倍視野(×200)進(jìn)行攝片，計(jì)數(shù)免疫組化標(biāo)志定位準(zhǔn)確的陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例并記分。細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核陽性細(xì)胞數(shù)占所有細(xì)胞數(shù)的25%以下為±、25%～49%為＋、50%～75%為＋＋、75%以上為＋＋＋，依次記為1、2、3、4分；染色強(qiáng)度弱陽性、中等陽性、強(qiáng)陽性依次以±、＋、＋＋表示，記為1、2、3分；最后計(jì)算2種記分的乘積。表達(dá)強(qiáng)度評(píng)分和觀察結(jié)果評(píng)分的乘積為表達(dá)強(qiáng)度。陽性表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)為表達(dá)強(qiáng)度綜合得分＞4分[7]。除了檢測紋狀體ET-1免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞外，還對(duì)顳葉皮質(zhì)、海馬區(qū)ET-1反應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行了檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 10.0軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

ET-1主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，隨著大鼠月齡的增加，紋狀體陽性細(xì)胞增多(圖1)，ET-1的表達(dá)也隨之增強(qiáng)。同月齡的大鼠腦不同部位ET-1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。顳葉皮質(zhì)、海馬區(qū)ET-1的表達(dá)也隨著大鼠月齡的增加而增加。＞24個(gè)月齡組不同部位ET-1陽性反應(yīng)強(qiáng)度與其他2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

表1 3組大鼠神經(jīng)細(xì)胞ET-1免疫組化染色強(qiáng)度分值(分)

圖1 不同月齡大鼠紋狀體ET-1的表達(dá)(蘇木素染色，×400)

3 討論

ET-1由大內(nèi)皮素經(jīng)內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶裂解合成，是ET家族的主要成員之一，也是至今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)，且作用持久。ET-1主要通過結(jié)合相應(yīng)受體而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，其中ET-1 A受體對(duì)ET-1有較強(qiáng)的選擇性，主要分布于血管平滑肌，ET-1由內(nèi)皮細(xì)胞釋放后通過與ET-1 A受體的持久結(jié)合而調(diào)節(jié)血管的收縮[8]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理、生理情況下腦組織內(nèi)、腦脊液內(nèi)或血漿內(nèi)的ET-1增高，其受體表達(dá)也上調(diào)。提示ET系統(tǒng)不僅是正常生理情況下重要的血管活性肽及神經(jīng)調(diào)節(jié)肽，還在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理、生理過程中起重要作用。

老化是正常的生理過程，隨著大鼠月齡增加，紋狀體ET-1陽性反應(yīng)強(qiáng)度增加，提示ET-1合成增加。導(dǎo)致ET-1陽性反應(yīng)強(qiáng)度增加的原因很多，腦組織缺氧可能是主要因素之一。在正常情況下，ET-1可被內(nèi)皮細(xì)胞降解。內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接可阻止ET-1從管腔內(nèi)漏出。因此，機(jī)體的自身調(diào)節(jié)機(jī)制可以維持ET的基礎(chǔ)釋放，適應(yīng)生理功能的需要。ET-1在動(dòng)脈高壓、慢性腎病、糖尿病患者以及實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统磉_(dá)。隨著增齡，ET-1在老年人循環(huán)血液中增加[9]，與本研究結(jié)果相一致。纖溶酶原激活物抑制劑、血管緊張素Ⅱ、凝血酶、自分泌刺激、pH減低會(huì)刺激ET-1釋放，雌激素、心房利鈉多肽、前列腺素、一氧化氮能抑制ET-1分泌，ET-1又可通過ET-1 A受體刺激血小板聚集促進(jìn)血栓形成[10]。老齡大鼠神經(jīng)細(xì)胞ET-1表達(dá)增多，可能與老齡導(dǎo)致動(dòng)脈硬化，腦組織相對(duì)血供減少有關(guān)。老年人出現(xiàn)腦血管病后組織損傷及臨床表現(xiàn)較年輕者重，可能與老齡ET-1在神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)增加有關(guān)；在腦外傷、腦血管病基礎(chǔ)上，ET-1過量合成和釋放，又進(jìn)一步加重了腦組織的損傷。因此，減少ET-1對(duì)于減輕腦組織損傷有著重要意義。促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)也能調(diào)節(jié)ET-1水平[11]，缺氧與增齡能影響 ET-1及EPO的相互作用。在缺氧情況下EPO增多可減少ET-1的釋放。Sch?fer等[12]發(fā)現(xiàn)阻斷培養(yǎng)的老年大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞ET-1 A受體后可增強(qiáng)EPO mRNA及EPO受體活性從而降低ET-1分泌。因此，老年人適當(dāng)補(bǔ)充EPO有可能減少增齡所致ET-1增加。有研究證實(shí)，體育鍛煉能增加內(nèi)皮一氧化氮釋放從而減少ET-1生物活性，進(jìn)而延遲老化過程[13-14]，老年女性增加鍛煉可減少循環(huán)血液的ET-1水平[15]，鍛煉也可預(yù)防隨年齡增加導(dǎo)致血壓生理性增高[13]。因此，老年人適當(dāng)增加鍛煉，對(duì)于減少ET-1分泌、預(yù)防腦血管病有著重要意義。

[1]Yanagisawa M，Kurihara H，Kimura S，et al.A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells[J].Nature，1988，332(6163):411-415.

[2]許超.內(nèi)皮素與神經(jīng)系統(tǒng)疾病[J].全科醫(yī)學(xué)臨床與教育，2008，6(4):307-309.

[3]Lenna S，Chrobak I，F(xiàn)arina GA，et al.HLA-B35 and dsRNA induce endothelin-1 via activation of ATF4 in human microvascular endothelial cells[J].PLoS One，2013，8(2): e56123.

[4]Kawanabe Y，Nauli SM.Endothelin[J].Cell Mol Life Sci，2011，68(2):195-203.

[5]Shao D，Park JE，Wort SJ.The role of endothelin-1 in the pathogenesis of pulmonary arterial hypertension[J].Pharmacol Res，2011，63(6):504-511.

[6]Tsui JC，Shi-Wen X.Endothelin-1 in peripheral arterial disease:a potential role in muscle damage[J].Pharmacol Res，2011，63(6):473-476.

[7]Spiller R.Recent advances in understanding the role of serotonin in gastrointestinal motility in functional bowel disorders:alterations in 5-HT signalling and metabolism in human disease[J].Neurogastroenterol Motil，2007，19 Suppl 2:25-31.

[8]El Assar M，Angulo J，Vallejo S，et al.Mechanisms involved in the aging-induced vascular dysfunction[J].Front Physiol，2012，3:132.

[9]Donato AJ，Gano LB，Eskurza I，et al.Vascular endothelial dysfunction with aging:endothelin-1 and endothelial nitric oxide synthase[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，297(1):H425-H432.

[10]Touyz RM，Lariviere R，Schiffrin EL.Endothelin influences pHi of human platelets through protein kinase C mediated pathways[J].Thromb Res，1995，78(1):55-65.

[11]Bachmann S，Le Hir M，Eckardt KU.Co-localization of erythropoietin mRNA and ecto-5′-nucleotidase immunoreactivity in peritubular cells of rat renal cortex indicates that fibroblasts produce erythropoietin[J].J Histochem Cytochem，1993，41(3):335-341.

[12]Sch?fer R，Mueller L，Buecheler R，et al.Interplay between endothelin and erythropoietin in astroglia:the role in protection against hypoxia[J].Int J Mol Sci，2014，15(2): 2858-2875.

[13]Barton M.Prevention and endothelial therapy of coronary artery disease[J].Curr Opin Pharmacol，2013，13(2):226-241.

[14]Franklin SS，Pierce GL.Cardiorespiratory fitness and the attenuation of age-related rise in blood pressure:an important role for effective primordial prevention[J].J Am Coll Cardiol，2014，64(12):1254-1256.

[15]Maeda S，Tanabe T，Miyauchi T，et al.Aerobic exercise training reduces plasma endothelin-1 concentration in older women[J].J Appl Physiol(1985)，2003，95(1):336-341.

The expression of endothelin-1 in nerve cells in rat of different age

ZHANG Chunyan1，CONG Mei2，YANG Wen1，YU Xiaohong1，XU Hongtao1
(1.Department of Geriatric Gastroenterology，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；2.Wanshou Road Navy Sanatorium，Beijing 100853，China)

Objective To study the expression changes of endothelin-1(ET-1)on rat nerve cells so as to provide

for further understanding the etiology and pathogenesis of cerebrovascular disease.Methods Three different age groups of rats(1—2，6—7，＞24 months old) were studied and determined by streptaridin biotin peroxidase complex technique.Results The expression of ET-1 on striatus，cortex and hippocappus increased with age.Expression of ET-1 in these portions in＞24 months rats was significantly higer than that in the other 2 groups(P＜0.01).There was no significant difference on the expression of ET-1 in the different portions of the same group(P＞0.05).Conclusion The increased expression of ET-1 of neurons with aging may have important implications for the pathogenesis of cerebrovascular disease in the elderly.

Nerve eclls；Endothelin-1；Aging；Rat

R363

A

2095-3097(2015)04-0213-03

10.3969/j.issn.2095-3097.2015.04.006

2015-02-15 本文編輯:徐海琴)

全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金(CHJ12L024)

100048北京，海軍總醫(yī)院干部消化科(張春燕，楊 文，于曉紅，徐洪濤)；100853北京，海軍萬壽路干休所(叢 梅)

徐洪濤，E-mail:xchun3＠sohu.com