具有學(xué)科特色的消化系疾病生物樣本庫(kù)

竇建華，唐光波，李 曾，姜孟孟，陳 錚，胡思雋，趙青川，吳開春，聶勇戰(zhàn)

·轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)·

具有學(xué)科特色的消化系疾病生物樣本庫(kù)

竇建華，唐光波，李 曾，姜孟孟，陳 錚，胡思雋，趙青川，吳開春，聶勇戰(zhàn)

隨著個(gè)體化治療和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的發(fā)展，生物樣本庫(kù)作為臨床與科研轉(zhuǎn)化間的橋梁，越來越受到人們的重視，以至越來越多的單位投入到了生物樣本庫(kù)的建設(shè)大潮中。但在眾多的建設(shè)中也出現(xiàn)了一些問題和隱患，包括缺乏統(tǒng)一的建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)(求量忘了質(zhì))、資源利用率不足(求存不求用)。在消化系疾病生物樣本庫(kù)建設(shè)過程中建立了嚴(yán)格可行的質(zhì)量體系，質(zhì)量控制方案貫穿于樣本的收集、整理、入庫(kù)、應(yīng)用以及有計(jì)劃地隨機(jī)抽檢等各個(gè)環(huán)節(jié)，以保證樣本的質(zhì)量；同時(shí)，消化系疾病生物樣本庫(kù)也把樣本的信息建設(shè)作為重要建設(shè)內(nèi)容，除了讓樣本具備完整的臨床信息，還重視隨訪信息與科研數(shù)據(jù)信息的更新完善與反饋收集。西京消化病醫(yī)院初步建立了較高“綜合質(zhì)量”的消化系疾病生物樣本庫(kù)，滿足了臨床、科學(xué)研究的許多需求，發(fā)揮了消化系疾病臨床與科研轉(zhuǎn)化的橋梁作用。

生物樣本庫(kù)；消化系疾病；質(zhì)量控制；信息化管理；隨訪信息

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)疾病的發(fā)病機(jī)制有了深刻的認(rèn)識(shí)，但是卻不能很好地應(yīng)用于臨床預(yù)警、診斷和治療，一個(gè)非常重要的原因是基礎(chǔ)研究和臨床研究沒有建立真正的交流和合作[1]。不可再生的生物樣本既包含了豐富的基礎(chǔ)研究信息(研究所需樣本實(shí)體及遺傳信息)，也包含了臨床研究的信息(疾病進(jìn)展和療效)，一直擔(dān)當(dāng)著基礎(chǔ)研究和臨床研究的橋梁和紐帶作用，而備受關(guān)注。2011年，國(guó)家十二五規(guī)劃明確將“系統(tǒng)建設(shè)臨床樣本資源庫(kù)”列為“支撐醫(yī)學(xué)發(fā)展”的重要工作之一[2]。

第3次全國(guó)死因回顧抽樣調(diào)查報(bào)告顯示，我國(guó)的惡性腫瘤發(fā)病率和病死率均高于全球平均水平，并且以年3%～5%的速度遞增[3]，特別是食管癌、胃癌、肝癌和結(jié)直腸癌等消化系腫瘤的病死率占腫瘤死亡總數(shù)的40.75%[4]。因此，消化系腫瘤的治療與研究尤為重要。而高標(biāo)準(zhǔn)的生物樣本是臨床研究與基礎(chǔ)研究的寶貴資源，是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的基石[5]。為了滿足臨床與科學(xué)研究的需要，西京消化病醫(yī)院立足于醫(yī)院豐富的臨床資源，成立了消化系疾病生物樣本庫(kù)，目標(biāo)是研究以消化系腫瘤為主的消化系疾病的發(fā)病機(jī)制，探討有效的預(yù)警、早期診斷和臨床治療方案以及降低其發(fā)病率和病死率。

1 簡(jiǎn)介

消化系疾病生物樣本庫(kù)依托單位為第四軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院，醫(yī)院專注于消化系疾病的臨床治療與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，是集臨床、教學(xué)、科研為一體的綜合醫(yī)院，連續(xù)5年在全國(guó)消化病醫(yī)療系統(tǒng)中排名第1。首先，豐富的臨床資源是消化系疾病生物樣本庫(kù)建立的基礎(chǔ)。醫(yī)院擁有門急診、內(nèi)鏡中心、手術(shù)室、監(jiān)護(hù)室、臨床檢驗(yàn)室、病理室、10個(gè)病區(qū)、臨床試驗(yàn)基地，年門急診量40余萬人次，各部門的高效、充分協(xié)作保證了樣本的高質(zhì)量。其次，強(qiáng)大的科研與轉(zhuǎn)化能力是消化系疾病生物樣本庫(kù)運(yùn)行的“發(fā)動(dòng)機(jī)”。醫(yī)院擁有腫瘤生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承擔(dān)國(guó)家級(jí)科研項(xiàng)目104項(xiàng)，總資助金額達(dá)11 630萬元。大量課題的承擔(dān)與獲得為樣本庫(kù)的運(yùn)行指明了建設(shè)方向，也提供了充足的經(jīng)費(fèi)支持(圖1)。

圖1 以應(yīng)用轉(zhuǎn)化為主導(dǎo)的建設(shè)模式

醫(yī)院消化系疾病生物樣本庫(kù)經(jīng)過幾年的發(fā)展，已初步形成標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的樣本采集、儲(chǔ)存和管理體系，同時(shí)取得了一定的成果。

消化系疾病生物樣本庫(kù)有先進(jìn)的樣本采集、轉(zhuǎn)移、儲(chǔ)存和自動(dòng)化的溫控系統(tǒng)等硬件以及專業(yè)的樣本庫(kù)管理軟件。在存儲(chǔ)設(shè)備方面配置了低溫冰箱、超低溫冰箱、超大型液氮罐，總計(jì)可存儲(chǔ)容量達(dá)45萬份，現(xiàn)完整保存臨床消化系疾病相關(guān)的樣本達(dá)136 584份，高危流行病區(qū)疾病普查樣本46 697份(來自于胃癌高發(fā)地甘肅省武威市的29個(gè)抽樣調(diào)查點(diǎn))。所有樣本均有完善的臨床資料或流行病學(xué)調(diào)查信息，以及不斷更新的隨訪信息。

2 高質(zhì)量特色樣本庫(kù)

具有完整臨床信息的高質(zhì)量生物樣本是21世紀(jì)個(gè)體化醫(yī)療時(shí)代的關(guān)鍵，是系統(tǒng)研究多種生命組學(xué)的基礎(chǔ)[6]，是樣本庫(kù)建設(shè)的核心內(nèi)容。西京消化病醫(yī)院消化系疾病生物樣本庫(kù)在樊代明院士“精品戰(zhàn)略”思想的指導(dǎo)下，始終把樣本的質(zhì)量放到第1位。樣本庫(kù)把實(shí)體樣本的質(zhì)量與樣本對(duì)應(yīng)的信息質(zhì)量2個(gè)方面同時(shí)進(jìn)行建設(shè)。

2.1 質(zhì)量管理體系 為了保證樣本的質(zhì)量，西京消化病醫(yī)院消化系疾病生物樣本庫(kù)參照國(guó)內(nèi)外的標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)指南[7-10]，建立了符合消化系疾病特色的樣本處理與質(zhì)量控制的最佳實(shí)踐方案；已建立和完善了質(zhì)量手冊(cè)、程序文件、作業(yè)指導(dǎo)書和記錄等4個(gè)層次的系統(tǒng)文件；制定了包括樣本采集、運(yùn)輸、處理、儲(chǔ)存、進(jìn)出庫(kù)等操作流程質(zhì)量控制方案，以及樣本抽檢質(zhì)量控制方案。

2.1.1 樣本采集和處理 臨床樣本的采集是在不額外增加患者痛苦、不影響病理診斷和臨床檢查的前提下進(jìn)行。采集過程嚴(yán)格執(zhí)行本樣本庫(kù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序。樣本庫(kù)主要收集血液樣本和組織樣本。

2.1.1.1 血液 血液樣本從采集到入庫(kù)的整個(gè)過程在2 h內(nèi)完成。血液采集在護(hù)士站或檢驗(yàn)科，用抗凝管和促凝管分別采集血液各1管，然后由專門的工作人員在最短的時(shí)間內(nèi)送至樣本庫(kù)，室溫放置30 min后，2 500 g 15 min離心，多管分裝(4小管2大管)，入庫(kù)保存血樣(短期存放的樣本在－80℃冰箱中保存，長(zhǎng)期或者重要的樣本存放在液氮中保存)，整個(gè)血樣處理過程在生物安全柜中完成。

2.1.1.2 組織 組織樣本在整個(gè)切取、轉(zhuǎn)運(yùn)、入庫(kù)過程都在低溫下進(jìn)行，組織樣本從熱缺血到完成分裝、入庫(kù)的整個(gè)過程，時(shí)間控制在30 min內(nèi)。組織離體后置于碎冰上進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，切取在低溫操作臺(tái)上進(jìn)行，然后速凍在液氮中；樣本整理入庫(kù)過程在干冰上進(jìn)行。組織樣本在手術(shù)切除后，剔除網(wǎng)膜、脂肪無用組織，用無菌、無RNA酶的生理鹽水沖洗樣本，去除樣本上的黏液、血液。為了避免交叉污染，使用消毒滅菌后的器材。按照先正常組織后癌組織的順序取材。組織樣本分裝存儲(chǔ)于RNAlater與液氮中；組織塊的大小標(biāo)準(zhǔn)為液氮凍存的樣本質(zhì)量0.5～1 g、RNAlater凍存組織大小約5 mm×5 mm×5 mm。

2.1.2 存儲(chǔ)條件控制 樣本存儲(chǔ)條件的穩(wěn)定是樣本質(zhì)量的基本保障。樣本庫(kù)配備了自動(dòng)化溫控監(jiān)測(cè)系統(tǒng)對(duì)室溫、低溫冰箱、超低溫冰箱、液氮罐進(jìn)行24 h持續(xù)監(jiān)控，監(jiān)測(cè)頻率為30 min 1次；如監(jiān)測(cè)參數(shù)有異常，系統(tǒng)將自動(dòng)報(bào)警并發(fā)送短信通知樣本庫(kù)工作人員，工作人員在1 h內(nèi)到達(dá)，現(xiàn)場(chǎng)處理并填寫意外情況說明書。每天工作人員早晚2次手工記錄溫度和液氮液位的變化情況于記錄本上。

2.1.3 樣本抽檢 樣本特別是腫瘤樣本的異質(zhì)性有時(shí)會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過少，長(zhǎng)期存儲(chǔ)也會(huì)帶來不可避免的降解，所以對(duì)樣本進(jìn)行抽檢也是保證樣本質(zhì)量的重要手段。樣本的質(zhì)量主要包括腫瘤組織樣本的癌細(xì)胞比例、DNA/RNA完整性、蛋白質(zhì)完整性等。樣本庫(kù)參照行業(yè)公認(rèn)的檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)，制定了自己的質(zhì)量檢測(cè)體系。

根據(jù)病種類型、樣本類型、儲(chǔ)存方式等的不同，采用隨機(jī)原則，每月隨機(jī)抽取2%的樣本，每年年初抽取0.1%的樣本進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。

2.1.3.1 DNA/RNA質(zhì)量檢測(cè) 主要檢測(cè)DNA/ RNA的濃度、純度及完整性。用美國(guó)Thermo公司的Kingfisher Flex磁珠分選系統(tǒng)，全自動(dòng)化提取樣本中的DNA/RNA，然后用分光光度法檢測(cè)DNA/RNA的濃度和純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA/RNA的完整性。同時(shí)在這部分樣本中，按照實(shí)驗(yàn)需要，聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)特定基因(如癌胚抗原、3-磷酸甘油醛脫氫酶)的完整性。

2.1.3.2 蛋白質(zhì)質(zhì)量檢測(cè) 選擇特定的抗體，用Western Blot和酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定技術(shù)檢測(cè)樣本中蛋白的相應(yīng)抗原，結(jié)合蛋白質(zhì)譜分析來評(píng)估蛋白質(zhì)的質(zhì)量。

2.1.3.3 組織樣本的質(zhì)量檢測(cè) 樣本庫(kù)主要采用蘇木素和伊紅染色方法評(píng)估組織中腫瘤細(xì)胞的百分比。隨機(jī)抽取樣本，交由消化病理加工處理，按照國(guó)際腫瘤基因組協(xié)作研究腫瘤組織樣本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(腫瘤部分大于80%質(zhì)量良好、小于65%為不合格樣本)，來進(jìn)行衡量，記錄到樣本信息中。

2.2 信息的完整性 消化系疾病生物樣本庫(kù)的信息包含了樣本庫(kù)位信息、基本臨床信息、隨訪信息、出入庫(kù)使用情況及課題應(yīng)用反饋數(shù)據(jù)。樣本庫(kù)因?yàn)槭褂昧藢I(yè)的樣本庫(kù)管理軟件，樣本庫(kù)位信息及出入庫(kù)情況結(jié)合軟件可輕松完成；主要工作在于完善基本臨床信息和隨訪信息。樣本庫(kù)的基本臨床信息包括樣本對(duì)應(yīng)的患者各項(xiàng)生化檢查、影像資料、病理信息及治療情況；隨訪信息包括患者的疾病復(fù)發(fā)情況、生存狀況、預(yù)后等。

詳細(xì)的隨訪資料是保證樣本“含金量”的重要條件，是樣本轉(zhuǎn)化、發(fā)揮價(jià)值的“催化劑”。本樣本庫(kù)重視樣本的信息建設(shè)，尤其是隨訪資料的完善和更新。樣本庫(kù)有專門人員全職從事樣本庫(kù)對(duì)應(yīng)患者的隨訪和數(shù)據(jù)庫(kù)更新。完善的患者疾病復(fù)發(fā)和存活情況相關(guān)隨訪信息極大地支撐了醫(yī)院臨床診療及科學(xué)研究的進(jìn)行。在臨床通過隨訪獲知的治療結(jié)果為評(píng)估臨床治療方案提供了最終標(biāo)準(zhǔn)，有助于診療方案的完善和改進(jìn)；在科學(xué)研究上為課題中總生存期及無病生存期的計(jì)算提供了數(shù)據(jù)，是課題具備臨床意義的重要證據(jù)。

本樣本庫(kù)支持了大量的研究課題，提供的樣本在使用后，要求使用者反饋樣本數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)包括樣本DNA/RNA完整性、組織樣本腫瘤細(xì)胞百分比基本質(zhì)量信息，還包括該課題產(chǎn)生的特有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。這些反饋信息有利于改進(jìn)樣本庫(kù)的建設(shè)，同時(shí)也有利于被以后的研究者使用，避免了不必要的浪費(fèi)，提高了樣本的利用率。

對(duì)樣本信息進(jìn)行有計(jì)劃的抽檢。每月按10%的比例隨機(jī)抽取新入庫(kù)的樣本，檢查樣本信息的完整性和準(zhǔn)確性，主要檢查新入庫(kù)的樣本臨床和基礎(chǔ)信息是否正確和完整、是否隨訪及隨訪信息是否輸入樣本庫(kù)、條碼是否有錯(cuò)貼和漏貼、虛擬庫(kù)與實(shí)體庫(kù)的位置是否一一對(duì)應(yīng)、相關(guān)的記錄是否完整。

3 可持續(xù)發(fā)展

生物樣本庫(kù)作為臨床、基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究基石和重要推動(dòng)力[11]，只有得到充分的應(yīng)用，才是一個(gè)充滿活力的生物樣本庫(kù)，才是富有強(qiáng)勁生命力的可持續(xù)長(zhǎng)久健康發(fā)展的生物樣本庫(kù)[12]。

在樣本庫(kù)的支持下，醫(yī)院取得了一定的成績(jī)。初步建立了Immuo-Plex胃癌多標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)系統(tǒng)，運(yùn)用該系統(tǒng)，驗(yàn)證了一系列新胃癌標(biāo)志物候選分子，并從中篩選得到了6個(gè)變化明顯的候選標(biāo)志物，旨在開發(fā)我國(guó)第1個(gè)胃癌血清學(xué)多變量標(biāo)志物診斷試劑盒；初步建立了微流控檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)與傳統(tǒng)方法相比，具有無創(chuàng)傷、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)；建立了系統(tǒng)的胃癌多藥耐藥組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開發(fā)了新型耐藥組學(xué)數(shù)據(jù)整合分析算法——Penetrating-Rank算法，能夠高通量預(yù)測(cè)新的耐藥關(guān)鍵分子。同時(shí)，在樣本庫(kù)的保障下，發(fā)表了論文(影響因子≥5分)47篇，其中臨床相關(guān)文章34篇；獲批專利34項(xiàng)，國(guó)際專利6項(xiàng)，其中轉(zhuǎn)讓專利6項(xiàng)、總轉(zhuǎn)讓經(jīng)費(fèi)約1 806萬元；獲得了2012年陜西省科學(xué)技術(shù)一等獎(jiǎng)，取得了良好的科研效益和社會(huì)效益。

消化系疾病生物樣本庫(kù)建立了包括胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、食管癌、間質(zhì)瘤、腸病共6個(gè)組織分庫(kù)，涵蓋了重點(diǎn)研究的所有消化系疾病。在樣本庫(kù)建設(shè)過程中始終把保證樣本實(shí)體的質(zhì)量、信息質(zhì)量尤其是隨訪信息質(zhì)量作為建設(shè)的基本要求，已建立規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)操作程序及嚴(yán)格的質(zhì)量控制體系來規(guī)范樣本庫(kù)的整個(gè)建設(shè)過程。

西京消化病醫(yī)院消化系疾病生物樣本庫(kù)無論在樣本數(shù)量上還是質(zhì)量上都有力地推進(jìn)了醫(yī)院臨床研究、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展；同時(shí)，臨床研究及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究反過來又為樣本庫(kù)指明了建設(shè)方向，提出了要求，也提供了支持。這種“以收集促研究，以研究促收集”的模式，是本樣本庫(kù)持續(xù)運(yùn)行和發(fā)展的保證。

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The biobank of digestive diseases with subject characteristics

DOU Jianhua，TANG Guangbo，LI Zeng，JIANG Mengmeng，CHEN Zheng，HU Sijun，ZHAO Qingchuan，WU Kaichun，NIE Yongzhan
(State Key Laboratory of Cancer Biology，the Fourth Military Medical University，Xijing Hospital of Digestive Diseases，Xi'an Shanxi 710032，China)

Along with the development of individualized treatment and translational medicine，biological sample library as a clinical and scientific research into bridge attracted more and more attention，and has caused more and more units into the biological sample library construction tide. But there are also some problems and hidden dangers in the construction，including lack of a unified standard of construction(for quantity)，and lack of resource utilization(not to use).Strictly feasible quality system is established in the digestive system disease，biological sample library construction process and quality control scheme through sample collection，sorting，storage，application and there are plans to random sampling and so on each link to ensure sample quality；at the same time，digestive system diseases biological sample library also put sample information construction as an important content of construction，in addition with complete clinical information with particular emphasis on follow-up information and scientific research data update and feedback collection.Xijing digestive disease hospital initially established higher comprehensive quality of digestive disease disease biological sample library，to meet the needs of the clinical and scientific research，and to do a good job in digestive disease for clinical and scientific research into the bridge.

Biological sample database；Digestive system diseases；Quality control；Information management；Follow up information

R－05；R57

A

2095-3097(2015)04-0199-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2015.04.002

2015-05-22 本文編輯:徐海琴)

710032陜西西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院腫瘤生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(竇建華，唐光波，李 曾，姜孟孟，陳 錚，胡思雋，趙青川，吳開春，聶勇戰(zhàn))

趙青川，E-mail:zhaoqc＠fmmu.edu.cn；吳開春，E-mail: kaicwu＠fmmu.edu.cn；聶勇戰(zhàn)，E-mail:yongznie＠fmmu.edu.cn