鹽酸異丙腎上腺素誘發(fā)大鼠心肌缺血性纖維化后肝臟損傷的拉曼光譜分析

黃宇欣，高海成，劉 凱，苗春生

（1.吉林大學(xué)理論化學(xué)研究所 理論化學(xué)計(jì)算國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130012；2.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院物理教研室，吉林 長(zhǎng)春 130012；3.吉林大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021）

國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)［1－4］報(bào)道：皮下注射大劑量鹽酸異丙腎上腺素（isoprenaline hydrochloride，Iso）會(huì)導(dǎo)致大鼠急性心肌缺血損傷，這種損傷與人的急性心肌缺血較為相似，可作為評(píng)價(jià)藥物抗心肌缺血的動(dòng)物模型。而Iso在誘發(fā)心肌缺血性纖維化的同時(shí)，能否造成其他臟器的損傷，目前國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道？如果造成其他臟器的損傷，可通過(guò)什么方法檢測(cè)。近年來(lái)，拉曼光譜正逐漸出現(xiàn)在人們的視野。國(guó)外文獻(xiàn)［5－8］報(bào)道：拉曼光譜在聚合物、生物分子、蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)物等方面得到了廣泛的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)利用Iso誘發(fā)大鼠心肌缺血模型，通過(guò)紫外和拉曼光譜分析Iso誘發(fā)心肌缺血性纖維化后肝臟的損傷，旨在為今后藥物對(duì)各器官損傷的檢測(cè)提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、主要試劑和儀器 雄性 Wistar大鼠20只，合格證號(hào)：SCXK（吉）2008－0005，體質(zhì)量180～220g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Iso注射液由上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn)。MD－100自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)），徠卡4215切片機(jī)（德國(guó)），Olympus PM－10AO全自動(dòng)顯微照相裝置（日本Olympus公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及建模 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組及Iso組（包括4h、24h及1周組）。除對(duì)照組使用生理鹽水刺激外，其余各組一次性皮下多點(diǎn)皮下注射Iso 15mg·kg－1。通過(guò)HE染色評(píng)價(jià)模型。

1.3 肝臟和心臟組織的HE染色 分別在注射Iso后4h、24h和1周時(shí)剖腹取大鼠心臟，經(jīng)10%甲醛固定30min，常規(guī)石蠟包埋。用二甲苯脫臘10min，用100%乙醇置換二甲苯2min、95%乙醇置換1min、80%乙醇置換1min及用75%乙醇置換1min，蒸餾水沖洗2min。蘇木素染色5min，自來(lái)水沖洗。鹽酸乙醇分化30s。自來(lái)水浸泡15min。伊紅染2min。常規(guī)脫水，透明，封片，拍照。

1.4 紫外吸收光譜 心臟和肝臟組織經(jīng)蛋白提取液勻漿后，通過(guò)UV－2450光譜在200～1000nm處檢測(cè)勻漿液的吸收，由此分析心臟和肝臟蛋白吸收譜（nm）。

1.5 拉曼光譜 肝臟組織經(jīng)蛋白提取液勻漿后，通過(guò)拉曼光譜在1400～1700cm－1處檢測(cè)勻漿液的吸收，由此分析肝臟蛋白吸收譜（cm－1）的變化。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌細(xì)胞病理學(xué) 對(duì)照組大鼠心肌排列整齊，橫紋清晰，胞核明顯，無(wú)細(xì)胞腫脹。Iso－24h組大鼠心肌出現(xiàn)較多的壞死，局限于心內(nèi)膜下。Iso－1周組大鼠心肌出現(xiàn)界限清晰、多發(fā)散在壞死灶，壞死灶內(nèi)有旺盛的成纖維細(xì)胞增生，并可見(jiàn)一定量的膠原纖維［9］。見(jiàn)圖1（插頁(yè)七）。

2.2 紫外檢測(cè)心臟組織成分 對(duì)照組出現(xiàn)3個(gè)明顯的吸收峰，波長(zhǎng)分別是0.891、0.799和0.433，其吸收峰值分別是539、576和972nm。Iso－24h組峰位移動(dòng)，吸收峰值向左或向右移動(dòng)1個(gè)單位。Iso－1周組由1個(gè)峰位趨于正常。見(jiàn)圖2。

2.3 紫外檢測(cè)肝臟組織成分 對(duì)照組大鼠肝臟組織標(biāo)本在968nm檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)有較明顯的吸收峰，其吸收值是0.615；Iso－4h組吸收峰位未改變；Iso－24h組峰位是966nm，與對(duì)照組比較，移動(dòng)了2個(gè)單位。Iso－1周組吸收峰位逐漸趨于平穩(wěn)。見(jiàn)圖3。

圖2 各組大鼠心臟組織的紫外吸收光譜結(jié)果Fig.2 Results of UV absorption spectrometry in heart tissue of rats in various groups

圖3 各組大鼠肝組織紫外光譜結(jié)果Fig.3 Results of UV absorption spectrometry in liver tissue of rats in various groups

2.4 拉曼光譜法檢測(cè)肝組織成分 對(duì)照組大鼠肝臟組織在1589nm處可見(jiàn)明顯的吸收峰。Iso－24h組在1590nm處見(jiàn)明顯的吸收峰；Iso－1周組未檢測(cè)到相同的峰位。見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠肝臟組織拉曼光譜結(jié)果Fig.4 Results of Raman spectra in liver tissue of rats in various groups

2.5 各組大鼠肝組織病理學(xué) 肝組織病理學(xué)觀察可見(jiàn)：對(duì)照組大鼠肝小葉界限清晰，無(wú)壞死灶；Iso各組大鼠肝小葉內(nèi)有灶性壞死區(qū)，肝細(xì)胞出現(xiàn)水樣變性；隨著Iso注射時(shí)間的延長(zhǎng)，肝臟病變程度加重。見(jiàn)圖5（插頁(yè)七）。

3 討 論

肝臟是人體最大的內(nèi)臟器官，質(zhì)量為1.0～1.5kg［10］。肝臟由專門的細(xì)胞組成（如肝細(xì)胞、枯氏細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞），各類細(xì)胞在肝臟中均有重要的作用［11－12］。人體中最重要的代謝是蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪代謝，膽汁分泌、膽紅素的排泄、礦物質(zhì)（鐵）和糖原、細(xì)菌和抗原等均在肝臟代謝中起作用［13－14］。心肌缺血是一種非常普通的心血管疾病。當(dāng)發(fā)生缺血時(shí)，是否同時(shí)會(huì)造成肝臟的損傷已引起關(guān)注。

拉曼光譜技術(shù)是一種非破壞性的指紋成像技術(shù)?，F(xiàn)已在材料、化工、生物醫(yī)學(xué)和環(huán)保等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。而根據(jù)拉曼光譜技術(shù)所發(fā)展起來(lái)的表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)（surface－enhanced Raman spectra，SERS）也在溶劑檢測(cè)中得到了普遍的應(yīng)用［9］。拉曼光譜可在不損傷細(xì)胞的條件下實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)變化，亦可獲得細(xì)胞的 “分子指紋”，具有敏感性高、實(shí)時(shí)檢測(cè)、活樣品不需固定或染色和不損傷細(xì)胞等眾多特點(diǎn)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者將拉曼光譜應(yīng)用于細(xì)胞藥物處理、細(xì)胞水平疾病診斷、單細(xì)胞生命活動(dòng)監(jiān)測(cè)、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)等研究，取得了不同程度的進(jìn)展。隨著研究的深入，拉曼光譜分析技術(shù)必將在細(xì)胞、癌癥研究、細(xì)胞分選和藥物篩選等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［8］。在本實(shí)驗(yàn)中，HE染色結(jié)果顯示：Iso在給藥后4和24h誘發(fā)了大鼠心肌缺血，且24h時(shí)出現(xiàn)較多的點(diǎn)狀壞死，在1周時(shí)出現(xiàn)纖維組織增生和纖維化；而紫外光譜分析顯示：心肌蛋白譜右移1個(gè)單位，這些結(jié)果說(shuō)明Iso誘發(fā)了大鼠心肌的損傷；而Iso誘發(fā)心肌缺血性纖維化的同時(shí)，紫外光譜分析顯示肝臟蛋白譜右移1個(gè)單位；HE染色結(jié)果則顯示肝臟組織中細(xì)胞堆積，成分增多；拉曼光譜分析顯示：肝臟組織蛋白譜在4h～1周內(nèi)右移3～6個(gè)單位，這些結(jié)果說(shuō)明Iso誘發(fā)心肌損傷的同時(shí)，誘發(fā)了肝臟的損傷。

綜上所述，Iso在4h、24h和1周誘發(fā)心肌損傷的同時(shí)，亦可能引發(fā)了肝臟的損傷。利用拉曼光譜檢測(cè)更為敏感，紫外吸收譜也可檢測(cè)到其損傷的相應(yīng)特征。

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