鄰苯二甲酸二丁酯對雄性小鼠生殖系統(tǒng)的脂質過氧化作用

吳冠宇，王 碩，劉 艷，趙淑華

（吉林大學公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學教研室，吉林 長春 130021）

鄰苯二甲酸酯（phthalates，PAEs）是一種運用廣泛的工業(yè)化學增塑劑，在受熱、磨損等條件下，PAEs會與塑料逐步分離擴散到環(huán)境或生物體內［1－3］。PAEs的毒性遠高于三聚氰胺，被列為主要的環(huán)境雌激素，是世界上最廣泛存在的污染物［4－6］。作為PAEs中應用最為廣泛的一種，鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）在土壤、大氣和水體中均有檢出［7］。其中，低相對分子質量的DBP多用于香水、化妝品等產(chǎn)品的生產(chǎn)加工；而高相對分子質量的DBP常添加于醫(yī)療器械、地板膠和墻面漆等產(chǎn)品中，用以增強材料的柔韌性［8－9］。我國已將 DBP確定為環(huán)境優(yōu)先控制污染物［10］。有研究［11－14］表明：DBP 對雄性動物生殖和發(fā)育的影響包括精子生成障礙、睪酮合成量下降、胚胎畸形、睪丸標志酶活性下降和體質量減輕等，但其對生物體的干擾機制研究尚不充分。本實驗選擇小鼠為研究對象，通過檢測雄性小鼠生殖系統(tǒng)抗氧化酶的活性，觀察低劑量DBP對雄性小鼠生殖系統(tǒng)的脂質過氧化作用，探討其對小鼠生殖系統(tǒng)毒性作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 健康雄性ICR小鼠40只，體質量（18±2）g，購自吉林大學基礎醫(yī)學院動物中心提供，動物合格證號：SYXK（吉）2007－0011，動物合格證號：SCXK（吉）2007－0003。小鼠于實驗室適應性飼養(yǎng)3d后，隨機分組分籠飼養(yǎng)，自由攝入食物和飲水，飼養(yǎng)溫度18～24℃，相對濕度為50%～70%。DBP購自天津市光復精細化工研究所生產(chǎn)（純度99.5%、相對密度1.0463～1.0475g·mL－1），食用玉米油購自中糧食品營銷有限公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH－Px）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。TD5A臺式自動平衡離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司），WS2－261－79型電熱恒溫水溫箱（北京醫(yī)療設備廠），722型光柵分光光度計（上海第三分析儀器廠制造），F(xiàn)A1004型上皿電子天平（上海天平儀器廠）。

1.2 動物分組和給藥 將40只雄性ICR小鼠隨機分為對照組和200、400、800mg·kg－1DBP組，每組10只。以玉米油溶解DBP，對照組小鼠灌胃給予玉米油溶劑，其他各組小鼠根據(jù)半數(shù)致死量（LD50）為8000mg·kg－1分別灌胃給予200、400和800mg·kg－1DBP，每天1次，連續(xù)給藥2和4周，每天觀察小鼠一般狀況、飲食情況和活動情況、每天測量小鼠的體質量，根據(jù)體質量調整給藥量［15］。

1.3 觀察指標 分別于染毒后2和4周脫臼處死各組5只小鼠。取睪丸，稱質量，去被膜，冰浴下勻漿，離心，取上清。計算小鼠睪丸質量與體質量比值，即睪丸的臟器系數(shù)。按照試劑盒說明書操作，測定各組小鼠睪丸組織中MDA水平和SOD、GSH－Px活性。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。各組小鼠睪丸組織中MDA水平和SOD、GSH－Px活性以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 各組小鼠體質量和臟器系數(shù) 染毒2周后，各染毒組小鼠體質量無明顯變化（P＞0.05）；染毒4周后，800mg·kg－1DBP組小鼠體質量明顯高于對照組和200mg·kg－1DBP組（P＜0.05）。染毒期間，小鼠體質量變化見表1。染毒2周后，各組小鼠睪丸臟器系數(shù)無明顯變化（P＞0.05）；染毒4周后，400和800mg·kg－1DBP組小鼠睪丸臟器系數(shù)明顯低于對照組和200mg·kg－1DBP組（P＜0.05）。見表2。

表1 各組小鼠體質量Tab.1 Body weights of mice in various groups（，m／g）

表1 各組小鼠體質量Tab.1 Body weights of mice in various groups（，m／g）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs 200mg·kg－1DBP group.

Group Body weight（week）0 2 4 Control 22.19±1.3629.40±3.3232.70±3.32 DBP（mg·kg－1）200 23.25±1.2929.41±2.7832.34±3.07400 24.07±1.4530.90±2.1734.59±2.52800 23.74±1.6630.28±2.3635.71±2.39＊△

表2 各組小鼠睪丸臟器系數(shù)Tab.2 Testis organ coefficient of mice in various groups（n＝5，，η／%）

表2 各組小鼠睪丸臟器系數(shù)Tab.2 Testis organ coefficient of mice in various groups（n＝5，，η／%）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs 200mg·kg－1DBP group.

Group Testis organ coefficient（week）2 4 Control 0.73±0.07 0.72±0.09 DBP（mg·kg－1）200 0.69±0.07 0.71±0.04400 0.73±0.11 0.62±0.07＊△800 0.64±0.02 0.60±0.05＊△

2.2 各組小鼠睪丸組織勻漿中MDA水平 染毒2周后，400和800mg·kg－1DBP組小鼠睪丸組織中MDA水平明顯高于對照組和200mg·kg－1DBP組（P＜0.05）；200mg·kg－1DBP組MDA水平明顯低于對照組（P＜0.05）。染毒4周后，200mg·kg－1DBP組MDA水平明顯低于對照組（P＜0.05），400和800mg·kg－1DBP組MDA水平均明顯高于對照組（P＜0.05），800mg·kg－1DBP組MDA水平明顯高于200和400mg·kg－1DBP組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠睪丸組織勻漿中MDA水平Tab.3 MDA levels in testis tissue homogenate of mice in various groups ［n＝5，，mB／（mmol·g－1）prot］

表3 各組小鼠睪丸組織勻漿中MDA水平Tab.3 MDA levels in testis tissue homogenate of mice in various groups ［n＝5，，mB／（mmol·g－1）prot］

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs 200mg·kg－1DBP group；#P＜0.05 vs 400mg·kg－1DBP group.

Group MDA level in testis homogenate（week）2 4 Control 0.77±0.08 1.25±0.15 DBP（mg·kg－1）200 0.69±0.06＊ 1.04±0.11＊400 0.95±0.08＊△ 1.43±0.12＊△800 1.12±0.07＊△# 1.80±0.13＊△#

2.3 各組小鼠睪丸組織勻漿中SOD活性 染毒2周后，200mg·kg－1DBP組SOD活性明顯高于對照組（P＜0.05），800mg·kg－1DBP組SOD活性 明 顯 低 于 對 照組（P＜0.05），400和800mg·kg－1DBP組SOD活性低于200mg·kg－1DBP組（P＜0.05）。染毒4周后，800mg·kg－1DBP組SOD活性明顯低于對照組及200、400mg·kg－1DBP組（P＜0.05），其余各組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組小鼠睪丸組織勻漿中SOD和GSH－Px活性Tab.4 Activities of SOD and GSH－Px in testis tissue homogenate of mice in various groups［n＝5，，mB／（mmol·g－1）］

表4 各組小鼠睪丸組織勻漿中SOD和GSH－Px活性Tab.4 Activities of SOD and GSH－Px in testis tissue homogenate of mice in various groups［n＝5，，mB／（mmol·g－1）］

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs 200mg·kg－1DBP group；#P＜0.05 vs 400mg·kg－1DBP group.

Group Activityof SOD（week）Activityof GSH－Px 2 4 Control 6.97±0.93 27.53±2.21 34.72±2.97 17.2 471±0.99 DBP（mg·kg－1）200 7.65±0.64＊ 26.84±2.64 18.26±1.05＊ 25.09±1.96＊400 6.21±0.40△ 25.91±2.67 19.74±1.86＊ 29.42±3.66＊△800 5.67±0.54＊△ 19.69±2.47＊△# 20.02±1.71＊ 24.66±1.38＊#

2.4 各組小鼠睪丸組織勻漿中GSH－Px活性 染毒2周后，各染毒組GSH－Px活性均明顯低于對照組（P＜0.05），各染毒組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。染毒4周后，各染毒組GSH－Px活性均明顯高于對照組（P＜0.05），且400mg·kg－1DBP組GSH－Px活性明顯高于200和800mg·kg－1DBP組（P＜ 0.05）。見表4。

3 討 論

氧自由基的堆積可使細胞膜發(fā)生脂質過氧化反應，產(chǎn)生大量的MDA。MDA作為脂質過氧化物的最終產(chǎn)物，其水平不僅反映出機體內自由基產(chǎn)生的多少，也反映出脂質過氧化的程度，并間接反映細胞受損傷的程度［16］。本實驗中，400和800mg·kg－1DBP組MDA水平明顯高于對照組，并且隨著染毒時間、劑量增加，MDA水平明顯升高，表明DBP可誘導小鼠睪丸內的脂質過氧化；而200mg·kg－1DBP組MDA水平較對照組明顯下降，可能是DBP在誘導脂質過氧化的同時也啟動了抗氧化系統(tǒng)，使機體處于代償狀態(tài)，也可能DBP抑制了體內的氧化還原過程。

正常情況下，機體所產(chǎn)生的自由基會迅速被體內酶系統(tǒng)清除，從而將自由基對機體的毒作用降至較低水平。機體中的抗氧化酶主要有SOD和GSH－Px。SOD為淬滅自由基的酶，并有終止自由基連鎖反應，保護細胞的作用［17－18］。本研究結果顯示：染毒2周時，各染毒組小鼠睪丸組織中SOD活性出現(xiàn)波動，4周時，800mg·kg－1DBP組SOD活性明顯低于對照組及其他各染毒組?？赡?周時DBP產(chǎn)生的過氧化自由基消耗了SOD；而4周時機體產(chǎn)生的酶的量和活性均明顯上升，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，但800mg·kg－1DBP組可能產(chǎn)生的脂質過氧化的量較多而使SOD明顯消耗。

GSH－Px是機體主要的含巰基過氧化酶，其主要是以GSH為基質催化自由基的清除和過氧化物分解。在滅活大量產(chǎn)生的活性氧過程中，GSH－Px可能有過多的消耗而導致其活性下降。王玉邦等［19］在研究DBP對大鼠脂質過氧化的影響時發(fā)現(xiàn)：睪丸組織勻漿中GSH－Px在染毒2周后呈現(xiàn)上升趨勢，800mg·kg－1DBP組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，而在染毒4周后，各組間比較差異無統(tǒng)計學意義。在本實驗中，染毒2周后，各染毒組GSH－Px活性均明顯低于對照組；而染毒4周后，各染毒組GSH－Px活性均明顯升高，與文獻［19］報道的結果不同，這可能與體內的脂質過氧化作用對酶活性產(chǎn)生的干擾有關聯(lián)，也表明DBP對生物體的脂質過氧化作用存在種屬間的差異［20－21］，其機制有待進一步研究。

本實驗中，各組小鼠體質量無明顯差異，但染毒4周后，400和800mg·kg－1DBP組睪丸臟器系數(shù)明顯下降，可能與睪丸組織的氧化損傷有關聯(lián)。

綜上所述，DBP可誘導小鼠睪丸產(chǎn)生脂質過氧化反應，誘導氧化應激，并干擾抗氧化酶的活性，最終可能造成生殖功能損傷。

［1］Bergh C，Torgrip R，Emenius G，et al.Organophosphate and phthalate esters in airand settled dust－a multi－location indoor study ［J］.Indoor Air，2011，21（1）：67－76.

［2］Meeker JD.Exposure to environmental endocrine disrupting compounds and men’s health ［J］.Maturitas，2010，66（3）：236－241.

［3］Kambia N，Dine T，Gressier B，et al.Strong variability of di（2－ethylhexyl）phthalate（DEHP）plasmatic rate in infants and children undergoing 12－h(huán)our cyclic parenteral nutrition［J］.J Parenteral Enteral Nutrit，2013，37（2）：229－235.

［4］武 杰，吳希慶，薩音白剛.鄰苯二甲酸酯類塑化劑毒性研究進展 ［J］.包頭醫(yī)學院學報，2013，29（5）：121－123.

［5］李俊儒，胡繼紅，段 瓊，等.我國鄰苯二甲酸酯類檢測方法研究進展 ［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40（2）：180－183.

［6］秦曉東，袁欣然，李冬梅，等.鄰苯二甲酸酯類的雄性生殖毒性研究進展 ［J］.醫(yī)學研究生學報，2014，27（5）：531－535.

［7］董 蕾，張 明.土壤中鄰苯二甲酸二丁酯研究進展 ［J］.安徽農學通報（上半月刊），2011，17（3）：122－123.

［8］李 蕾，宋乃寧，李海山，等.鄰苯二甲酸酯類毒理學效應及其機制研究進展 ［J］.中國藥理學與毒理學雜志，2014，28（3）：468－474.

［9］Hines CJ，Hopf NB，Deddens JA，et al.Occupational exposure to diisononyl phthalate（DiNP）in polyvinyl chloride processing operations ［J］.Int Arch Occup Envir Health，2012，85（3）：317－325.

［10］王凱榮，崔明明，史衍璽.農業(yè)土壤中鄰苯二甲酸酯污染研究進展 ［J］.應用生態(tài)學報，2013，24（9）：2699－2708.

［11］Yao PL，Lin YC，Richburg JH.Transcriptional suppression of Sertoli cell Timp2in rodents following mono－（2－ethylhexyl）phthalate exposure is regulated by CEBPA and MYC ［J］.Biol Reprod，2011，85（6）：1203－1215.

［12］Pant N，Pant A，Shukla M，et al.Environmental and experimental exposure of phthalate esters：the toxicological consequence on human sperm ［J］.Hum Exp Toxicol，2011，30（6）：507－514.

［13］Erdos Z，Pearson K，Goedken M，et al.Inhibin B response to testicular toxicants hexachlorophene，ethane dimethanesulfonate，di－（n－butyl）－phthalate，nitrofurazone，DL－ethionine，17－alpha ethinylestradiol，2，5－h(huán)exanedione，or carbendazim following short－term dosing in male rats ［J］.Birth Defects Res B Develop Reprod Toxicol，2013，98（1）：41－53.

［14］吳澤穎，朱 燁，李 威，等.塑料制品中鄰苯二甲酸酯類增塑劑的快速篩選 ［J］.塑料科技，2014，42（9）：97－101.

［15］Dobrzyńska MM，Tyrkiel E，Hernik A，et al.The effects of dibutylphthalate on the somatic cells of laboratory mice［J］.Panstwowy Zaklad Higieny，2010，6（11）：13－19.

［16］郭書周，楊自軍，張 才.高鉬低銅對小鼠睪丸組織脂質過氧化作用的影響 ［J］.河南農業(yè)科學，2011，40（11）：145－147.

［17］王 婷，鄭玉建，吳順華，等.砷致小鼠脂質過氧化及鋅、硒對其的干預研究 ［J］.新疆醫(yī)科大學學報，2007，30（6）：551－553.

［18］董 亮，何永志，王遠亮，等.超氧化物歧化酶（SOD）的應用研究進展 ［J］.中國農業(yè)科技導報，2013，15（5）：53－58.

［19］王玉邦，宋 玲，朱正平，等.鄰苯二甲酸二丁酯對大鼠睪丸生化酶及脂質過氧化的影響 ［J］.中華男科學雜志，2004，10（10）：729－733.

［20］白 葦，韓國宏.肝細胞癌的綜合介入治療 ［J］.臨床肝膽病雜志，2013，29（1）：36－37.

［21］陳 潔，姚 敏，姚登福.磷脂酰肌醇蛋白多糖－3介導的信號道路與肝癌靶向治療 ［J］.臨床肝膽病雜志，2013，29（1）：77－80.