P27RF－Rho基因沉默對(duì)肝癌Bel7402細(xì)胞增殖的影響

邢光遠(yuǎn)，謝淑麗，邱 偉，王廣義，呂國悅，郝恩源，李丁洋

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院肝膽胰外科，吉林 長春 130021）

P27RF－Rho（p27kip1releasing factor from Rho A）是新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)控腫瘤細(xì)胞中Rho GTPases（RhoA和RhoC）活性的分子，其由161個(gè)氨基酸組成，在N端有共同的NH2－MGCCY結(jié)構(gòu)。在多種侵襲性腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，主要分布在與基質(zhì)接觸部位細(xì)胞膜的內(nèi)表面［1］。Hoshino等［2］通過大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)：P27RFRho通過與P27kip1結(jié)合，解除P27kip1對(duì)RHO蛋白的抑制，從而活化RHO蛋白。P27kip1和RHO蛋白與肝臟腫瘤的增殖能力有密切關(guān)聯(lián)［2－3］。但P27RF－Rho在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機(jī)制還缺少深入的實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)通過靶向沉默P27RF－Rho基因，觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 人肝癌細(xì)胞株Bel7402和293T細(xì)胞由吉林大學(xué)第一醫(yī)院肝膽胰外科實(shí)驗(yàn)室保 存，U6－shRNA－CMV－copGFP－PGK－Puro－P27RF－Rho基因沉默病毒真核表達(dá)載體 U6－shRNA－CMV－copGFP－PGK－Puro－Scramble及基因沉默病毒真核表達(dá)陰性對(duì)照載體自行構(gòu)建，E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自美國Invetrogen公司。限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶（thermo）、DNA回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒（中國美基生物公司），RT－PCR試劑盒及DNA Marker DL2000（日本Takara公司）。

1.2 RNAi慢病毒載體的構(gòu)建和提取 shRNA引物退火形成帶黏性末端的雙鏈片段，shRNA序列見表1。反應(yīng)體系：shRNA－F（100pmol）2μL、shRNA－R（100pmol）2μL、10× 退火緩沖液2μL、ddH2O 14μL，共20μL。反應(yīng)條件：95℃、5min，72℃、10min，放室溫60min。取5μL加水95μL制備退火產(chǎn)物溶液。

表1 shRNA分析的引物序列Tab.1 Sequences of primers for shRNA analysis

表達(dá)載體的制備：10×buffer 6μL、慢病毒干擾載體10μL、KpnⅠ 1μL、HpaⅠ 1μL、ddH2O 42μL，共60μL。于37℃酶切3h。干擾片段連接入表達(dá)載體：退火產(chǎn)物3μL、載體片段3μL、T4連接酶1μL、10×T4Buffer 2μL、ddH2O 11μL，配成20μL體系，16℃連接過夜，構(gòu)建成U6－shRNA－CMV－copGFP－PGK－Puro 載體。感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化：從－80℃冰箱取出1管100μL E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰上解凍后取10μL重組產(chǎn)物加到感受態(tài)中混勻，靜置30min，42℃水浴熱激1min，再放冰上靜置2min。加預(yù)先復(fù)溫的SOC溶液500μL，放搖床搖1h，涂板過夜37℃培養(yǎng)。挑取數(shù)個(gè)菌落提取質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序引物 LKO5：5′－GACTATCATATGCTTACCGT－3′。

質(zhì)粒的提?。何【号囵B(yǎng)基于1.5μL離心管中，12000r·min－1離心1min，棄上清，吸取培養(yǎng)基重復(fù)離心，棄上清離心，留取少量菌液作為菌種保存，可直接置于－20℃，加Buffer S1懸浮細(xì)菌250μL，懸浮均勻，加Buffer S2250μL溫和充分地上下翻轉(zhuǎn)6次混合均勻，使菌體裂解。加Buffer S3350μL溫和上下翻轉(zhuǎn)，12000r·min－1離心10min。取上清液轉(zhuǎn)移到專用的制備管（2mL），12000r·min－1離心1min，棄濾液。加500μL Buffer W1，12000r·min－1離心1min，棄濾液。加Buffer W2500μL，12000r·min－1離心1min，棄濾液，重復(fù)1次。將制備管置回2mL離心管，12000r·min－1離心1min。將制備管移入新的1.5mL離心管中，加60～80μL Eluent或離子水，室溫1min，12000r·min－1離心1min。移去制備管，將有質(zhì)粒的離心管于4℃或－20℃保存。

1.3 病毒包裝和P27RF－Rho基因沉默效果的檢測(cè)質(zhì)粒DNA與psPAX2和pMD2G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞病毒包裝。第1天：轉(zhuǎn)染前24h，用胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長期的293T細(xì)胞，以含10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1.2×107細(xì)胞／20mL，重新接種于15cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)轉(zhuǎn)染。第2天：500μL無血清培養(yǎng)基稀釋2μg表達(dá)質(zhì)粒＋1.5μg psPAX2＋1.5μg pMD2G；500μL無血清培養(yǎng)基稀釋15μL脂質(zhì)體2000；5min后，將DNA溶液和脂質(zhì)體溶液混合，室溫靜止20min。從6孔板中吸出1mL無血清培養(yǎng)基，然后滴加入1mL質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合物。6～10h后，移除含有DNA－脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基，代之以正常培養(yǎng)液DMED＋10%FBS（從此刻開始計(jì)算時(shí)間）。第3天：轉(zhuǎn)染24h后，熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染效率應(yīng)達(dá)到70%以上。第4天：轉(zhuǎn)染后48和72h分別收獲含病毒的上清，3000r·min－1離心20min，0.45nm 濾膜過濾，去除細(xì)胞沉淀。12000r·min－1離心濃縮細(xì)胞、分裝，－80°C貯存；滴度測(cè)定。

本實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照Bel7402組、陰性對(duì)照Scramble－siRNA組（感染U6－shRNA－CMV－copGFP－PGK－Puro－Scramble）和P27RF－RhosiRNA組（感染 U6－shRNA－CMV－copGFP－PGKPuro－P27RF－Rho），48h 熒光顯微鏡及RT－PCR法檢測(cè)P27RF－Rho基因沉默效果。P27RF－Rho：F，5′－TGTGACCGGAAGGGCTCCT－3′；R，5′－GAGGAGAAGAGCTGTCCAAG－3′，長 度 為580bp。反應(yīng)條件：94℃、5min，94℃、30s，56℃、30s，72℃、1min，35 個(gè)循環(huán)；72℃、10min。

1.4 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞生長曲線 細(xì)胞感染24h后各組細(xì)胞按0.5×104個(gè)／孔密度接種于96孔板，每組接種3孔。共鋪6塊板，置孵育箱中培養(yǎng)。自接種24h后起，每天隨機(jī)取1塊板，進(jìn)行MTT比色實(shí)驗(yàn)，在酶標(biāo)儀上波長570nm處測(cè)定吸光度（A）值，取平均值，連續(xù)6d，繪制生長曲線。以A值表示細(xì)胞生長速度，A值越大，細(xì)胞生長速度越快。

1.5 細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞懸液，進(jìn)行梯度倍數(shù)稀釋，每組細(xì)胞分別以每皿50、100和200個(gè)細(xì)胞的梯度密度分別接種含10mL、37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，置37℃、5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，加4%多聚甲醛固定細(xì)胞5mL固定15min。加適量GIMSA應(yīng)用染色液染色30min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將平皿倒置在顯微鏡計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕剩娇寺?shù)／接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 半定量RT－PCR法檢測(cè)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移相關(guān)基因表達(dá) 提取各組總RNA，半定量RTPCR法檢測(cè)P16、CyclinE、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP－9）、周期素依賴性激酶5（CDK－5）的表達(dá)。以α－tublin為內(nèi)參照。α－tublin、P16、CyclinE、MMP－9、CDK－5的引物序列見表2。反應(yīng)條件：α－tublin，94℃、30s，57℃、30s，72℃、60s，25個(gè)循環(huán)；P16，94℃、30s，60℃、30s，72℃、40s，35個(gè)循環(huán)；CyclinE，94℃、30s，62℃、30s，72℃、1min，35個(gè)循環(huán)；CDK－5，94℃、30s，58℃、30s，72℃、1min，35個(gè)循環(huán)；MMP－9，94℃、30s，63℃、30s，72℃、1min，35個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)下拍照并進(jìn)行灰度值掃描，對(duì)各組mRNA相對(duì)內(nèi)參照水平變化進(jìn)行比較，mRNA相對(duì)表達(dá)水平＝目的基因灰度值／內(nèi)參照灰度值。

表2 α－tublin、P16、CyclinE、MMP－9和CDK－5基因的引物序列Tab.2 Primer sequences ofα－tublin，P16，CyclinE，MMP－9 and CDK－5genes

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組Bel7402細(xì)胞中P27RF－Rho、P16、CyclinE、MMP－9和CDK－5相對(duì)表達(dá)水平以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果觀察 慢病毒感染細(xì)胞72h后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示：陰性對(duì)照ScramblesiRNA組和P27RF－Rho－siRNA組Bel7402細(xì)胞均出現(xiàn)綠色熒光蛋白表達(dá)，病毒感染效果良好。見圖1（插頁六）。

2.2 RT－PCR法檢測(cè) P27RF－Rho mRNA 表達(dá)P27RF－Rho－siRNA組Bel7402細(xì)胞中 P27RF－Rho mRNA表達(dá)水平（0.21±0.10）較空白對(duì)照Bel7402組（0.90±0.23）和陰性對(duì)照 ScramblesiRNA組（0.86±0.18）明顯降低（P＜0.01），各組內(nèi)參照基因α－tublin表達(dá)良好。見圖2。

圖2 RNAi質(zhì)粒沉默Bel7402細(xì)胞中P27RF－Rho mRNA表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of P27RF－Rho mRNA in Bel7402cells silenced by RNAi plasmid

2.3 各組Bel7402細(xì)胞生長曲線 各組細(xì)胞在培養(yǎng)3d時(shí)生長速度無明顯差異，從第4天開始，P27RF－Rho－siRNA組細(xì)胞生長速度明顯低于空白對(duì)照Bel7402組和陰性對(duì)照Scramble－siRNA組（P＜0.05）。見圖3。

2.4 各組細(xì)胞平板克隆形成率 空白對(duì)照Bel7402組和陰性對(duì)照Scramble－siRNA組細(xì)胞的克隆形成率分別為（50.12±3.14）%和（48.87±5.69）%，P27RF－Rho－siRNA組Bel7402細(xì)胞克隆形成率為（15.14±0.78）%，P27RF－Rho－siRNA組Bel7402細(xì)胞克隆形成率明顯低于空白對(duì)照Bel7402組和陰性對(duì)照組（P＜0.01）。見圖4（插頁六）。

圖3 各組Bel7402細(xì)胞生長曲線Fig.3 Growth curves of Bel7402cells in various groups

2.5 各組Bel7402細(xì)胞中P16、CyclinE、MMP－9和CDK－5mRNA 表達(dá)水平P27RF－Rho－siRNA組P16mRNA表達(dá)水平高于空白對(duì)照Bel7402組和陰性對(duì)照組（P＜0.01），而空白對(duì)照Bel7402組與陰性對(duì)照組比較P16mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；P27RF－Rho－siRNA組CyclinE、MMP－9和CDK－5mRNA表達(dá)水平低于空白對(duì)照Bel7402組和陰性對(duì)照Scramble－siRNA組（P＜0.01），而空白對(duì)照Bel7402組與陰性對(duì)照Scramble－siRNA組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3和圖5。

表3 各組Bel7402細(xì)胞中P16、MMP－9、CDK－5和CyclinE mRNA表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of P16，MMP－9，CDK－5，and CyclinE mRNA in Bel7402cells in various groups（n＝3，）

表3 各組Bel7402細(xì)胞中P16、MMP－9、CDK－5和CyclinE mRNA表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of P16，MMP－9，CDK－5，and CyclinE mRNA in Bel7402cells in various groups（n＝3，）

＊P＜0.01compared with Bel7402group；△P＜0.01compared with Scramble－siRNA group.

Group P16 MMP－9 CDK－5 Cy 0.13 Scramble－siRNA 0.18±0.22 0.79±0.17 0.88±0.19 0.81±0.16 P27RF－Rho－siRNA 0.65±0.11＊△ 0.32±0.11＊△ 0.35±0.14＊△ 0.22±0.12＊clinE Bel7402 0.21±0.14 0.83±0.15 0.91±0.21 0.78±△

3 討 論

肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，在我國其死亡率已位于惡性腫瘤的第2位。抑癌基因的低表達(dá)與癌基因的高表達(dá)是患者病情進(jìn)展的重要原因［4］。

圖5 RT－PCR法檢測(cè)各組Bel7402細(xì)胞中P16、CyclinE、MMP－9和CDK－5mRNA表達(dá)電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expressions of P16，CyclinE，MMP－9，and CDK－5mRNA in Bel7402cells in various groups detected by RT－PCR method

Rho A和Rho C分子在多種腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的增殖能力有密切關(guān)聯(lián)。其中Rho A促進(jìn)生長作用較Rho C明顯，而Rho C有更強(qiáng)大的促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移作用［5－6］。Rho A和Rho C分子在細(xì)胞內(nèi)受到多種途徑的調(diào)控，鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEFs）是其中最重要的調(diào)控途徑，控制Rho蛋白的三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）交換，使Rho A或Rho C在與二磷酸鳥苷（guanosine diphosphate，GDP）的失活狀態(tài)與GTP的活化狀態(tài)之間循環(huán)。鳥嘌呤核苷酸交換因子催化GDP轉(zhuǎn)化為GTP，從而活化Rho A或Rho C。P27kip1在被AKT磷酸化后部分由細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿中，通過與GDP－Rho結(jié)合，抑制Rho A和Rho C分子的活性［2］。實(shí)驗(yàn)［1］證實(shí)：過表達(dá)P27kip1的細(xì)胞中，Rho A或Rho C的表達(dá)減少，且活性降低；P27RF－Rho通過與P27kip1結(jié)合，解除P27kip1對(duì)Rho蛋白的抑制，增加了GDP－Rho蛋白對(duì)鳥嘌呤核苷酸交換因子的敏感度，從而活化Rho蛋白。Hoshino等［2］發(fā)現(xiàn)：侵襲性高的鼠黑色素瘤細(xì)胞中的P27RF－Rho和與GTP結(jié)合的Rho A表達(dá)水平較無侵襲性的黑色素瘤細(xì)胞和正常組織中要明顯增高，且過表達(dá)P27RF－Rho后，Rho A的表達(dá)較正常對(duì)照組增加了50%，而基因沉默P27RF－Rho后，Rho A的表達(dá)較正常對(duì)照組降低了40%。此外，還有研究［7］表明：P27RF－Rho通過MAPK、mTORC1信號(hào)通路及依賴P53分子的細(xì)胞凋亡影響腫瘤細(xì)胞的增殖能力。

CDK是細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心蛋白，其表達(dá)活性的改變直接影響到細(xì)胞周期的長短，決定著細(xì)胞的進(jìn)程，與集體細(xì)胞的生長、分化、運(yùn)動(dòng)、凋亡以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［8］。CDK－5是CDK家族中的一員，主要是通過引起細(xì)胞增殖和凋亡異常引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展的。研究［9］表明：CDK－5在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中高表達(dá)。P16是近年發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，正常情況下其通過阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期（DNA合成期），使細(xì)胞增殖受阻［10］。P16蛋白表達(dá)減少可引起細(xì)胞周期失控而誘發(fā)癌變。實(shí)驗(yàn)［11］表明：肝癌組織中P16呈低表達(dá)。腫瘤浸潤是腫瘤組織與細(xì)胞外基質(zhì)（extracelluar matrix，ECM）相互作用的過程，包括黏附、降解及移動(dòng)3個(gè)步驟，實(shí)現(xiàn)這一過程首先必須具備降解基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)的能力。MMPs是一類能分解細(xì)胞外基質(zhì)與基底膜的蛋白水解酶，MMP－9能降解明膠、層黏連蛋白和巢蛋白，與腫瘤的增殖和發(fā)展有密切關(guān)系［12］。研究［13］表明：MMP－9在肝癌、胃癌、食管癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌和骨肉瘤等惡性組織中呈高表達(dá)特性。CyclinE是重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，CyclinE基因的低表達(dá)可使細(xì)胞阻滯在G1期，使G1細(xì)胞數(shù)目增多，S期細(xì)胞減少，進(jìn)而抑制細(xì)胞惡性增殖、惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)展［14］。CyclinE基因在低分化及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的肝癌組織中呈過度表達(dá)，在正常肝組織中無過度表達(dá)［15－19］。

本實(shí)驗(yàn)通過靶向沉默P27RF－Rho基因使肝癌細(xì)胞的增殖能力明顯下降，RT－PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：P16mRNA表達(dá)水平明顯升高，CyclinE、MMP－9和CDK－5mRNA表達(dá)水平降低。

綜上所述，靶向沉默P27RF－Rho基因可以明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力，其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，P27RF－Rho基因?qū)⒖赡艹蔀橐粋€(gè)極有前途的肝癌腫瘤生物治療的新靶點(diǎn)。

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