正清風(fēng)痛寧對偏頭痛模型大鼠無菌性神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)的抑制作用

羅國標(biāo)，楊 麗，劉曉麗

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州遵義 563099；2.貴州省黔東南州人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 凱里 556000；3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，貴州 遵義 563099）

偏頭痛是一種慢性反復(fù)發(fā)作性頭痛，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。最近幾年的研究［1－2］表明：炎性細(xì)胞因子與偏頭痛的疼痛有關(guān)聯(lián)；三叉神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)肽和炎性介質(zhì)在偏頭痛的病理生理學(xué)中起關(guān)鍵作用。偏頭痛的經(jīng)典治療藥物曲馬普坦類藥物具有減少神經(jīng)肽、蛋白及血漿滲出，減少偏頭痛血管炎癥反應(yīng)等藥理作用。正清風(fēng)痛寧主要成分為鹽酸青藤堿，其具有明顯抗炎、抗免疫、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)咳等藥理作用，目前已廣泛用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。目前尚未見正清風(fēng)痛寧用于治療偏頭痛的文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察正清風(fēng)痛寧對偏頭痛模型大鼠腦干炎性細(xì)胞因子腫瘤壞子因子α（tumor necrosis factorα，TNF－α）和白細(xì)胞介素1β（interleukin－1β，IL－1β）表達(dá)及大鼠腦干蛛網(wǎng)膜下腔炎性細(xì)胞數(shù)的影響，以舒馬普坦為陽性對照，了解正清風(fēng)痛寧能否減少蛛網(wǎng)膜下腔炎性細(xì)胞數(shù)及腦干細(xì)胞因子（TNF－α和IL－1β）的表達(dá)從而抑制偏頭痛的無菌性神經(jīng)源性炎癥（aseptic neurogenic inflammation，ANI）反應(yīng)，為正清風(fēng)痛寧臨床用于治療偏頭痛提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、主要試劑和儀器 清潔級 Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量（260±60）g，購于重慶第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK（渝）2007－0005。硝酸甘油注射液（nitroglycerin，NTG）（5g·L－1，批號：20100531）購自北京益民藥業(yè)有限公司，正清風(fēng)痛寧緩釋片（每片含鹽酸青藤堿60mg，批號：0903127）購自湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，琥珀酸舒馬普坦片（批號：0D6909T）購自天津華津制藥有限公司，兔抗大鼠TNF－α抗體和兔抗大鼠IL－1β抗體購自武漢博士德生物公司。麥克奧迪BA400顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組、模型制作和給藥 Wistar大鼠60只隨機(jī)分為空白對照組、模型組、舒馬普坦組（6mg·kg－1·d－1）和正清風(fēng)痛寧低劑量組（100mg·kg－1·d－1）、正清風(fēng)痛寧中劑量組（150mg·kg－1·d－1）、正清風(fēng)痛寧高劑量組（200mg·kg－1·d－1），每組10只。采用皮下注射NTG制作大鼠偏頭痛模型。Wistar大鼠稱質(zhì)量后按10mg·kg－1皮下注射NTG，制作實(shí)驗(yàn)性偏頭痛模型。模型制作判定標(biāo)準(zhǔn)：模型制作后通過耳紅、撓頭、爬籠和煩躁不安等行為癥狀判定模型制作是否成功。成功的標(biāo)準(zhǔn)為模型動物精神不振，眼睛瞇成線狀，體溫明顯下降，蜷縮少動，肛門處有糞便堆積，體質(zhì)量逐日下降。本實(shí)驗(yàn)中，除空白對照組外，其余各組動物造模后6～10min均出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、前肢頻繁搔頭、擺頭、爬籠次數(shù)增多和煩躁不安現(xiàn)象。模型組大鼠上述現(xiàn)象持續(xù)1～3h，繼而出現(xiàn)蜷臥，活動減少狀態(tài)。造模30min后按組分別灌服舒馬普坦、各劑量正清風(fēng)痛寧，模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃。舒馬普坦和各劑量正清風(fēng)痛寧組大鼠在給藥后上述現(xiàn)象逐漸消失，趨于正常。

1.3 取材和標(biāo)本處理 造模4h后將大鼠用10%水合氯醛（0.30mL·100g－1）腹腔注射法進(jìn)行全身麻醉后，仰臥固定，開胸從左心室至主動脈插管，剪開右心耳，首先迅速灌注無菌生理鹽水200mL，然后灌注4℃4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液200mL，灌注后斷頭，取出整個完整腦組織，4℃、4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液浸泡后，去除硬腦膜、大腦，保留腦干、軟腦膜和蛛網(wǎng)膜，在4%PFA磷酸鹽緩沖液中固定24h，然后放入20%蔗糖－PBS液中，至組織塊下沉。標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，制成4μm切片，常規(guī)HE染色。

1.4 計(jì)數(shù)蛛網(wǎng)膜下腔炎性細(xì)胞數(shù) 切片HE染色，奧林巴斯顯微鏡下觀察每張切片腦干蛛網(wǎng)膜下腔炎的炎癥反應(yīng)，計(jì)數(shù)腦干蛛網(wǎng)膜下腔40倍視野單位面積（以視野為單位）炎性細(xì)胞數(shù)總數(shù)。全部標(biāo)本的切片均由2名有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師觀察復(fù)核。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察確定組織結(jié)構(gòu)未被破壞，采用免疫組織化學(xué)方法檢測TNF－α和IL－1β表達(dá)情況。奧林巴斯顯微鏡下觀察每張切片左上、右上、左下、右下和中央部5個視野40倍圖片，計(jì)數(shù)每個視野TNF－α和IL－1β陽性細(xì)胞總數(shù)，取均值。全部標(biāo)本的切片均由2名有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師觀察復(fù)核。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠腦干中TNF－α和IL－1β陽性細(xì)胞數(shù)及蛛網(wǎng)膜下腔炎性細(xì)胞數(shù)以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦干中TNF－α和IL－1β陽性細(xì)胞數(shù)顯微鏡下免疫組織化學(xué)染色陽性部位為細(xì)胞質(zhì)染為棕黃色，細(xì)胞核用蘇木精復(fù)染為藍(lán)色。與空白對照組比較，模型組大鼠腦干中TNF－α和IL－1β陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，正清風(fēng)痛寧中、高劑量組和舒馬普坦組大鼠腦干中TNF－α和IL－1β陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1和圖2（插頁六）。

2.2 各組大鼠腦干蛛網(wǎng)膜下腔炎性反應(yīng) 空白對照組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔血管正常，無血管擴(kuò)張及炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠腦干蛛網(wǎng)膜下腔血管明顯擴(kuò)張充血，炎性細(xì)胞（以淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞為主）浸潤，炎性細(xì)胞數(shù)明顯增多，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；正清風(fēng)痛寧低、中、高劑量組及舒馬普坦組炎性反應(yīng)減輕，炎性細(xì)胞數(shù)（以淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞為主）明顯減少，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表1 各組大鼠腦干中TNF－α和IL－1β表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)Tab.1 Number of TNF－αand IL－1βexpression positive cells in brainstem of rats in various groups（n＝10，）

表1 各組大鼠腦干中TNF－α和IL－1β表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)Tab.1 Number of TNF－αand IL－1βexpression positive cells in brainstem of rats in various groups（n＝10，）

＊P＜0.01compared with blank control group；△P＜0.05 compared with model group.

0 2.90±0.745.70±2.31 Model 0 15.20±5.53＊19.20±4.69＊Sumatriptan 6 1.80±0.79△2.80±1.40△Zhengqingfengtongning Low dose 10010.10±2.6013.50±4.30 Middle dose 150 6.90±1.45△7.70±1.50△High dose 200 6.00±2.21△7.00±1.33 ositive cells Blank control Group Dose（mg·kg－1）Number of TNF－α positive cells Number of IL－1β p△

表2 各組大鼠腦干蛛網(wǎng)下腔炎細(xì)胞數(shù)Tab.2 Number of inflammatory cells in brainstem subarachnoid space of rats in various groups（n＝10，）

表2 各組大鼠腦干蛛網(wǎng)下腔炎細(xì)胞數(shù)Tab.2 Number of inflammatory cells in brainstem subarachnoid space of rats in various groups（n＝10，）

＊P＜0.01compared with blank control group；△P＜0.01 compared with model group.

0 1.90±0.74 Model 0 28.33±2.06＊Sumatriptan 6 11.00±1.05△Zhengqingfengtongning Low dose 100 9.10±1.10△Middle dose 150 5.60±0.97△High dose 200 2.60±0.84 ace Blank control Group Dose（mg·kg－1）Number of inflammatory cells of per unit area subarachnoid sp△

3 討 論

偏頭痛是一種原發(fā)性頭痛，是臨床常見病、多發(fā)病，其影響、困擾著全球總?cè)丝?0%的人群，特別是20～50歲的女性［3］，年患病率女性為3.3%～32.6%，男性為0.70%～16.1%［4］。偏頭痛不但是神經(jīng)科常見病，還是腦血管病的危險(xiǎn)因素之一，與神經(jīng)科許多疾病共患病，如焦慮癥、抑郁癥和癲癇等，但其發(fā)病機(jī)制目前尚無定論。三叉神經(jīng)血管反射學(xué)說為目前的主流學(xué)說，該學(xué)說認(rèn)為：三叉神經(jīng)受損害、神經(jīng)纖維受刺激導(dǎo)致腦膜ANI發(fā)生，誘發(fā)偏頭痛。三叉神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)肽和炎性介質(zhì)在偏頭痛病理生理學(xué)中起關(guān)鍵作用［2］。細(xì)胞因子是重要的炎性介質(zhì)之一，是炎性通路上的重要調(diào)質(zhì)，與偏頭痛發(fā)病機(jī)制有關(guān)聯(lián)；細(xì)胞因子及其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)所有細(xì)胞類型、包括神經(jīng)細(xì)胞中均表達(dá)［5］。細(xì)胞因子不僅在健康人大腦中產(chǎn)生，參與正常神經(jīng)功能，而且在神經(jīng)源性炎癥中起作用，是神經(jīng)源性炎癥調(diào)質(zhì)，誘導(dǎo)疼痛［6］，TNF－a和IL－1能夠引起強(qiáng)烈的痛覺過敏［5］。有報(bào)道［6］顯示：在偏頭痛患者偏頭痛發(fā)作期，血漿TNF－α水平升高。IL－1在偏頭痛患者中也被證實(shí)升高［7］。促炎性細(xì)胞因子TNF－α和IL－1β在調(diào)節(jié)疼痛中起到關(guān)鍵性作用，其有助于三叉神經(jīng)纖維致敏［7］。在人體臨床試驗(yàn)中TNF－α能夠引起頭痛，TNF－α抗體能減少疼痛。本實(shí)驗(yàn)通過皮下注射NTG復(fù)制偏頭痛模型。注射NTG可引起大鼠硬腦膜遲發(fā)性炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子IL－1β和IL－6產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前述的研究結(jié)果一致，TNF－α和IL－1β在模型組大鼠腦干中表達(dá)水平明顯升高。此外，本文作者的前期實(shí)驗(yàn)［8］結(jié)果和本實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果與何秋等［9］觀察的結(jié)果一致：模型組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔有大量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，空白對照組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔無明顯炎性反應(yīng)。三叉神經(jīng)血管反射學(xué)說認(rèn)為：由于某種因素激活了腦膜血管周圍的三叉神經(jīng)末梢，釋放某些神經(jīng)肽，使腦膜血管舒張，產(chǎn)生ANI。ANI反應(yīng)刺激中樞和三叉神經(jīng)末梢釋放化學(xué)物質(zhì)或炎癥介質(zhì)，引起血管舒張、滲漏，造成疼痛的延長［10－12］，此過程包括神經(jīng)源性炎癥、中樞痛覺致敏等偏頭痛病理生理過程。神經(jīng)源性炎癥是偏頭痛疼痛產(chǎn)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：偏頭痛模型大鼠存在ANI反應(yīng)，蛛網(wǎng)膜下腔炎性細(xì)胞增多和中樞促炎性細(xì)胞因子表達(dá)增多。

正清風(fēng)痛寧主要成分是鹽酸青藤堿，是從中藥青風(fēng)藤中提取的單體生物堿，具有明顯抗炎、抗免疫、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)咳等藥理作用。梁瑞燕等［13］通過體外實(shí)驗(yàn)研究表明：青藤堿對IL－1β基因表達(dá)有較強(qiáng)的抑制作用，并認(rèn)為青藤堿可能是通過抑制炎癥性細(xì)胞因子的產(chǎn)生而發(fā)揮其抗炎作用。另有研究［14］證實(shí)：青藤堿可通過抑制炎性細(xì)胞因子如IL－1β、IL－2、IL－8和TNF－α等的表達(dá)及合成而產(chǎn)生抗炎作用；青藤堿還能有效抑制巨噬細(xì)胞釋放IL－1及TNF－α，從而有效抑制了新一輪炎癥的啟動［15］。

綜上所述，青藤堿可抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)和合成，從而減少炎性細(xì)胞因子所致的疼痛。曲普坦類藥物是一類特異性5－HT1B／1D受體激動劑，包括舒馬普坦等，是偏頭痛急性發(fā)作期的主要治療藥物。曲坦類藥物治療偏頭痛可能的機(jī)制：收縮已擴(kuò)張的腦血管，減少神經(jīng)肽、蛋白及血漿滲出，減少偏頭痛的血管炎癥反應(yīng)，阻斷疼痛在三叉神經(jīng)系統(tǒng)傳遞，抑制三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)致敏中樞［16－19］。這些反應(yīng)均是偏頭痛疼痛發(fā)作的特征性特點(diǎn)。舒馬曲坦是第1個人工合成的選擇性5－HT（5－HT1B／1D）受體激動劑，其治療偏頭痛發(fā)作的作用機(jī)制：收縮特定的顱內(nèi)血管，抑制激活突觸前膜的5－HT受體，抑制活化的三叉神經(jīng)元放神經(jīng)遞質(zhì)和炎癥介質(zhì)［20－21］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：NTG可引起模型組大鼠腦干中TNF－α和IL－1β表達(dá)及其蛛網(wǎng)膜下腔炎性反應(yīng)明顯增多，舒馬普坦組和各劑量正清風(fēng)痛寧組大鼠上述反應(yīng)明顯減輕，但舒馬普坦組與各劑量正清風(fēng)痛寧比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各劑量正清風(fēng)痛寧組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔炎性細(xì)胞數(shù)比舒馬普坦組減少更明顯，且高劑量組與空白對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，舒馬普坦抑制腦干中TNF－α和IL－1β表達(dá)明顯優(yōu)于正清風(fēng)痛寧組。本文作者推測：正清風(fēng)痛寧有抑制實(shí)驗(yàn)性偏頭痛模型大鼠ANI反應(yīng)的作用，從而達(dá)到其在治療偏頭痛中的抗炎和鎮(zhèn)痛作用。有研究［22－23］證實(shí)：神經(jīng)源性炎癥發(fā)生在人類偏頭痛中，但這一直是一個有爭議的領(lǐng)域。因此，需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來進(jìn)一步證實(shí)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

［1］Boettger MK，Weber K，Grossmann D，et al.Spinal tumor necrosis factor alpha neutralization reduces peripheral inflammation and hyperalgesia and suppresses autonomic responses in experimental arthritis：a role for spinal tumor necrosis factor alpha during induction and maintenance of peripheral inflammation ［J］.Arthritis Rheum，2010，62（5）：1308－1318.

［2］Neeb L，Hellen P，Boehnke C，et al.IL－1βstimulates COX－2dependent PGE2synthesis and CGRP release in rat trigeminal ganglia cells ［J］.PLoS One，2011，6（3）：e17360－e17369.

［3］Schürks M，Kurth T.Is migraine a predictor for identifying patients at risk of stroke？［J］.Expert Rev Neurother，2011，11（5）：615－618.

［4］中華醫(yī)學(xué)會疼痛學(xué)分會頭面痛學(xué)組.中國偏頭痛診斷治療指南 ［J］.中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2011，17（2）：65－86.

［5］Yilmaz IA，Ozge A，Erdal ME，et al.Cytokine polymorphism in patients with migraine：some suggestive clues of migraine and inflammation ［J］.Pain Med，2010，11（4）：492－497.

［6］Oikari LE，Stuart S，Okolicsanyi RK，et al.Investigation of lymphotoxinαgeneic variants in migraine［J］.Gene，2013，512（2）：527－531.

［7］Uzar E，Evliyaoglu O，Yucel Y，et al.Serum cytokine and pro－brain natriuretic peptide（BNP）levels in patients with migraine ［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2011，15（10）：1111－1116.

［8］羅國標(biāo)，劉曉麗，楊 麗.青藤堿對偏頭痛模型大鼠蛛網(wǎng)膜下腔炎性細(xì)胞的影響 ［J］.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2014，40（4）：198－201.

［9］何 秋，王懷良，章新華，等.5－HT1受體激動劑對偏頭痛大鼠腦膜神經(jīng)源炎癥的影響 ［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2007，24（5）：520－524.

［10］Maleki N，Becerra L，Borsook D.Migraine：maladaptive brain responses to stress ［J］.Headache，2012，52（suppl 2）：102－106.

［11］譚 亮，樊光輝.偏頭痛發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展 ［J］.中國臨床神經(jīng)外科雜志，2012，17（9）：571－573.

［12］Ho TW，Edvinsson L，Goadsby PJ.CGRP and its receptors provide new insights into migraine pathophysiology ［J］.Nat Rev Neurol，2010，6（10）：573－582.

［13］梁瑞燕，曹柳英，王文君，等.青藤堿抗炎作用機(jī)理研究 ［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，24（2）：141－143.

［14］吳紅娟，孫必強(qiáng)，朱傳湘，等.鹽酸青藤堿對家兔骨關(guān)節(jié)液IL－1β、PGE－2生成與關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)的影響 ［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（9）：84－86.

［15］李蘊(yùn)麟，粟 戟，尹小軍，等.青藤堿替代激素治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎療效分析 ［J］.蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013，39（3）：18－21.

［16］Tfelt－Hansen P，Hougaard A.Sumatriptan：a review of its pharmacokinetics，pharmacodynamics and efficacy in the acutetreatment of migraine ［J］.Expert Opin Drug Metab Toxicol，2013，9（1）：91－103.

［17］Mitsikostas DD，Knight YE，Lasalandra M，et al.Triptans attenuate capsaicin－induced CREB phosphorylation within the trigeminal nucleus caudalis：a mechanism to prevent central sensitization？ ［J］.J Headache Pain，2011，12（4）：411－417.

［18］Napoletano F，Lionetto L，Martelletti P.Sumatriptan in clinical practice：effectiveness in migraine and the problem of psychiatric comorbidity ［J］.Expert Opin Pharmacother，2014，15（3）：303－305.

［19］Asadollahi S，Heidari K，Vafaee R，et al.Promethazine plus sumatriptan in the treatment of migraine：a randomized clinical trial［J］.Headache，2014，54（1）：94－108.

［20］De Corato A，Capuano A，Currò D，et al.Trigeminal satellite cells modulate neuronal responses to triptans：relevance for migraine therapy ［J］.Neuron Glia Biol，2012，7（2－4）：109－116.

［21］Vause CV，Durham PL.Identification of cytokines and signaling proteins differentially regulated by sumatriptan／naproxen ［J］.Headache，2012，52（1）：80－89.

［22］Goadsby PJ，Lipton RB，F(xiàn)errari MD.Migraine－current understanding and treatment ［J］.N Engl J Med，2002，346（4）：257－270.

［23］Landy SH，Lobo BL.Migraine treatment throughout the lifecycle［J］.Expert Rev Neurother，2005，5（3）：343－353.