貝母瓜蔞散對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織中血管緊張素Ⅱ表達(dá)水平的影響

吳忠練，黃學(xué)寬，駱 言，張超男，蔣 娟

（重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)經(jīng)典教學(xué)研究室，重慶 401331）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患病率和死亡率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，這嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和勞動(dòng)力，目前缺乏有效的治療方法［1］。關(guān)于COPD的發(fā)生，公認(rèn)的有3個(gè)發(fā)病機(jī)制：①氣道和肺部炎癥；②蛋白酶－抗蛋白酶失衡；③氧化－抗氧化失衡。COPD患者大多存在不同程度的肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞破壞和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致氣道和肺部血管結(jié)構(gòu)的重構(gòu)。氣道重構(gòu)是指氣道壁增厚變形，其中平滑肌增厚顯著，導(dǎo)致氣道管腔狹窄和氣流阻力增加的過(guò)程。病程進(jìn)展導(dǎo)致缺氧和二氧化碳潴留，發(fā)展為肺動(dòng)脈高壓和肺心病。

國(guó)內(nèi)外研究［2－3］表明：血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）不僅可誘發(fā)強(qiáng)烈氣道平滑肌的收縮，還能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞分泌單核細(xì)胞趨化蛋白和細(xì)胞間黏附分子，引起劇烈的炎癥反應(yīng)，其是參與慢性氣道炎癥形成和重塑的主要炎性介質(zhì)之一。COPD患者長(zhǎng)期慢性缺氧，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，代償刺激血管平滑肌合成血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，進(jìn)而催化血管緊張素Ⅰ（angiotensinⅠ，AngⅠ）轉(zhuǎn)化成AngⅡ［2－4］。AngⅡ有強(qiáng)烈的縮血管作用，隨著血管阻力進(jìn)一步增加，COPD患者原本的氣道狹窄加重，形成惡性循環(huán)。研究［5－6］提示：AngⅡ的表達(dá)可以通過(guò)縮血管作用，導(dǎo)致氣道重構(gòu)從而引起肺纖維化。臨床采用中藥方劑貝母瓜蔞散治療COPD［7］很常見(jiàn)，但其機(jī)制并不清楚。研究［8－9］表明：浙貝母堿在低濃度下對(duì)支氣管平滑肌有明顯擴(kuò)張作用，并能鎮(zhèn)靜和抗炎。瓜蔞有擴(kuò)張微血管等作用［8－9］。本研究觀察貝母瓜蔞散對(duì)COPD大鼠肺組織中AngⅡ表達(dá)的影響，初步探討貝母瓜蔞散對(duì)肺組織的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只清潔級(jí)雄性SD大鼠（85～110d齡），體質(zhì)量（200±20）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK渝20020001。

1.2 藥品和試劑 貝母瓜蔞散由川貝母、瓜蔞、花粉、茯苓、橘紅、白術(shù)和甘草等中藥組成，原藥購(gòu)自重慶西部醫(yī)藥商城，經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院鑒定，按常規(guī)方法自制煎劑（即冷水浸30min，煮沸后煎30min，共煎3次，合并藥液，濃縮為1.0g生藥·mL－1），脂多糖（LPS）（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：20120501），宏聲牌香煙（川渝中煙，焦油量11mg／支，煙氣一氧化碳量12mg／支，煙氣煙堿量10mg／支），AngⅡ抗體（武漢博士德生物有限公司，批號(hào)：Y－B2－07D27C）等。

1.3 儀器 切片機(jī)（LEZCARM2135），電熱恒溫水溫箱（WSZ－261－79HW1，上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠），BMJ－Ⅲ型包埋機(jī)和Dy89－1型電子玻璃勻漿機(jī)（寧波新芝科器研究所），Biofuge fresco低溫離心機(jī)（德國(guó)Herraces公司），BH－2型光學(xué)顯微鏡，顯微攝像儀（日本 Olympus公司），Image－Pro Plus多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)（美國(guó)Media Cybernetics公司），GDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)（英國(guó)UVP公司），體描箱（北京貝蘭博公司）。

1.4 動(dòng)物分組和模型建立 30只大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組和貝母瓜蔞散組，每組10只。動(dòng)物造模：取SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，除正常組外，參照宋一平等［10］的方法，將大鼠分別于第1和15天氣道內(nèi)注入生理鹽水溶解的LPS（200g·100L－1）；第2～14天、第16～31天將大鼠置于密閉玻璃染毒箱中，將香煙插在50mL注射器針頭上點(diǎn)燃后連續(xù)抽吸將煙霧注入箱內(nèi)達(dá)到約5%濃度（每次約打入3600mL煙霧），使大鼠被動(dòng)吸煙，持續(xù)30min后將大鼠移出箱子，每天2次，間隔4h以上。其余時(shí)間正常喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)方法：造模期間，注意觀察造模大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)情況；造模成功后，自第8天起，正常組、模型組大鼠給予生理鹽水灌胃（20mL·kg－1），貝母瓜蔞散組大鼠給予自制貝母瓜蔞散灌胃（20mL·kg－1），每天1次，連續(xù)22d。

1.5 肺功能測(cè)定實(shí)驗(yàn) 結(jié)束后的第31天，用10%水合氯醛（0.3mL·100g－1）對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉后，行氣管切開(kāi)置人氣管導(dǎo)管，將大鼠放入體描箱內(nèi)，外接小動(dòng)物肺功能檢測(cè)分析系統(tǒng)（北京航天新概念軟件公司），記錄大鼠8個(gè)自主呼吸周期，獲得氣道壓力（P），容積變化（V），相應(yīng)計(jì)算得到呼吸相氣道阻力（Re）、吸氣相氣道阻力（Ri）；快速向大鼠氣道內(nèi)注入6mL空氣造成大鼠被動(dòng)深呼吸，即刻測(cè)定用力肺活量（FVC）、0.3s呼氣容積（FEV 0.3）及0.3s用力呼氣容積／用力肺活量（FEV 0.3／FVC）等指標(biāo)。

1.6 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本獲取和處理 末次實(shí)驗(yàn)后24h，用10%水合氯醛（0.3mL·100g－1）麻醉放血處死大鼠，將氣管與雙肺暴露，取右下肺，放入4%多聚甲醛中固定。石蠟包埋，切片5μm。AngⅡ免疫組織化學(xué)染色步驟按照SP試劑盒操作。各大鼠的免疫組織化學(xué)標(biāo)本隨機(jī)選10個(gè)視野，光鏡下400倍觀察。多功能彩色圖像分析系統(tǒng)對(duì)AngⅡ的蛋白表達(dá)進(jìn)行分析。胞漿棕褐色表示陽(yáng)性反應(yīng)，陽(yáng)性細(xì)胞面積反映表達(dá)強(qiáng)度。

另將解剖取出的大鼠肺組織用生理鹽水洗凈其表面殘血，濾紙吸干后，精密稱取肺組織0.1g，研磨后加入預(yù)冷的蛋白裂解液0.5mL充分裂解。4℃、3000r·min－1離心10min后取上清液。測(cè)定蛋白質(zhì)水平，取100μg蛋白加入上樣緩沖液，煮沸3min后進(jìn)行12%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉(zhuǎn)PVDF膜，TTBS封閉液37℃封閉2h，滴加兔抗鼠AngⅡ單克隆抗體，4℃過(guò)夜，加入1∶2500稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，37℃、2h，DAB顯色。用抗體剝脫液剝脫抗體后，按同樣方法與β－actin抗體（1∶300）孵育。以β－actin蛋白條帶作為內(nèi)參，用圖像分析儀測(cè)定灰度值，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。蛋白相對(duì)表達(dá)水平＝目的蛋白條帶灰度值／內(nèi)參β－actin條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組大鼠Re、FEV0.3、FEV0.3／FVC和AngⅡ表達(dá)水平以表示，各組之間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況觀察 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，與正常組比較，模型組和貝母瓜蔞散組大鼠表現(xiàn)出氣急、喘咳、精神萎靡和吐痰流涎、毛發(fā)牙齒發(fā)黃等特征。而煙熏過(guò)程中尤為明顯，有的甚至出現(xiàn)呼吸困難，抬頭張口呼吸。解剖大鼠發(fā)現(xiàn)：模型組和貝母瓜蔞組大鼠肺組織顏色灰白晦暗，呈膨脹狀態(tài)，模型組尤為明顯，正常大鼠肺組織顏色偏白。見(jiàn)圖1（插頁(yè)五）。

2.2 各組大鼠肺功能 與正常組比較，模型組大鼠Re明顯增加，F(xiàn)EV0.3和FEV0.3／FVC明顯降低；與模型組比較，貝母瓜蔞散組大鼠Re明顯降低，F(xiàn)EV0.3和FEV0.3／FVC明顯升高。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肺 Re、FEV0.3和FEV0.3／FVCTab.1 Re，F(xiàn)EV0.3，and FEV0.3／FVC of rats in various groups （n＝10，）

表1 各組大鼠肺 Re、FEV0.3和FEV0.3／FVCTab.1 Re，F(xiàn)EV0.3，and FEV0.3／FVC of rats in various groups （n＝10，）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group.

Group Re（cmH2O·mL－1·s－1）FEV0.3（V／mL）FEV0.3／FVC（η／%）Control 3.46±0.31 7.02±0.51 87.16±4.40 Model 3.85±0.46＊ 6.48±0.51＊80.46±7.85＊BeiMuGuaLou powder 3.40±0.34△ 6.99±0.63△85.79±3.87△

2.3 各組大鼠肺組織中AngⅡ的表達(dá)水平 與正常組比較，模型組和和貝母瓜蔞散組大鼠肺組織中AngⅡ表達(dá)水平明顯增加，積分吸光度（IA）和陽(yáng)性面積明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，貝母瓜蔞散組大鼠肺組織中AngⅡ表達(dá)水平明顯降低，其主要表達(dá)在吸收上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和細(xì)胞核，著色均呈均勻的褐色，陽(yáng)性面積明顯降低（P＜0.05），IA值明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2和圖2（插頁(yè)六）。

表2 各組大鼠肺組織中AngⅡ表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of AngⅡin lung tissue of rats in various groups （n＝10，）

表2 各組大鼠肺組織中AngⅡ表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of AngⅡin lung tissue of rats in various groups （n＝10，）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group.

Group IA Positive area（S／μm2Control 96.96±16.98 55.72±14.68 Model 141.69±23.77＊ 88.34±9.53＊BeiMuGuaLou powder 119.71±27.29△ 72.56±19.57）△

2.4 各組大鼠肺組織中AngⅡ蛋白表達(dá)水平 模型組大鼠肺組織中AngⅡ蛋白表達(dá)水平（0.60±0.09）明顯高于正常組（0.45±0.17）（P＜0.05），貝母瓜蔞散組大鼠肺組織中AngⅡ蛋白表達(dá)水平（0.48±0.12）明顯低于模型組（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

3 討 論

目前研究［11－13］認(rèn)為符合臨床實(shí)際的理想COPD動(dòng)物模型應(yīng)具備的標(biāo)準(zhǔn)是：①致傷因素與臨床COPD常見(jiàn)誘因基本一致；②必須有氣流阻塞存在，小氣道阻力增加、肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性下降；③氣道重塑（建）；④可伴有氣道高反應(yīng)性。根據(jù)以上理想COPD動(dòng)物模型，目前經(jīng)典造模方法可用熏香煙加氣管內(nèi)注入LPS法建立COPD大鼠模型，造模完成后，模型大鼠出現(xiàn)明顯喘息、臥底弓背等形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，呼吸功能檢測(cè)及氣道炎癥反應(yīng)證明造模成功。

圖3 各組大鼠肺組織中AngⅡ蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of AngⅡprotein in lung tissue of rats in various groups

COPD是進(jìn)行性氣流受限為特征的慢性病，涉及肺臟吸入有害氣體和顆粒的異常反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通過(guò)單純被動(dòng)吸煙法制備COPD大鼠模型，病理形態(tài)學(xué)檢查符合典型COPD表現(xiàn)，模型復(fù)制成功。目前有關(guān)COPD和AngⅡ與肺動(dòng)脈高壓的研究［14］較多，本實(shí)驗(yàn)中模型大鼠長(zhǎng)期慢性缺氧，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，代償刺激血管平滑肌合成血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，進(jìn)而催化AngⅠ轉(zhuǎn)化成AngⅡ［15］。AngⅡ有強(qiáng)烈的縮血管作用［16］，隨著血管阻力進(jìn)一步增加，COPD患者氣道狹窄加重，影響呼吸功能，形成惡性循環(huán)［17］，而目前尚無(wú)有效治療方法［18－21］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究貝母瓜蔞散是否可以通過(guò)抑制AngⅡ的表達(dá)而抑制血管收縮，從而減輕肺部炎癥反應(yīng)。

《靈樞脹論》：“肺脹者，虛滿而喘咳”，根據(jù)COPD患者臨床表現(xiàn)，即咳喘、咯痰和胸悶氣促等癥狀，歸類于中醫(yī) “喘證”、“咳嗽”、“肺脹”等。肺脹多因肺臟受內(nèi)外邪侵襲，日久則肺虛清肅無(wú)權(quán)，痰濁潴留，肺不斂降，氣還肺間，肺氣脹滿，復(fù)感外邪誘使病情發(fā)作或加劇。病久及心，出現(xiàn)喘脫等危候［22］。COPD的病機(jī)屬于本虛合并標(biāo)實(shí)［23］。貝母瓜蔞散潤(rùn)肺清熱，理氣化痰，臨床上常用于治療慢性支氣管炎和肺氣腫等疾病［24］。貝母瓜蔞散中貝母苦寒，潤(rùn)肺清熱，化痰止咳；瓜蔞甘寒微苦，清肺潤(rùn)燥，開(kāi)結(jié)滌痰，與貝母相須為用，是為潤(rùn)肺清熱化痰的常用組合，共為君藥?；ǚ矍鍩釡焯刀鴿?rùn)燥為臣；茯苓、橘紅健脾理氣以祛痰為佐；桔梗載諸藥入肺，宣肺利氣為使。共奏清熱潤(rùn)燥，理氣化痰之功，使肺陰得潤(rùn)而燥痰可除，清肅有權(quán)則咳逆可止。現(xiàn)代運(yùn)用于肺炎、肺結(jié)核等疾病［25］。因此觀察貝母瓜蔞散對(duì)肺組織中AngⅡ表達(dá)的影響，可反映貝母瓜蔞散對(duì)肺組織炎性反應(yīng)的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)模型大鼠予以貝母瓜蔞散灌胃，大鼠咳喘、氣急等表現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)。并測(cè)得大鼠AngⅡ的表達(dá)在貝母瓜蔞散組中明顯低于未受到干預(yù)的模型組。因此推測(cè)，貝母瓜蔞散有通過(guò)擴(kuò)張支氣管平滑肌、擴(kuò)張微血管的作用，而其機(jī)制可能與降低AngⅡ的表達(dá)有關(guān)聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)證明貝母瓜蔞散對(duì)肺功能有改善作用，為臨床上用藥提供了理論指導(dǎo)和依據(jù)。

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