精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸多肽表面修飾多孔鉭對軟骨細胞黏附、增殖和分泌功能的促進作用

甘洪全，王 茜，張 輝，趙宏坤，王 輝，宋會平，畢 成，王志強，李琪佳

（1.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，河北 唐山 063000；2.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系，河北 唐山 063000；3.河北省唐山市第二醫(yī)院關(guān)節(jié)科，河北 唐山 063000；4.河北省唐山市第二醫(yī)院手外科，河北 唐山 063000；5.河北聯(lián)合大學(xué)實驗中心，河北 唐山 063000）

多孔鉭是近年來出現(xiàn)的一種比較理想的骨科植入金屬材料，其有與人類松質(zhì)骨類似的三維立體網(wǎng)架孔隙結(jié)構(gòu)，相互連通。多孔鉭有利于細胞的黏附、增殖和較好地向組織長入［1－2］。盡管多孔鉭作為金屬移植材料優(yōu)點諸多，但仍存在象其他金屬材料一樣在細胞親和力、親水性和細胞黏附性不如天然衍生骨植入材料的缺點，需要對其進行表面修飾或改性以改善其生物學(xué)性能［3－4］。

本實驗通過物理吸附的方法將含有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸（arg－gly－asp，RGD）片段多肽及Ⅱ型膠原（ColⅡ）分別吸附于國產(chǎn)多孔鉭表面進行修飾形成RGD（或ColⅡ）／多孔鉭；同時與新西蘭乳兔軟骨細胞復(fù)合培養(yǎng)形成RGD／軟骨細胞／多孔鉭復(fù)合物。掃描電鏡觀察多孔鉭形貌特征、RGD／軟骨細胞／多孔鉭復(fù)合物軟骨細胞生長、黏附及分泌細胞外基質(zhì)情況；MTT法檢測修飾前后多孔鉭對軟骨細胞增殖的影響；沉淀法檢測多孔鉭修飾前后軟骨細胞黏附率；羥脯氨酸法測定軟骨細胞分泌功能，進而探討RGD／軟骨細胞／多孔鉭復(fù)合物做為軟骨組織工程支架材料修復(fù)軟骨缺損、促進軟骨再生的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、實驗材料、主要試劑和儀器 健康新西蘭幼兔8只，2周齡，體質(zhì)量200～300g，由河北聯(lián)合大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：Scxk（京）010－0001。多孔鉭材料由重慶潤澤醫(yī)療器械有限公司提供。RGD多肽（上海吉爾生化有限公司），ColⅡ和DMEM F12（美國 Gibco公司），MTT試劑、DMSO和甲苯 胺藍（美國Sigma公司），PV－6001免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），羥脯氨酸測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。TS100倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司），S－4800掃描電鏡（美國Thermo公司），BIO－RAD 680伯樂酶標(biāo)儀（美國BIO－RAD公司）。

1.2 RGD多肽和ColⅡ表面修飾多孔鉭及實驗分組直徑15mm、厚3mm圓盤形多孔鉭材料用去離子水超聲清洗，蒸汽滅菌器滅菌，干燥。物理吸附方法將多孔鉭（Ta）分別置于不同濃度RGD多肽及ColⅡ溶液中，使多孔鉭材料孔隙內(nèi)充分浸入修飾溶液。移液器吸除多孔鉭上多余的修飾溶液，室溫干燥24h。經(jīng)紫外線照射再次消毒，備用。每組均為6個樣本。根據(jù)2種修飾物濃度的不同共分為7組：1.0g·L－1RGD（Ta－RGD組）、1.0g·L－1ColⅡ（Ta－ColⅡ組）、0.2g·L－1RGD＋1.0g · L－1ColⅡ（Ta－RGD／ColⅡ0.2g·L－1組）、1.0g·L－1RGD＋1.0g·L－1Col Ⅱ（Ta－RGD／Col Ⅱ 1.0g · L－1組）、5.0g·L－1RGD＋1.0g·L－1ColⅡ（Ta－RGD／ColⅡ5.0g·L－1組）、10.0g· L－1RGD和1.0g·L－1ColⅡ（Ta－RGD／ColⅡ10.0g·L－1組）及純Ta組。

1.3 軟骨細胞的分離培養(yǎng) 新西蘭幼兔耳緣靜脈空氣栓塞處死，無菌條件下取四肢關(guān)節(jié)軟骨，生理鹽水漂洗，剪成1mm3小碎塊，置于10mL離心管中，加入5倍軟骨體積的1g·L－1ColⅡ酶，于37℃消化約10h，1000r·min－1離心5min，去上清液，所得白色沉淀物加入體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100U·mL－1、DMEM／F12培養(yǎng)基，吹打成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×105mL－1，種植于細胞培養(yǎng)瓶，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2孵箱中培養(yǎng)2d后全量換液，去除未貼壁細胞，之后每2～3d換液1次，1周后可見細胞長滿瓶底，傳代。

1.4 軟骨細胞與多孔鉭復(fù)合培養(yǎng)及掃描電鏡觀察RGD／軟骨細胞／多孔鉭復(fù)合物 根據(jù)張嶺等［5］方法將預(yù)先修飾處理好的各組多孔鉭（每組6個）置入24孔板中，每孔鉭支架加入200μL DMEM／F12于培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)濕過夜，取生長狀態(tài)良好的第2代軟骨細胞，調(diào)整濃度為1×105mL－1的單細胞懸液200μL接種到多孔鉭表面，2h后于支架周邊輕柔緩慢加入含10%胎牛血清的DMEMF12培養(yǎng)液，培養(yǎng)液稍浸沒支架。放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2d更換培養(yǎng)液1次。

掃描電鏡觀察RGD／軟骨細胞／多孔鉭復(fù)合物，分別取修飾后培養(yǎng)4和7d的各組軟骨細胞－鉭支架復(fù)合物，PBS液輕柔漂洗后，25g·L－1戊二醛溶液固定4h，梯度乙醇逐級脫水各30min，臨界點干燥，最后噴金。掃描電鏡觀察比較軟骨細胞在各組多孔鉭支架上的形態(tài)特點及黏附狀態(tài)。

1.5 沉淀法檢測軟骨細胞黏附率 將各組RGD（或ColⅡ）／多孔鉭置于24孔板，每孔支架滴加DMEM／F12200μL，于培養(yǎng)箱中預(yù)濕過夜，吸取濃度為1×105mL－1軟骨細胞懸液100μL接種到各組支架表面，2h后每孔再次緩慢加入DMEM培養(yǎng)液1mL，防止材料表面變干，繼續(xù)培養(yǎng)2h。于2和4h時分別取出各組支架材料，PBS輕柔沖洗，轉(zhuǎn)移至新24孔板內(nèi)，每孔加2.5g·L－1胰酶500μL消化5min。終止消化后計數(shù)板計數(shù)，取平均值，計算細胞黏附率。細胞黏附率＝黏附細胞數(shù)／接種細胞數(shù)×100%。

1.6 MTT法檢測RGD／軟骨細胞／多孔鉭復(fù)合物軟骨細胞增殖水平 MTT比色分析檢測活細胞數(shù)量。24孔板中各組多孔鉭復(fù)合物培養(yǎng)1、3、5、7、10和13d時取出，吸出培養(yǎng)液，無菌PBS清洗復(fù)合物，去除未貼壁細胞，再將其轉(zhuǎn)入新的24孔板，加入無血清DMEM／F12培養(yǎng)液800μL和MTT溶液100μL，置于37℃孵箱中孵育4h后，小心吸去培養(yǎng)液，各孔加入DMSO 800μL，低速振蕩10min，使藍紫色結(jié)晶充分溶解，吸取各孔溶液200μL至96孔板，在酶標(biāo)儀以490nm波長測定各孔吸光度（A）值，取其平均值，以A值反映細胞的增殖水平，A值越大，細胞增殖水平越高。

1.7 RGD和ColⅡ／軟骨細胞／多孔鉭復(fù)合物軟骨細胞分泌羥脯氨酸水平測定 RGD／軟骨細胞／多孔鉭復(fù)合物軟骨細胞中羥脯氨酸水平能夠間接反映軟骨細胞分泌ColⅡ的功能狀態(tài)。此項檢測中增加軟骨細胞組以對比其他各組羥脯氨酸分泌功能。將預(yù)先處理好的各組多孔鉭復(fù)合物（每組6個）置入24孔板中，取第2代軟骨細胞，接種于多孔鉭表面，培養(yǎng)液浸沒支架。培養(yǎng)7d時收集培養(yǎng)液，離心，取上清。按羥脯氨酸檢測試劑盒說明書方法進行操作，于550nm波長處用酶標(biāo)儀測定A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品A值計算各測定管中羥脯氨酸的水平。羥脯氨酸水平（mg·L－1）＝（測定管A值－空白管A值）／（標(biāo)準(zhǔn)管A值－空白管A值）×標(biāo)準(zhǔn)管濃度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 18.0軟件包對實驗數(shù)據(jù)進行分析。各組細胞黏附率、細胞增殖水平以及羥脯氨酸水平均以表示，兩組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Student－Newman－Keuls（SNK）檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 RGD多肽和ColⅡ表面修飾多孔鉭 肉眼觀察多孔鉭結(jié)構(gòu)為15mm×15mm×3mm圓片狀、灰黑色，均勻多孔狀結(jié)構(gòu)，孔隙相互連通。掃描電鏡下可見互相連通的微孔狀結(jié)構(gòu)，直徑為200～700μm。RGD多肽及ColⅡ修飾后多孔鉭支架各組外觀為灰色，表面及斷面與修飾前無明顯改變。掃描電鏡觀察修飾后多孔鉭表面均可見一層均勻、薄膜樣涂層覆蓋。見圖1。

2.2 RGD和ColⅡ修飾多孔鉭后對軟骨細胞黏附性的變化 幼兔軟骨細胞分離培養(yǎng) 原代細胞為大小均一的圓形細胞，有折光，初期生長緩慢；大部分細胞約在24h內(nèi)伸展貼壁，多角形，原代細胞7～10d可長滿培養(yǎng)瓶底。傳代培養(yǎng)后細胞增殖速度加快，細胞形態(tài)三角形、梭形，胞漿豐富，胞核大而圓，有1～2個核仁。傳代軟骨細胞培養(yǎng)約5d即可長滿培養(yǎng)瓶底，單層、不規(guī)則樣改變。見圖2（插頁五）。

圖1 多孔鉭肉眼觀和掃描電鏡觀察Fig.1 Appearance and observation of porous tantalum by SEM

各組鉭支架軟骨細胞黏附率：軟骨細胞接種于修飾前后各組多孔鉭后2和4h，細胞黏附率依次為 Ta－RGD／ColⅡ組＞Ta－ColⅡ組＞Ta－RGD組＞純Ta組，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示RGD多肽及ColⅡ修飾多孔鉭可明顯促進軟骨細胞在材料表面的吸附；二者混合后的黏附率高于各自分別修飾后的黏附率；其中高濃度RGD修飾多孔鉭（Ta－RGD／ColⅡ 5.0g·L－1組及Ta－RGD／ColⅡ 10.0g·L－1組）強于低濃度RGD修飾多孔鉭（Ta－RGD／ColⅡ 0.2g·L－1組及Ta－RGD／ColⅡ1.0g·L－1）；同時各組細胞黏附率在2和4h時比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1和圖3（插頁三）。

表1 RGD和ColⅡ修飾多孔鉭與軟骨細胞復(fù)合培養(yǎng)后細胞黏附率Tab.1 Adhesion rate of chondrocytes attached to porous tantalum modified by RGD and ColⅡ（n＝6，，η／%）

表1 RGD和ColⅡ修飾多孔鉭與軟骨細胞復(fù)合培養(yǎng)后細胞黏附率Tab.1 Adhesion rate of chondrocytes attached to porous tantalum modified by RGD and ColⅡ（n＝6，，η／%）

＊P＜0.05compared with pure Ta group；△P＜0.05compared with Ta－RGD group；#P＜0.05compared with Ta－ColⅡ group；○P＜0.05compared with Ta－RGD／ColⅡ0.2g·L－1group；▲P＜0.05compared with 2hin the same group.

Group Adhesion rate（t／h）2 4F P Pure Ta 9.9±1.5 23.4±4.4 4.517 0.000 Ta－RGD 14.4±2.3＊ 31.1±4.0＊▲ 3.392 0.000 Ta－ColⅡ 20.7±2.9＊△ 44.5±4.0＊△▲ 0.962 0.000 Ta－RGD／ColⅡ 0.2g·L－1 29.8±4.2＊△# 53.7±5.6＊△#▲ 0.479 0.000 Ta－RGD／ColⅡ1.0g·L－1 37.7±2.9＊△#○ 63.4±5.9＊△#○▲ 3.203 0.000 Ta－RGD／ColⅡ5.0g·L－1 40.5±3.6＊△#○ 66.1±4.9＊△#○▲ 0.144 0.000 Ta－RGD／ColⅡ10.0g·L－1 41.1±4.9＊△#○ 68.1±3.8＊△#○▲ 0.594 0.000 F 72.137 70.051 P 0.0000.000

2.3 RGD和ColⅡ修飾多孔鉭后軟骨細胞生長及增殖水平 MTT法測定各組軟骨細胞1～13d時A值，結(jié)果顯示：第1、3、5、7、10和13天時各組細胞增殖水平依次為Ta－RGD／ColⅡ1g·L－1組＞Ta－ColⅡ組＞Ta－RGD組＞純 Ta組。除第1天Ta－ColⅡ組與Ta－RGD組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）外，其余各組組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.4 掃描電鏡觀察RGD／多孔鉭／軟骨細胞復(fù)合物形態(tài)結(jié)構(gòu) RGD／多孔鉭／軟骨細胞復(fù)合培養(yǎng)4d，各組軟骨細胞在多孔鉭表面生長狀態(tài)良好，胞質(zhì)伸展、多角形并有偽足突起；7d時軟骨細胞在多孔鉭表面及孔隙內(nèi)生長，細胞伸展，胞體嵌入孔隙內(nèi)，細胞分泌細胞外基質(zhì)與相鄰細胞接觸。有RGD修飾的多孔鉭表面細胞數(shù)量明顯增多并與鉭結(jié)合緊密；細胞偽足跨越鉭表面微孔，與其他細胞相互融合并廣泛覆蓋鉭表面。見圖3。

表2 MTT法檢測RGD修飾多孔鉭后軟骨細胞的增殖水平Tab.2 Proliferation levels of chondrocytes on RGD－modified porous tantalum defected by MTT（n＝6，）

表2 MTT法檢測RGD修飾多孔鉭后軟骨細胞的增殖水平Tab.2 Proliferation levels of chondrocytes on RGD－modified porous tantalum defected by MTT（n＝6，）

＊P＜0.05compared with pure Ta group；△P＜0.05compared with Ta－RGD group；#P＜0.05compared with Ta－ColⅡgroup.

1 3 5 7 10 13 Groups A value（t／d）Pure Ta 0.023±0.0040.067±0.0090.146±0.0140.250±0.0080.499±0.0150.757±0.022 Ta－RGD 0.033±0.005＊0.095±0.014＊0.191±0.008＊0.396±0.015＊0.720±0.011＊0.989±0.023＊Ta－ColⅡ 0.039±0.006＊0.110±0.011＊△0.219±0.016＊△0.431±0.012＊△0.819±0.020＊△1.084±0.030＊△Ta－RGD／ColⅡ1.0g·L－10.051±0.006＊△#0.131±0.013＊△#0.292±0.015＊△#0.517±0.010＊△#1.085±0.018＊△#1.237±0.018＊△#F 19.798 23.043 89.316 590.273 2104.629 1302.506 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖3 RGD／軟骨細胞／多孔鉭復(fù)合物掃描電鏡觀察Fig.3 Observation of RGD／chondrocytes／tantalum composites by SEM

2.4 RGD和ColⅡ修飾多孔鉭后軟骨細胞中羥脯氨酸水平 按羥脯氨酸檢測試劑盒說明書方法，經(jīng)酶標(biāo)儀測定A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品A值計算第7天各組軟骨細胞中羥脯氨酸水平。結(jié)果顯示：各組軟骨細胞分泌羥脯氨酸水平依次為 Ta－RGD／ColⅡ1.0g·L－1組＞Ta－ColⅡ組＞Ta－RGD組＞軟骨細胞組＞純Ta組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；軟骨細胞組較純Ta組略高，二者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

3 討 論

當(dāng)骨移植材料植入體內(nèi)，材料表面與骨接觸的界面對于成骨起到了決定性的作用。其影響因素諸多，如材料的理化性質(zhì)（親水性、氫鍵數(shù)量）、材料的空間構(gòu)型（材料表面粗糙度、三維空間構(gòu)型）等［6－7］。良好的移植材料在體內(nèi)可以吸引體液各種成分在其表面滲透并吸附層黏連蛋白、纖維蛋白原等促進多種細胞在材料表面聚集、黏附，合成細胞外基質(zhì)，最終成骨［8］。但是對于骨質(zhì)較差或存在骨量流失（如骨質(zhì)疏松）的人來說會存在骨結(jié)合過程減慢或骨結(jié)合強度不足，需要對移植材料表面進行不同涂層或修飾的方法來改善骨生成速度及結(jié)合強度使其具有更優(yōu)越的生物相容性和骨傳導(dǎo)作用［9］。

表3 RGD修飾多孔鉭后各組軟骨細胞中羥脯氨酸水平Tab.3 Levels of hydroxyproline in chondrocytes on RGD－modified porous tantalum in various groups［n＝6，，ρB／（mg·L－1）］

表3 RGD修飾多孔鉭后各組軟骨細胞中羥脯氨酸水平Tab.3 Levels of hydroxyproline in chondrocytes on RGD－modified porous tantalum in various groups［n＝6，，ρB／（mg·L－1）］

＊P＜0.05compared with pure Ta group；△P＜0.05 compared with Ta－RGD group；#P＜0.05compared with Ta－ColⅡgroup；○P＜0.05compared with Ta－RGD／ColⅡ1.0g·L－1group.

Group Hydroxyproline level Pure Ta 4.603±0.510 Ta－RGD 6.037±0.889 Ta－ColⅡ 7.054±0.744＊△Ta－RGD／ColⅡ1.0g·L－1 8.379±0.841＊△#Chondrocytes 4.931±0.726△#○F 25.538 P 0.000

多孔鉭具有良好的抗腐蝕性、骨傳導(dǎo)性、高表面摩擦力及穩(wěn)定的力學(xué)結(jié)構(gòu)，其力學(xué)性能接近人體自然骨。在提供足夠生理支持的情況下，可以促進骨的再生、降低應(yīng)力遮擋，利于骨質(zhì)再生及重建，目前已廣泛應(yīng)用于早期股骨頭壞死、關(guān)節(jié)置換、關(guān)節(jié)翻修及椎體融合等［10－11］。本實驗所使用的國產(chǎn)多孔鉭肉眼觀孔徑0.1～0.5mm，灰黑色，表面光潔。掃描電鏡下可見材料表面及斷面為孔徑400～800μm的孔隙結(jié)構(gòu)，分布均勻、相互連通。

RGD多肽是由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸組成的肽段，存在于人體ColⅠ、纖維黏連蛋白、骨橋蛋白及骨涎蛋白中，該序列能識別并結(jié)合到細胞表面整合蛋白，是細胞跨膜蛋白中整合素的特異性配體，可以介導(dǎo)細胞間的黏附作用，從而促進細胞黏附［12－13］。本實驗體外通過物理吸附的方法將環(huán)狀RGD多肽結(jié)合于多孔鉭表面，與已成功應(yīng)用于多種生物材料表面修飾的ColⅡ作為對照，二者與新西蘭幼兔軟骨細胞共同培養(yǎng)形成RGD／軟骨細胞／多孔鉭復(fù)合物，以證實其作為軟骨組織工程支架材料修復(fù)軟骨缺損、促進軟骨再生的可行性。肉眼觀察RGD修飾多孔鉭后外觀仍為灰黑色，表面及斷面均勻分布蜂窩狀孔隙，形態(tài)結(jié)構(gòu)較修飾前無明顯改變。掃描電鏡觀察多孔鉭表面及斷面為分布均勻的微孔結(jié)構(gòu)，孔徑為400～800μm，表面可見薄層狀涂層覆蓋。軟骨細胞在其表面生長狀態(tài)良好并隨時間的延長細胞由單層結(jié)構(gòu)變?yōu)槎鄬?，胞漿突起，伸出偽足彼此相連，細胞由多孔鉭表面向內(nèi)部延伸并貫穿孔與孔之間，分泌細胞外基質(zhì)覆蓋大部分多孔鉭表面。研究［14］證明：細胞在材料表面的黏附及增殖活性是判斷植入材料生物相容性的重要指標(biāo)之一。Hsu等［15］體外將軟骨細胞接種到RGD肽修飾的殼聚糖／藻酸鹽／透明質(zhì)酸鈉復(fù)合支架上，不同時間點檢測軟骨細胞的黏附性，結(jié)果顯示：軟骨細胞分泌的糖胺聚糖和ColⅡ水平均較未修飾前升高；又將該細胞支架復(fù)合物植入兔關(guān)節(jié)軟骨缺損處，8周后軟骨缺損區(qū)完全修復(fù)。

本實驗中經(jīng)RGD修飾的多孔鉭表面細胞增殖程度優(yōu)于未修飾的純鉭組。各組間修飾效果比較：RGD修飾多孔鉭后細胞黏附及增殖效果雖不及ColⅡ，但是二者混合后的修飾作用卻遠遠大于二者各自的修飾效果；時間上比較，各組4h時細胞黏附率均大于2h；同時細胞增殖效果也隨著時間的的延長而增強；不同劑量RGD修飾后細胞黏附率比較，Ta－RGD／ColⅡ5.0g·L－1組細胞修飾效果較好，細胞黏附率高，雖然 Ta－RGD／ColⅡ10.0g·L－1組細胞黏附率稍有增加，但與前者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果證實：多孔鉭經(jīng)RGD修飾后可促進細胞黏附及增殖。研究［16－17］表明：RGD與材料表面穩(wěn)定的結(jié)合程度是促進細胞黏附的至關(guān)重要的原因。

RGD通過與材料表面生長的細胞整合素受體結(jié)合，繼而調(diào)控細胞的黏附、增殖以及各種功能。目前整合素的信號傳導(dǎo)作用已得到實驗佐證，其中纖維黏連蛋白在細胞表面的修飾作用能調(diào)節(jié)細胞黏附，這個過程是依賴RGD序列多肽與細胞外基質(zhì)特異性相結(jié)合而完成的。本研究中由于RGD對多孔鉭的修飾作用使其具有了更為良好的生物相容性，賦予了軟骨細胞適宜的黏附和增殖環(huán)境，同時軟骨細胞的分泌功能也得到了進一步的加強，軟骨細胞中羥脯氨酸的分泌水平在多孔鉭修飾后均大于修飾前，以Ta－RGD／ColⅡ組的效果最為明顯。

綜上所述，多孔鉭骨移植材料經(jīng)RGD修飾后促進了細胞黏附、增殖及分泌功能，使多孔鉭被賦予了生物活性，為獲得良好的軟骨組織工程支架材料修復(fù)軟骨缺損、促進軟骨再生提供了可能性。

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