RGD肽涂層微種植體對Beagle犬骨整合的促進(jìn)作用

武秀萍，HEE MoonKyung，胡小璐，李 冰，李世峰，馮云霞

（1.山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科，山西 太原 030001；2.韓國慶北國立大學(xué)齒科學(xué)院正畸科，大邱427－724）

穩(wěn)定有效的支抗控制是正畸治療取得良好效果的關(guān)鍵，微種植體作為正畸治療的絕對支抗，正在逐漸被更多的臨床醫(yī)師所應(yīng)用。但是由于受到負(fù)載強(qiáng)度和旋轉(zhuǎn)力等因素的影響，微種植體的使用仍受到其初期穩(wěn)定性的制約。大量研究［1－3］已經(jīng)證實(shí)：微種植體周圍的骨整合程度是其行使功能的生物學(xué)基礎(chǔ)，而影響骨整合的因素有很多，其中種植體表面特性是決定其能否與骨長期結(jié)合并行使功能的關(guān)鍵因素之一。研究［4－5］顯示：將精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸（arg－gly－asp，RGD）肽連接于材料表面可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附，進(jìn)而促進(jìn)種植體骨整合。目前的研究［4－7］均集中在材料處理和初步體外試驗(yàn)階段，相關(guān)的動(dòng)物和臨床試驗(yàn)則開展的較少。盡管已有研究［2，6，8］顯示：鈦材料表面經(jīng)過物理涂覆RGD后可促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附和鋪展，但多數(shù)研究局限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，有關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及種植體周圍骨組織改建方面的報(bào)道較少。因此本研究采用物理吸附法將RGD肽修飾到微種植體表面，并植入Beagle犬磨牙區(qū)牙槽骨，探討RGD對微種植體周圍骨整合的影響，為提高微種植體的初期穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料 18月雄性Beagle犬6只，體質(zhì)量約15kg，牙列發(fā)育完整，無齲病及牙周病變 ［山西疾病控制中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK－（晉）－2009－0003］。微種植體36枚（直徑1.5mm，長度7mm）及配套植入設(shè)備（西安中邦鈦生物制品有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和主要儀器 RGD（HPLC分析純度不低于95%）、兔抗ColⅠ的多克隆抗體、小鼠抗OC的單克隆抗體、超敏SP鼠／兔試劑盒和DAB顯色劑（博士德生物制品有限公司），2%戊巴比妥鈉、4%多聚甲醛、15%EDTA、組織塊包埋用浸液和HE染色試劑等（山西醫(yī)科大學(xué)寄生蟲實(shí)驗(yàn)室）。Leica2035組織切片機(jī)（德國Leica公司），隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱PYX－PHS（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），YD－12C型全自動(dòng)生物組織脫水機(jī)（浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），NikonEM1200照相顯微鏡和S－450型掃描電鏡（SEM）（日本日立公司），BI－2000醫(yī)學(xué)圖像采集分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），Image ProPlus 6.0圖像分析系統(tǒng)（美國Media Cybemetics公司）。

1.3 RGD肽涂層微種植體的制備和電鏡觀察將消毒好的微種植體在RGD肽溶液（1g·L－1）中完全浸沒，室溫下在密閉容器中保持24h，然后用PBS緩沖液沖洗3次，自然風(fēng)干以備用，在電鏡下觀察微種植體表面形貌。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組和脫鈣標(biāo)本制備 實(shí)驗(yàn)分組：選擇雙側(cè)上頜第2、3和4前磨牙根間（即正對前磨牙尖下距離齦緣約6mm處）為微種植體的植入部位。分別于第0、4和6周在每只Beagle犬的左右上頜隨機(jī)植入有RGD涂層和無涂層的微螺釘各1枚。最終每只犬的每側(cè)3個(gè)植入部位，隨機(jī)分配設(shè)計(jì)植入2、4和8周愈合時(shí)間的微種植體，實(shí)驗(yàn)組和對照組各18枚微種植體。

脫鈣標(biāo)本制備：以助攻方式植入，以直徑為1.0mm的引導(dǎo)鉆預(yù)先在植入?yún)^(qū)形成植入孔道（0.9%生理鹽水冷卻），并且孔道長度與種植體長度相當(dāng)，再緩慢將微種植體旋入釘?shù)乐校瑴p少植入過程對涂層的摩擦。植入術(shù)后3d，青霉素80萬U肌肉注射，種植區(qū)以3%雙氧水、0.9%生理鹽水交替沖洗。每天檢查微種植體有無損壞和脫落。8周后過量麻醉處死所有實(shí)驗(yàn)犬，取下帶種植體的上頜骨，制備約2.0cm×1.0cm×1.0cm的組織塊，常規(guī)脫鈣脫水，將種植體小心拔出，石蠟包埋后沿種植體－骨縱截面5μm連續(xù)切片。

1.5 組織學(xué)觀察 HE染色：將石蠟切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察微種植體骨界面及周圍骨組織改建情況。免疫組織化學(xué)染色：采用免疫組織化學(xué)SABC法，嚴(yán)格按ColⅠ和OC試劑盒使用程序進(jìn)行，DAB室溫顯色，蘇木素輕度復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。對照組采用0.01mol·L－1PBS代替一抗染色，鏡下觀察ColⅠ和OC染色情況。

1.6 ColⅠ和OC表達(dá)水平測定 利用BI－2000圖像采集系統(tǒng)及Image－ProPlus 6.0圖像分析系統(tǒng)。在400倍鏡下測量部位隨機(jī)選擇5個(gè)視野，測定ColⅠ和OC陽性表達(dá)強(qiáng)度，以3次測量的透光度強(qiáng)度進(jìn)行灰度值測定。以灰度值反映ColⅠ和OC表達(dá)水平，灰度值越大，表達(dá)水平越高。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2組不同時(shí)間點(diǎn)微種植體周圍骨組織中ColⅠ和OC表達(dá)灰度值以表示，組間比較采用單因素方差分析，不同愈合時(shí)間組間比較采用SNK檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 微種植體表面掃描電鏡下觀察和手術(shù)植入經(jīng)RGD肽涂層后的微種植體表面可見較為均勻的粗糙表面（圖1A），對照組微種植體表面較為光滑（圖1B），二者形貌明顯不同。微種植體植入上頜骨第2、3和4前磨牙根分叉區(qū)后，微種植體穩(wěn)定無松動(dòng)（圖2A，見插頁四），實(shí)驗(yàn)8周后去除微種植體周圍黏膜組織，可見微種植體頸部完好，骨組織無劈裂（圖2B，見插頁四）。

2.2 2組微種植體周圍骨組織形態(tài)學(xué) HE染色結(jié)果顯示：2周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組微種植體周圍出現(xiàn)核深染的骨細(xì)胞，可見明顯的成骨反應(yīng)，尚有部分纖維結(jié)締組織；對照組也可見成骨反應(yīng)，但不如實(shí)驗(yàn)組活躍，有大量成纖維細(xì)胞及骨吸收，紅細(xì)胞滲出。4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組未見纖維組織，微種植體周圍骨細(xì)胞增殖旺盛，密集處成骨細(xì)胞伸展充分，功能活躍；對照組亦出現(xiàn)大量骨細(xì)胞，但不如實(shí)驗(yàn)組密集，仍可見部分未被吸收的纖維組織。8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)層板狀骨，在原有骨組織和新骨之間可見一條明顯的新生線，骨基質(zhì)中有大量成熟骨細(xì)胞；對照組亦可見新生線，新形成的編織骨也趨于成熟，部分轉(zhuǎn)變?yōu)閷影鍫罟?，但不如?shí)驗(yàn)組的新骨密度均勻，仍可見少數(shù)纖維組織和早期幼稚骨細(xì)胞。見圖3（插頁五）。

圖1 微種植體表面電鏡觀察（×200）Fig.1 SEM observation of micro－screw implant surface（×200）

免疫組織化學(xué)染色顯示：ColⅠ在微種植體－骨界面新生的骨組織、成骨細(xì)胞胞漿和未分化的間充質(zhì)細(xì)胞胞漿中均有表達(dá)，免疫組織化學(xué)染色呈陽性；OC在各組微種植體－骨界面的骨組織中免疫組織化學(xué)染色呈棕黃色染，具有廣泛表達(dá)；而與不同時(shí)間實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，ColⅠ及OC的免疫組織化學(xué)染色較深。見圖4和5（插頁五）。

2.3 2組微種植體周圍骨組織中ColⅠ和OC表達(dá)水平 愈合2和4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組微種植體周圍骨組織中ColⅠ和OC表達(dá)水平明顯高于對照組（P＜0.05），8周時(shí)，2組ColⅠ和OC表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

實(shí)驗(yàn)組愈合4周時(shí)微種植體周圍骨組織中ColⅠ表達(dá)水平高于2和8周時(shí)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對照組4周與2和8周時(shí)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），僅2周與8周時(shí)ColⅠ表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組與對照組微種植體周圍骨組織中OC表達(dá)水平均隨愈合時(shí)間延長而逐漸升高，8周時(shí)表達(dá)水平均明顯高于2周時(shí)（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組愈合4周時(shí)OC表達(dá)水平明顯高于2周時(shí)（P＜0.05），而對照組OC表達(dá)水平2周與4周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同愈合時(shí)間2組微種植體周圍骨組織中ColⅠ和OC表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of ColⅠand OC around micro－screw implants in two groups at different healing time（）

表1 不同愈合時(shí)間2組微種植體周圍骨組織中ColⅠ和OC表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of ColⅠand OC around micro－screw implants in two groups at different healing time（）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs 2weeks；#P＜0.05 vs 4weeks.

Group Gray value of ColⅠGrayvalue of OC 2 4 8 Control 67.76±3.05 79.16±2.33 72.16±2.14△ 70.78±2.35 86.89±2.63100.76±1.28（week）2 4 8△Experimental 86.32±2.47＊ 91.88±1.96＊△73.83±1.49△# 74.94±1.81＊ 94.15±1.93＊△102.33±2.15△

3 討 論

RGD多肽是由RGD組成的一段短肽序列，廣泛存在于細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中，被認(rèn)為是目前促進(jìn)細(xì)胞黏附最有效且應(yīng)用最廣泛的多肽序列［8－10］。在金屬鈦表面連接RGD肽生物涂層的方法有復(fù)合涂層、化學(xué)偶聯(lián)和物理吸附等，但各種方法均存在一些不足，化學(xué)偶聯(lián)過程中引入的化學(xué)物質(zhì)不僅可能產(chǎn)生生物學(xué)危害而且對材料表面形貌易造成影響，層層自組裝利用靜電作用層層吸附帶異種電荷電解質(zhì)的方式進(jìn)行修飾，但由于RGD肽相對分子質(zhì)量小所帶電荷很少，因此單純依靠自組裝技術(shù)材料表面得到的RGD含量較少。物理吸附通過非共價(jià)鍵吸附于材料表面，操作簡便，盡管RGD存在厚薄不一，穩(wěn)定性及重復(fù)性較差的問題［11］，但仍有研究［8，12－14］證實(shí)這一方法可以促進(jìn)骨量增加，由于支抗微種植體在臨床使用為暫時(shí)支抗，僅在治療過程中某個(gè)階段使用，隨著治療結(jié)束，微種植體將被取出。因此在提高微種植體初期穩(wěn)定性前提下，并不需要完全的骨整合及永久的穩(wěn)定性。因此本研究采用操作方便、安全的物理涂覆法，通過改變微種植體植入方式，并以手動(dòng)緩慢旋入預(yù)備的釘?shù)?，以減少RGD的擦除。

ColⅠ屬于纖維性膠原，是ECM中最主要的成分，具有良好的生物相容性和低免疫原性［15］，可在體內(nèi)自組裝成纖維，是成骨細(xì)胞增殖早期階段的表達(dá)指標(biāo)。OC則是由成熟的成骨細(xì)胞合成和分泌的一種骨非膠原蛋白，參與調(diào)節(jié)新骨生成和骨改建過程，是成骨細(xì)胞向礦化期分化的主要判斷依據(jù)之一［16－17］。OC水平越高，說明細(xì)胞分化的程度越高。故本實(shí)驗(yàn)選擇ColⅠ和OC作為判斷骨整合的生化指標(biāo)。

研究者［18］將鈦片浸入 RGD溶液中，發(fā)現(xiàn)RGD能促進(jìn)成骨細(xì)胞對鈦片的黏附。這種附著不僅僅表現(xiàn)在細(xì)胞的數(shù)量上，同時(shí)也反映在細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變上，RGD促進(jìn)了細(xì)胞骨架內(nèi)肌動(dòng)蛋白和紐蛋白的分布、加速細(xì)胞在材料表面的附著和鋪展，提高細(xì)胞的增殖率［9－10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：微種植體植入2周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組微種植體周骨組織中ColⅠ及OC表達(dá)水平高于對照組，由于ColⅠ 具有促進(jìn)細(xì)胞與ECM和細(xì)胞－細(xì)胞間黏附的特性，從而可以推測RGD可以促進(jìn)ColⅠ 早期表達(dá)，從而促進(jìn)了成骨細(xì)胞早期附著和鋪展，使實(shí)驗(yàn)組RGD涂層的微種植體成骨反應(yīng)遠(yuǎn)比對照組明顯。微種植體植入4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組ColⅠ和OC表達(dá)水平也高于對照組，這種顯著差異一方面由于RGD使ColⅠ的表達(dá)增多導(dǎo)致成骨細(xì)胞附著和鋪展的加速，勢必帶來成骨細(xì)胞分化成熟的提前；另一方面推測RGD也有促進(jìn)OC表達(dá)的功能，對成骨細(xì)胞的增殖和分化具有正向調(diào)節(jié)作用，給種植體表面成骨提供有利條件。該結(jié)果與國內(nèi)外學(xué)者的相關(guān)研究［9，12－13］結(jié)果一致。微種植體植入8周，由于此階段骨的形成和吸收已基本達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，ColⅠ和OC的表達(dá)水平2組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以推測RGD主要是在種植體植入早期發(fā)揮促成骨能力。免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示：ColⅠ的表達(dá)出現(xiàn)在愈合2周時(shí)，4周時(shí)達(dá)到最高，隨后逐漸減弱；而OC在愈合的前4周一直增殖旺盛，之后維持較高水平，提示ColⅠ和OC可能在成骨細(xì)胞分化成熟的不同階段發(fā)揮不同作用，代表了不同的骨愈合程度，尚需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用RGD多肽對微種植體進(jìn)行修飾，通過組織學(xué)及生物化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)RGD可以在加速種植體周圍骨整合的速度、提高微種植體周圍早期骨整合程度和縮短療程等方面發(fā)揮積極作用，本實(shí)驗(yàn)為更好地應(yīng)用微種植體、實(shí)現(xiàn)微種植體的早期穩(wěn)定尋求了一條有效途徑，并為建立RGD修飾微種植體提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Mas－Moruno C，F(xiàn)raioli R，Albericio F，et al.Novel peptide－based platform for the dual presentation of biologically active peptide motifs on biomaterials ［J］.ACS Appl Mater Interfaces，2014，6（9）：6525－6536.

［2］Nayak S，Dey T，Naskar D，et al.The promotion of osseointegration of titanium surfaces by coating with silk protein sericin ［J］.Biomaterials，2013，34（12）：2855－2860.

［3］F?rster Y，Rentsch C，Schneiders W，et al.Surface modification of implants in long bone ［J］.Biomaterials，2012，2（3）：149－157.

［4］朱 青，焦 婷.鈦種植體表面處理對骨整合的影響 ［J］.口腔材料器械雜志，2014，23（1）：47－50.

［5］Broggini N，Tosatti S，F(xiàn)erguson SJ，et al.Evaluation of chemically modified SLA implants（modSLA）biofunctionalized with integrin（RGD） －and heparin（KRSR）－binding peptides［J］.J Biomed Mater Res A，2012，100（3）：703－711.

［6］Park JW，Kurashima K，Tustusmi Y，et al.Bone healing of commercial oral implants with RGD immobilization through electrodeposited poly（ethylene glycol）in rabbit cancellous bone ［J］.Acta biomater，2011，7（8）：3222－3229.

［7］Neuerburg C，Recknagel S，F(xiàn)iedler J，et al.Ultrathin sP（EO－stat－PO） hydrogel coatings are biocompatible and preserve functionality of surface bound growth factors in vivo ［J］.J Mater Sci Mater Med，2013，24（10）：2417－2427.

［8］Ferris DM，Moodie GD，Dimond PM，et al.RGD－coated titanium implants stimulate increased bone formation in vivo ［J］.Biomaterials，1999，20（23／24）：2323－2331.

［9］J?ger M，B?ge C，Janissen R，et al.Osteoblastic potency ofbone marrow cells cultivated on functionalized biometals with cyclic RGD－peptide ［J］.J Biomed Mater Res A，2013，101（10）：2905－2914.

［10］He J，Huang T，Gan L ，et al.Collagen－infiltrated porous hydroxyapatite coating and its osteogenic properties：in vitro and in vivo study ［J］.J Biomed Mater Res A，2012，100（7）：1706－1715.

［11］楊國利，何福明，趙士芳.種植體表面RGD組裝方法研究進(jìn)展 ［J］.口腔醫(yī)學(xué)2008，28（6）：328－330.

［12］Elmengaard B，Bechtold JE，Soballe K.In vivo study of the effect of RGD treatment on bone ongrowth on press fit titanium alloy implants ［J］.Biomaterials，2005，26（17）：3521－3526.

［13］Elmengaard B，Bechtold JE，Soballe K.In vivo effects of RGD coated titanium implants inserted in two bone gap model［J］.J Biomed Mater Res，2005，75A（2）：249－255.

［14］Kroese－Deutman HC，van den dolder J，Spauwen PH，et al.Influence of RGD－loaded titanium implant s on bone format ion in vivo［J］.Tissue Eng，2005，11（11）：1867－1875.

［15］Ricardo B，Juliette D，Sussane B，et al.Osteoconductive modifications of Tiimplants in a goat defect model：characterization of bone growth SR CT and histology ［J］.Biomaterials，2005，26（16）：3009－3019.

［16］Tosatti S，Schwartz Z，Campbell C，et al.RGD－containing peptide GCRGYGRGDSPG reduces enhancement of osteoblast differentiation by poly（L－lysine）－graft－poly（ethylene glycol－coated titanium surfaces ［J］.J Bone Miner Res A，2004，68（3）：458－472.

［17］Bokhari MA，Akay G，Zhang S，et al.The enhancement of osteoblast growth and differentiation in vitro on a peptide hydrogel－poly HIPE polymer hybrid material ［J ］.Biomaterials，2005，26（25）：5198－5208.

［18］Kantlehner M，Schaffner P，F(xiàn)insinger D，et al.Surface coating with cyclic RGD peptides stimulates osteoblast adhesion and proliferation as well as bone formation ［J］.Chembiochem，2000，1（2）：107－114.