PDGF／ROCK通路在AcSDKP抑制大鼠矽肺纖維化形成中的作用

張麗娟，李 倩，徐 洪，李淑鈺，裴 鑫，張文麗，楊 方

（華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心 華北理工大學(xué)老年醫(yī)學(xué)國(guó)際科技合作基地，河北 唐山 063000）

塵肺病是我國(guó)最嚴(yán)重的職業(yè)病，2013年塵肺病報(bào)告病例數(shù)占職業(yè)病報(bào)告總例數(shù)的87.72%，給國(guó)家、社會(huì)和群眾健康帶來(lái)了極大的危害［1］。而目前尚無(wú)治療塵肺病的特效方法。塵肺病以肺組織的彌漫性纖維化為其主要病理特征，探索塵肺病發(fā)病的分子機(jī)制以延緩或阻斷肺纖維化的發(fā)展進(jìn)程仍具有重要的實(shí)際意義。在矽肺形成過(guò)程中，吞噬二氧化硅（SiO2）的肺泡巨噬細(xì)胞可釋放大量細(xì)胞因子，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor－β，TGF－β），血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet－derived growth factor，PDGF）等，其中TGF－β／Smad促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化構(gòu)成了器官纖維化發(fā)病過(guò)程中一個(gè)較為明確的機(jī)制［2－5］。肌成纖維細(xì)胞已經(jīng)被認(rèn)為是器官纖維化最主要和最重要的效應(yīng)細(xì)胞，特異表達(dá)α－平滑肌肌動(dòng)蛋白（α－smooth muscle actin，α－SMA）［6－7］。研究［8－9］顯示：Rho－ROCK信號(hào)通路可通過(guò)復(fù)雜的磷酸化／脫磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控α－SMA的表達(dá)，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本研究探討肺纖維化過(guò)程中Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho－associated coiledcoil－forming protien kinase，ROCK）和另一重要的促纖維化因子—PDGF在肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及矽肺大鼠肺組織內(nèi)膠原沉積中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康成年雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量（180±10）g，購(gòu)于北京維通利華動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SLXK京20090008于河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，溫度20～26℃，濕度50%～70%，晝夜交替，自由飲食進(jìn)水。

1.2 材料、主要試劑和儀器 標(biāo)準(zhǔn)α石英粉塵（中國(guó)疾病預(yù)防控制中心）。AcSDKP（瑞士Bachem AG公司），兔抗大鼠α－SMA 、ROCK、PDGFR－β和phospho－PDGFR－β多克隆抗體（美國(guó)Epitomics公司），小鼠抗大鼠Ⅰ型和Ⅲ型膠原單克隆抗體（美國(guó)Sigma公司），兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），羊抗小鼠二抗、羊抗兔二抗、DAB顯色試劑盒和BCIP／NBT顯色試劑盒（武漢博士德生物有限公司）。藥物釋放微滲泵（美國(guó)DURECTCorporation公司）。

1.3 矽肺動(dòng)物模型建立［10］將大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，乙醚麻醉后采用非暴露式氣管插管，按照實(shí)驗(yàn)分組支氣管內(nèi)一次性灌注生理鹽水或濃度為50g·L－1的生理鹽水SiO2混懸液。①模型對(duì)照4周組：大鼠支氣管內(nèi)灌注滅菌生理鹽水1.0mL／只，腹腔內(nèi)埋入注入生理鹽水的微量藥物釋放泵，4周后處死；②模型對(duì)照8周組：同模型對(duì)照4周組處理后于8周后處死；③矽肺模型4周組：大鼠支氣管內(nèi)灌注SiO2混懸液1.0mL／只，腹腔內(nèi)埋入注入生理鹽水的微量藥物釋放泵，4周后處死；④矽肺模型8周組：同矽肺模型4周組處理后于8周后處死；⑤N－乙?；z氨酰－天門冬酰－賴氨酰－脯氨酸（N－acetyl－seryl－aspartyl－lysylproline，AcSDKP）治療組：支氣管內(nèi)灌SiO2混懸液1.0mL／只，4周后腹腔內(nèi)埋入含有AcSDKP（800μg·kg－1·d－1）的微量藥物釋放泵，4周后處死；⑥AcSDKP預(yù)防治療組，先于腹腔內(nèi)埋入含有AcSDKP的微量藥物釋放泵48h，而后支氣管內(nèi)灌SiO2混懸液1.0mL／只，持續(xù)至8周后處死。各組大鼠腹主動(dòng)脈采血后處死取肺組織，右下葉肺組織經(jīng)多聚甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋以備免疫組織化學(xué)染色，其余肺組織迅速凍于液氮中保存以備Western blotting檢測(cè)。

1.4 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)大鼠肺組織中phospho－PDGFR－β的表達(dá) 染色步驟按免疫組織化學(xué)試劑說(shuō)明書進(jìn)行，其中phospho－PDGFR－β抗體滴度為1∶150，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置陰性對(duì)照（PBS替代一抗）。采用專業(yè)圖像分析軟件Image－pro plus進(jìn)行圖像采集。

1.5 Western blotting法檢測(cè)大鼠肺組織中α－SMA、PDGFR－β、phospho－PDGFR－β和ROCK以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)水平 按照文獻(xiàn) ［11］的方法提取并測(cè)定蛋白濃度后，每孔90μg上樣，SDS－PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜。采用5%的牛血清白蛋白37℃封閉1h，一抗（PDGFR－β、phospho－PDGFR－β抗體、Ⅰ型和Ⅲ型膠原抗體1∶1000稀釋；α－SMA 抗體、ROCK 抗體和β－actin抗體1∶500稀 釋），4℃ 孵育過(guò)夜；二抗（1∶3000稀釋）37℃ 孵育1h；堿性磷酸酶顯色。用圖像掃描后以Image J軟件對(duì)蛋白表達(dá)條帶進(jìn)行吸光度（A）值的定量分析，目的蛋白條帶A值經(jīng)內(nèi)參平衡后，以各組A值與模型對(duì)照4周組A值的比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組大鼠肺組織中PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、Rock、α－SMA 以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平均以表示，組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織中phospho－PDGFR－β蛋白的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：在模型對(duì)照4和8周組，phospho－PDGFR－β陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞散在分布于肺泡壁；而在矽肺模型4和8周組，可見(jiàn)較多phospho－PDGFR－β陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞分布在矽結(jié)節(jié)與間質(zhì)纖維化區(qū)域。當(dāng)給予AcSDKP干預(yù)治療時(shí)，phospho－PDGFR－β蛋白表達(dá)無(wú)論是從分布面積還是染色強(qiáng)度來(lái)看，phospho－PDGFR－β陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞均明顯減少。見(jiàn)圖1（插頁(yè)四）。

2.2 各組大鼠肺組織 中 PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK和α－SMA蛋白表達(dá)水平 與模型對(duì)照組比較，矽肺模型組大鼠肺組織中PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK和α－SMA蛋白表達(dá)水平增強(qiáng)。其中矽肺模型4周組大鼠肺組織中PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK和α－SMA蛋白表達(dá)水平分別為模型對(duì)照4周組的2.01、3.89、2.46和1.53倍，矽肺模型8周組大鼠肺組織 中 PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK和α－SMA蛋白表達(dá)水平分別為模型對(duì)照8周組的1.99倍、3.81倍、2.07 倍和1.48倍。AcSDKP治療組和AcSDKP預(yù)防治療組大鼠肺組織中PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK和α－SMA蛋白表達(dá)水平均較矽肺模型組降低，其中AcSDKP治療組大鼠肺組織中PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK和α－SMA 蛋白表達(dá)水平分別為矽肺模型4周組的80.60%、47.30%、60.57%和84.96%，為矽肺模型8周組 的69.50%、 47.79%、 73.40%和86.09%；AcSDKP預(yù)防治療組大鼠肺組織中PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK和α－SMA 蛋白表達(dá)水平為矽肺模型8周組的 73.40%、45.97%、69.46%和84.11%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1和圖2。

2.3 各組大鼠肺組織中Ⅰ型膠原與Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平 Western blotting法結(jié)果顯示：與模型對(duì)照組比較，矽肺模型組大鼠肺組織中Ⅰ型膠原與Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)增強(qiáng)。其中矽肺模型4周組大鼠肺組織中Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平（以灰度值表示）分別為模型對(duì)照4周組的1.73和1.99倍，矽肺模型8周組大鼠肺組織中Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平分別為模型對(duì)照8周組的1.97和2.02倍。AcSDKP治療組和AcSDKP預(yù)防治療組大鼠肺組織中Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)均較矽肺模型組表達(dá)減弱，其中AcSDKP治療組Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平分別為矽肺模型4周組的81.50%和66.83%，為矽肺模型8周組 的78.77%和61.00%；AcSDKP預(yù)防治療組大鼠肺組織中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平為矽肺模型8周組的83.79%和63.30%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1和圖2。

3 討 論

矽肺病是長(zhǎng)期吸入二氧化硅粉塵所致的以肺組織彌漫性纖維化和矽結(jié)節(jié)形成為主要病理改變的常見(jiàn)職業(yè)病。在矽肺形成過(guò)程中，被激活的內(nèi)皮細(xì)胞、吞噬二氧化硅的肺泡巨噬細(xì)胞等可釋放大量的細(xì) 胞因子（包括TGF－β和PDGF等）。TGF－β和PDGF在矽肺病患者血清中的水平明顯升高［2］。ROCK通過(guò)控制細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的排列和細(xì)胞收縮調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、遷徙、增殖和凋亡，在器官纖維化的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［12－13］。本課題組前期研究［14］證實(shí)：TGF－β可以通過(guò)激活ROCK信號(hào)通路刺激大鼠肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化。PDGFR－β屬酪氨酸激酶受體，能夠被PDGF激活并和EGFR形成異二聚體，配體結(jié)合能誘發(fā)受體的二聚化并激活受體胞質(zhì)部分的酪氨酸激酶，催化ATP的γ－磷酸基轉(zhuǎn)移至受體的酪氨酸磷酸并并影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、肌動(dòng)蛋白重塑、遷移和分化［16－17］。徐惠等［18］在研究中發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)蝹?cè)輸尿管梗阻模型大鼠腎間質(zhì)中α－SMA和Ⅲ型膠原的表達(dá)與腎小管PDGFR－β和PDGF－BB的表達(dá)呈正相關(guān)。以上研究結(jié)果提示：PDGF／ROCK通路可能在矽肺大鼠肺纖維化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

表1 各組大鼠肺組織中PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK、α－SMA以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of PDGFR－β，phospho－PDGFR－β，ROCK，α－SMA，typeⅠcollagen，and typeⅢcollagen in lung tissue of rats in various groups （n＝10，）

表1 各組大鼠肺組織中PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK、α－SMA以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of PDGFR－β，phospho－PDGFR－β，ROCK，α－SMA，typeⅠcollagen，and typeⅢcollagen in lung tissue of rats in various groups （n＝10，）

Quantitative data was as fold for model control 4weeks group.＊P＜0.05 vs model control 4weeks group；△P＜0.05 vs model control 8weeks group；#P＜0.05 vs silicosic model 4weeks group；▲P＜0.05 vs silicosic model 8weeks group.

Group PDGFR－β phospho－0±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 Model control 8weeks 1.17±0.17 1.01±0.11 0.98±0.10 1.02±0.09 0.91±0.08 1.08±0.15 Silicosic model 4weeks 2.01±0.13＊ 3.89±0.19＊ 2.46±0.41＊ 1.53±0.07＊ 1.73±0.24＊ 1.99±0.15＊Silicosic model 8weeks 2.33±0.17△ 3.85±0.23△ 2.03±0.28△ 1.51±0.07△ 1.79±0.14△ 2.18±0.27△AcSDKP post－treatment 1.62±0.15#▲ 1.84±0.17#▲ 1.49±0.20#▲ 1.30±0.10#▲ 1.41±0.07#▲1.33±0.13#▲AcSDKP pre－treatment 1.71±0.12# 1.77±0.19# 1.41±0.04# 1.27±0.09# 1.50±0.11# 1.38±0.17 en Model control 4weeks 1.00±0.00 1.00±0.00 1.0 PDGFR－β ROCK α－SMA TypeⅠcollagen TypeⅢcollag#

圖2 Western blotting法檢測(cè)各組大鼠肺組織中PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK、α－SMA、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of PDGFR－β，phospho－PDGFR－β，ROCK，α－SMA，typeⅠcollagen，and typeⅢcollagen in lung tissue of rats in various groups detected by Western blotting method

本研究觀察了PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK、α－SMA以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白在矽肺模型大鼠肺組織中的表達(dá)，結(jié)果再次證實(shí)了本課題組的前期研究［6］結(jié)果，即AcSDKP可降低矽肺大鼠肺組織內(nèi)Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)。而與此同時(shí)，本文作者發(fā)現(xiàn)：矽肺模型組矽結(jié)節(jié)與間質(zhì)纖維化區(qū)域有較多phospho－PDGFR－β陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞分布。當(dāng)給予 AcSDKP干預(yù)治療時(shí)phospho－PDGFR－β蛋白表達(dá)無(wú)論是從分布面積還是染色強(qiáng)度來(lái)看，均明顯減少。此外，Western blotting結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)，當(dāng)給予AcSDKP干預(yù)治療時(shí)，大 鼠 肺組織 中 α－SMA、PDGFR－β、phospho－PDGFR－β和ROCK表達(dá)水平均較矽肺模型組明顯降低。提示PDGF可能通過(guò)激活ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)大鼠肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)矽肺大鼠肺組織內(nèi)膠原的合成。AcSDKP可能通過(guò)抑制PDGF／ROCK誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化，減少膠原的合成，進(jìn)而發(fā)揮抗矽肺纖維化的作用。

本研究進(jìn)一步探討了AcSDKP抗矽肺纖維化的可能作用機(jī)制，但矽肺的形成過(guò)程是復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)相互作用的結(jié)果，因此AcSDKP對(duì)其他細(xì)胞因子以及在細(xì)胞因子 “對(duì)答”中的作用仍需進(jìn)一步探討。

［1］中國(guó)疾病預(yù)防控制中心.2013年全國(guó)職業(yè)病報(bào)告情況報(bào)告 ［EB／OL］.http：／／www.chinacdc.cn／mtdx／cn／mtdx／wdwsdxgbd／201407／t20140701＿98951.htm.2014－07－01.

［2］姚 武，馮斐斐，焦 潔，等.TGF－β1、PDGF、CTGF在塵肺病患者血清中的表達(dá)水平變化及意義 ［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2006，30（5）：754－756.

［3］Park IH，Park SJ，Cho JS，et al.Effect of simvastatin on transforming growth factor beta－1－induced myofibroblast differentiation and collagen production in nasal polyp－derived fibroblasts［J］.Am J Rhinol Allergy，2012，26（1）：7－11.

［4］紀(jì) 輝，遲寶榮，張一寧.肝纖維化與肝星狀細(xì)胞 ［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2008，34（3）：538－542.

［5］于天水，官大威，馬 勇，等.肌成纖維細(xì)胞在纖維化疾病中的研究進(jìn)展 ［J］.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2013，2（2）：167－171.

［6］Fausther M，Dranoff JA.Integrins myofibroblasts，and organ fibrosis ［J］.Hepatology，2014，60（2）：756－758.

［7］Hu B，Phan SH.Myofibroblasts ［J］.Curr Opin in Rheumatol，2013，25（1）：71－77.

［8］扈彩霞，鄭加生，王玉珍，等.大鼠肝纖維化組織內(nèi)ROCKI、磷酸化 MBS、Thr－697和α－SMA表達(dá)增強(qiáng) ［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，30（4）：355－359.

［9］Manickam N，Patel M，Griendling KK，et al.RhoA／Rho kinase mediates TGF－β1－induced kidney myofibroblast activation through Poldip2／Nox4－derived reactive oxygen species［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2014，307（2）：159－171.

［10］閆靜波，張麗娟，李 倩，等.N－乙?；z氨酰－天門冬酰－賴氨酰－脯氨酸抗大鼠矽肺纖維化的實(shí)驗(yàn)研究 ［J］.中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2008，26（7）：401－405.

［11］楊 方，吉子言，李丹丹，等.TGF－β1介導(dǎo)Smad通路調(diào)節(jié)在大鼠矽肺纖維化形成中的作用 ［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，38（23）：4930－4932.

［12］柳 飛，付 平.RhoA／Rho相關(guān)卷曲螺旋形成的蛋白激酶信號(hào)通路與慢性腎臟疾病 ［J］.華西醫(yī)學(xué)，2011，26（5）：781－783.

［13］Wang S，Sun A，Li L，et al.Up－regulation of BMP－2 antagonizes TGF－β1／ROCK － enhanced cardiac fibrotic signalling through activation of Smurf1／Smad6complex ［J］.J Cell Mol Med，2012，16（10）：2301－2310.

［14］馬文東，袁 媛，楊 奕，等.TGF－β1 介 導(dǎo) 的 RhoA／ROCK通路在大鼠肺肌成纖維細(xì)胞分化中的調(diào)節(jié)作用 ［J］.中國(guó)病理生理雜志，2013，29（10）：1758－1763.

［15］Ostman A，Heldin CH.Involvement of platelet－derived growth factor in disease：development of specific antagonists［J］.Adv Cancer Res，2001，80：1－38.

［16］Nakagawa T，Inoue H，Sasahara M.Platelet－derived growth factor and renal disease ［J］.Curr Opin Nephrol Hyper，2012，21（1）：80－85.

［17］Jang SW，Ihm SH，Choo EH，et al.Imatinib mesylate attenuates myocardial remodeling through inhibition of platelet－derived growth factor and transforming growth factor activation in a rat model of Hypertension ［J］.Hypertension，2014，63（6）：1228－1234.

［18］徐 惠，官 陽(yáng)，楊木蘭，等.PDGF及PDGF－BB在大鼠腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中的作用 ［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2007，17（19）：2354－2358.