鹿茸多肽對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMP－2和Runx2表達(dá)的影響

張洪長，張 瑩，劉明昕，潘 志，律廣富，陳 港，姜鴻遠(yuǎn)，郭駿騏

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研究開發(fā)中心藥理研究室，吉林 長春 130117；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，吉林 長春 130021；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)圖書館參考咨詢部，吉林 長春 130117；4.長春中醫(yī)藥大學(xué)科技處，吉林 長春 130117）

鹿茸多肽（velvet antler polypeptides，VAP）是從梅花鹿茸中提取的一種多肽類生物活性因子，具有促進(jìn)骨及軟骨愈合［1］、促神經(jīng)再生功能［2］、加速皮膚創(chuàng)面的愈合［3］和提高人體的免疫能力［4－5］等功能。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓內(nèi)的多功能干細(xì)胞，一定條件下可向成骨細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein－2，BMP－2）是一種多功能蛋白，可以誘導(dǎo)新骨形成和骨折愈合［6］，在胚胎發(fā)育過程中調(diào)節(jié)干細(xì)胞增殖分化方面有著重要的作用，且在體外能夠誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨和成軟骨分化［7－8］；BMP－2主要通過經(jīng)典的Smads信號(hào)通路調(diào)節(jié)成骨分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子骨特異性轉(zhuǎn)錄因子2（runt－related transcription factor 2，Runx2）等的表達(dá)，進(jìn)而轉(zhuǎn)導(dǎo)成成骨信號(hào)，最終促進(jìn)干細(xì)胞的分化。有關(guān)VAP通過對Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響從而促進(jìn)人BMSCs（hBMSCs）中BMP－2和Runx2表達(dá)的研究目前少有報(bào)道。本研究觀察VAP對hBMSCs中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性、增殖分化及BMP－2和Runx2基因、蛋白表達(dá)的影響，探討其在BMP2／Runx2信號(hào)通路中對hBMSCs增殖和成骨分化的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 hBMSCs來自本課題組志愿者骨髓液（符合倫理要求實(shí)驗(yàn)用標(biāo)本）；梅花鹿VAP由長春中醫(yī)藥大學(xué)化學(xué)研究室提供；胎牛血清購自美國Thermo公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；ALP、CCK－8細(xì)胞增殖－毒性檢測試劑盒、RNA－OUT總RNA提取試劑盒、總蛋白定量測試盒（BCA法）和RIPA細(xì)胞裂解液均購自南京建成生物工程研究所，Anti－Runx2、Anti－h(huán)uman BMP－2、辣根過氧化物酶 HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗均購自美國R＆D Systems公司，Runx2、BMP－2和β－actin蛋白均購自英國Abcam公司。CO2培養(yǎng)箱（新加坡ESCO公司），550型酶標(biāo)儀（美國Bio－Rad公司），ABI7500PCR擴(kuò)增儀（德國Biometra公司），垂直板電泳裝置（美國BIO－RAD公司，Mini－ProteinⅢ），DYY40B型轉(zhuǎn)印電泳槽（北京六一儀器廠），Chemi Imager 5500凝膠電泳成像分析系統(tǒng)（美國 Alphainno－tech Chemi Imager公司）。

1.2 hBMSCs的分離培養(yǎng) 本課題組志愿者簽署知情同意書后，在髂后上棘穿刺采集志愿者的骨髓液5mL，將骨髓液肝素抗凝后，加等量PBS混勻，使之成為單細(xì)胞懸液，2500r·min－1離心15min。吸出試管中間骨髓單個(gè)核細(xì)胞層，加入PBS 3mL，1000r·min－1離心5min，共洗2次。棄PBS，加入培養(yǎng)液混勻，移至塑料細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后棄除懸浮細(xì)胞半量換液，之后每2d換液1次，利用hBMSCs可黏附于塑料培養(yǎng)瓶壁生長這一特性進(jìn)行分離純化［9］。細(xì)胞傳代2次后基本除去非貼壁的球形骨髓造血干細(xì)胞，得到純化的hBMSCs，選取生長良好的第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組和給藥 將處于對數(shù)生長期的hBMSCs接種于含有10% 胎牛血清DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞分為對照組和給藥組。對照組：連續(xù)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；給藥組：含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液加終濃度為5、10、15和20g·L－1VAP培養(yǎng)。

1.4 ALP活性檢測 hBMSCs以5×104mL－1的密度接種于96孔板，24h待其鋪滿孔底后更換為VAP培養(yǎng)液，給藥組分別加入終濃度為5、10、15和20g·L－1VAP，每3d換VAP培養(yǎng)液1次，誘導(dǎo)培養(yǎng)3、6、9和12d后棄培養(yǎng)液，采用ALP試劑盒測定細(xì)胞的ALP活性，酶聯(lián)免疫檢測儀測定420nm處吸光度（A）值，以A值表示ALP活性，將ALP活性最高時(shí)的VAP濃度確定為其最佳濃度，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中VAP的濃度。

1.5 CCK－8法檢測hBMSCs增殖率 選擇生長良好的第3代hBMSCs，以5×104mL－1的密度接種于96孔板中，每孔100μL，對照組及終濃度為10g·L－1VAP組各5孔，共60孔，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中，24h貼壁后每隔3d各取5孔測定細(xì)胞增殖情況。檢測時(shí)吸出培養(yǎng)液，每孔加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液100μL及CCK－810μL，CO2培養(yǎng)箱中孵育2h，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定450nm處的A值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率＝（實(shí)驗(yàn)組A值－對照組A值）／對照組A值×100%。

1.6 熒光定量PCR法檢測hBMSCs中BMP－2和Runx2mRNA表達(dá)水平 hBMSCs以5×104mL－1的密度接種于6孔板中，每孔2mL，對照組及終濃度為10g·L－1VAP組誘導(dǎo)培養(yǎng)9d后回收，用RNA－OUT提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR方法測定BMP－2和Runx2mRNA的表達(dá)水平，以β－actin為內(nèi)參。BMP－2上游引物：5′－AGCCCTTCACTGCCATCCTGTC－3′，下游引物：5′－ATTCTCTCGTTCACCGCCCAC－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為 89bp；Runx2 上游引物：5′－CAAAGGTGCAGCCTTTGTGTC－3′，下游引物：5′－TCACAGTCCGGATTGAGCTCA－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為105bp；β－actin上游引物：5′－GGCAACACAGCTCACAAGAA－3′，下游引物：5′－CGCTGTTTTCACAGAGGTCA－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為117bp。PCR反應(yīng)條件：95℃、60s；95℃、15s；60℃、15s；72℃、45s；共36個(gè)循環(huán)。通過Oligo 6.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物序列，由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。由計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算得出CT 值，根據(jù)所得CT值應(yīng)用2－△△CT法計(jì)算BMP－2和Runx2mRNA表達(dá)水平。

1.7 Western blotting法檢測hBMSCs中 BMP－2和Runx2蛋白表達(dá)水平 hBMSCs以5×104mL－1的密度接種于6孔板中，每孔2mL，對照組及終濃度為10g·L－1VAP組誘導(dǎo)培養(yǎng)9d后回收，PBS漂洗2次，加入細(xì)胞裂解液RIPA，冰上靜置15min后收集裂解液，將裂解產(chǎn)物反復(fù)凍融裂解3次，12000r·min－1離心30min，按照 BCA－200蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量，取20μg蛋白經(jīng)SDS－PAGE凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜5% 脫脂牛奶封閉2h后，孵育一抗（1∶500）4℃ 過夜。0.1%TBST洗滌3次，每次5min；加 入 用 0.1%TBST稀釋的二抗（1∶1000稀釋），室溫孵育1h。0.1%TBST洗5次，每次5min。以ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白印跡，并進(jìn)行曝光、顯影和定影。數(shù)碼相機(jī)拍照，Image J2X軟件進(jìn)行分析，以特定蛋白與β－actin蛋白的灰度值比值表示蛋白表達(dá)水平。蛋白表達(dá)水平 ＝ 特定蛋白灰度值／β－actin蛋白灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各組hBMSCs中ALP活性、細(xì)胞增殖率、BMP－2及Runx2基因和蛋白表達(dá)水平以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組hBMSCs中ALP活性 ALP活性檢測結(jié)果顯示：5、10、15和20g·L－1VAP組hBMSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)3、6、9和12d后，ALP活性均高于對照組（P＜0.01），10g·L－1VAP組細(xì)胞中ALP活性為最高，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)皆采用此濃度。見表1。

2.2 VAP作用不同時(shí)間后hBMSCs增殖率CCK－8法檢測結(jié)果顯示 ：與對照組比較，10g·L－1VAP組hBMSCs生長速度明顯加快，貼壁后VAP誘導(dǎo)3d即出現(xiàn)了生長速度的差異，此后出現(xiàn)明顯的生長速度差異，到第9天時(shí)，對照組和10g·L－1VAP組hBMSCs的增殖均達(dá)到高峰，且進(jìn)入平臺(tái)期。見表2。

2.3 熒光定量PCR檢測hBMSCs中BMP－2和Runx2mRNA表達(dá)水平 hBMSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)9d后，10g·L－1VAP組hBMSCs中 BMP－2和Runx2mRNA表達(dá)水平明顯高于對照組（P＜0.05）。見表3。

表1 各組hBMSCs中ALP活性Tab.1 ALP activities in hBMSCs in various groups （n＝6，）

表1 各組hBMSCs中ALP活性Tab.1 ALP activities in hBMSCs in various groups （n＝6，）

＊P＜0.01 vs control group.

y 0 3 6 9 12 Control 2.6±0.3 4.8±0.1 6.3±0.2 9.3±0.1 8.1±Group ALP activit（t／d）0.1 VAP（g·L－1）5 2.4±0.1＊ 6.7±0.2＊ 9.7±0.1＊ 14.2±0.2＊ 11.3±0.0＊10 2.8±0.1＊ 8.7±0.1＊ 12.8±0.2＊ 17.2±0.2＊ 14.2±0.1＊15 3.0±0.1＊ 6.4±0.1＊ 9.4±0.1＊ 13.2±0.0＊ 11.7±0.1＊20 2.7±0.1＊ 5.8±0.0＊ 8.7±0.2＊ 13.1±0.1＊ 10.8±0.1＊

表2 對照組和10g·L－1VAP組hBMSCs增殖率Tab.2 Proliferation rates of hBMSCs in control group and 10g·L－1VAP group（n＝6，，η／%）

表2 對照組和10g·L－1VAP組hBMSCs增殖率Tab.2 Proliferation rates of hBMSCs in control group and 10g·L－1VAP group（n＝6，，η／%）

＊P＜0.05 vs control group.

0 3 6 9 12 Control 0 47.9±0.0 103.4±0.0 157.4±0.0 112.2 Group Proliferation rate（t／d）±0.0 VAP（10g·L－1）0 85.5±0.0＊ 170.8±0.0＊ 276.2±1.0＊ 178.9±0.0＊

表3 對照組和10g·L－1VAP組hBMSCs中BMP－2和Runx2mRNA表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of BMP－2and Runx2mRNA in hBMSCs in control group and 10g·L－1VAP group（）

表3 對照組和10g·L－1VAP組hBMSCs中BMP－2和Runx2mRNA表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of BMP－2and Runx2mRNA in hBMSCs in control group and 10g·L－1VAP group（）

＊P＜0.05 vs control group.

Group BMP－2 Runx2 Control 2.62±0.12 2.55±0.11 VAP（10g·L－1）4.75±0.15＊ 4.67±0.14＊

2.4 Western blotting法檢測hBMSCs中 BMP－2和Runx2蛋白表達(dá)水平 hBMSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)9d后，Western blotting檢測結(jié)果顯示：10g·L－1VAP組hBMSCs中BMP－2和Runx2蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組（P＜0.05）。見表4和圖1。

表4 對照組和10g·L－1VAP組hBMSCs中BMP－2和Runx2蛋白表達(dá)水平Tab.4 Expression levels of BMP－2and Runx2protein in hBMSCs in control group and 10g·L－1VAP group（n＝6，）

表4 對照組和10g·L－1VAP組hBMSCs中BMP－2和Runx2蛋白表達(dá)水平Tab.4 Expression levels of BMP－2and Runx2protein in hBMSCs in control group and 10g·L－1VAP group（n＝6，）

＊P＜0.05 vs control group.

Group BMP－2／β－actin Runx2／β－actin Control 0.482±0.012 0.518±0.011 VAP（10g·L－1）0.725±0.010＊ 0.851±0.012＊

圖1 對照組和10g·L－1VAP組hBMSCs中BMP－2和Runx2蛋白表達(dá)電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of BMP－2and Runx2protein in hBMSCs in control group and 10g·L－1VAP group

3 討 論

VAP是從梅花鹿茸中提取的一種多肽類生物活性因子，具有促進(jìn)骨及軟骨愈合、促神經(jīng)再生功能、加速皮膚創(chuàng)面的愈合和提高人體的免疫能力等藥理作用，是鹿茸中最有效的成分之一。VAP可使BMSCs的增殖速度加快、ALP活性增加及成骨分化明顯［10］，但其中確切信號(hào)傳導(dǎo)通路機(jī)制還不完全清楚。BMSCs是骨髓內(nèi)的多功能干細(xì)胞，一定條件下可向成骨細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）作為骨生長的啟動(dòng)因子，可通過調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)成骨標(biāo)志基因的表達(dá)而誘導(dǎo)未分化間充質(zhì)細(xì)胞不可逆地分化為骨系細(xì)胞［11－13］，其中BMP－2是活性最強(qiáng)且能單獨(dú)誘導(dǎo)成骨的因子［14－16］，BMP－2通過激活 Smads信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)成骨基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮其成骨作用。對成骨性能的觀察，可以通過檢測ALP活性等來進(jìn)行判定［17］，ALP在骨化過程中發(fā)揮重要的作用。在BMSCs中檢測ALP的活性變化，有助于研究BMP－2因素對BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化的影響。在成骨分化過程中，BMSCs能夠表達(dá)一系列的成骨相關(guān)基因產(chǎn)物，如Ⅰ型膠原、ALP、骨橋蛋白和骨鈣蛋白等，Runx2就是調(diào)節(jié)這些產(chǎn)物生成的重要基因之一。Runx2是成骨細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)化因子［18］，在BMSCs分化為成骨細(xì)胞的過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用［19］。促進(jìn)BMSCs的成骨分化過程并調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的成熟是Runx2基因的主要功能。BMP－2是調(diào)控Runx2基因表達(dá)較為有效的上游細(xì)胞因子之一，其可通過多種Smads基因通路誘導(dǎo)Runx2表達(dá)，并可能通過調(diào)節(jié)Runx2等其他轉(zhuǎn)錄因子來影響干細(xì)胞的成骨分化［20－22］。本研究通過觀察VAP對hBMSCs中BMP－2和Runx2基因、蛋白表達(dá)的影響，闡明在BMP2／Runx2信號(hào)通路中VAP對hBMSCs增殖和成骨分化作用的可能分子機(jī)制。

綜上所述，VAP能夠提高h(yuǎn)BMSCs中ALP活性，促進(jìn)hBMSCs增殖分化，上調(diào)hBMSCs中BMP－2及其下游Runx2基因和蛋白的表達(dá)，這可能是VAP對hBMSCs骨形成及骨代謝影響的分子調(diào)控機(jī)制之一。

［1］Xiu ZB，Lin JH，Wu ZY，et al.Effect of pilose antler polypeptides on chondrogenic phenotype differentiation of bone marrow derived mesenchymal stem cells in vitro ［J］.J Clin Rehabilit Tissue Engin Res，2011，15（19）：3563－3566.

［2］陳 東，孟曉婷，劉佳梅，等.鹿茸多肽對胎大鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究 ［J］.解剖學(xué)報(bào)，2004，35（3）：240－243.

［3］牛 瓊，楊欣建，劉黎軍.鹿茸多肽促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合的研究 ［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2011（23）：72－73.

［4］Zha E，Li X，Li D，et al.Immunomodulatory effects of a 3.2kDa polypeptide from velvet antler of Cervus nippon Temminck ［J］.Int Immunopharmacol，2013，16（2）：210－213.

［5］Sui Z，Zhang L，Huo Y，et al.Bioactive components of velvet antlers and their pharmacological properties ［J］.J Pharm Biomed Anal，2014，87：229－240.

［6］Boden SD.The ABCs of BMPs ［J］.Orthop Nurs，2005，24（1）：49－54.

［7］Wozney J，Seeherman H.Protein－based tissue engineering in bone and cartilage repair ［J］.Curr Opin Biotechnol，2004，15（5）：392－398.

［8］Service RF.Tissue engineers build new bone ［J］.Science，2000，289（5484）：1498－1500.

［9］Bosnakovski D，Mizuno M，Kim G，et al.Isolation and multilineage differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells ［J］.Cell Tissue Res，2005，319（2）：243－253.

［10］王艷雙，羅 速，張大方，等.梅花鹿鹿茸I型膠原誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及其分子機(jī)制的研究 ［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2013，24（12）：3056－3059.

［11］Rutherford RB，Moalli M，F(xiàn)ranceschi RT，et al.Bone morphogenetic protein－transduced human fibroblasts convert to osteoblasts and form bone in vivo ［J］.Tissue Eng，2002，8（3）：441－452.

［12］Ripamonti U.Soluble osteogenic molecular signals and the induction of bone formation ［J］.Biomaterials，2006，27（6）：807－822.

［13］Yoon BS，Lyons KM.Multiple functions of BMPs in chondrogenesis［J］.J Cell Biochem，2004，93（1）：93－103.

［14］Huang Z，Ren PG，Ma T，et al.Modulating osteogenesis of mesenchymal stem cells by modifying growth factor availability ［J］.Cytokine，2010，51（3）：305－310.

［15］Noel D，Gazit D，Bouquet C，et al.Short－term BMP－2 expression is sufficient for in vivo osteochondral differentiation of mesenchymal stem cells［J］.Stem Cells，2004，22（1）：74－85.

［16］Ryoo HM，Lee MH，Kim YJ.Critical molecular switches involved in BMP－2－induced osteogenic differentiation of mesenchymal cells ［J］.Gene，2006，366（1）：51－57.

［17］Shimizu K，Ito A，Honda H.Mag－seeding of rat bone marrow stromal cells into porous hydroxyapatite scaffolds for bone tissue engineering ［J］.J Biosci Bioeng，2007，104（3）：171－177.

［18］Karsenty G.Role of Cbfa1in osteoblast differentiation and function ［J］.Semin Cell Dev Biol，2000，11（5）：343－346.

［19］Satija NK，Gurudutta GU，Sharma S，et al.Mesenchymal stem cells：molecular targets for tissue engineering ［J］.Stem Cells Dev，2007，16（1）：7－23.

［20］Matsubara T，Kida K，Yamaguchi A，et al.BMP2 regulates Osterix through Msx2and Runx2during osteoblast differentiation ［J］.J Biol Chem，2008，283（43）：29119－29125.

［21］王翠艷，魏芳晶，陰淑瑩，等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 ［J］.中國老年學(xué)雜志，2013，33（5）：1086－1088.

［22］王婷婷，周雪穎，劉黎青，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的研究進(jìn)展 ［J］.中國老年學(xué)雜志，2013，34（4）：1144－1145.