N－乙酰半胱氨酸對納米二氧化硅所致細(xì)胞毒性的抑制作用

耿維佳，李 陽，于永波，于 洋，段軍超，楊玉梅，鄒 洋，3，孫志偉

（1.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理與衛(wèi)生化學(xué)學(xué)系，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)環(huán)境毒理學(xué)北京市重點實驗室，北京 100069；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院 北京熱帶醫(yī)學(xué)研究所，北京 100050）

納米材料（nanomaterials）是指在三維空間中至少有一個維度處于納米尺度（1～100nm）或由其作為基本單元構(gòu)成的材料。近年來，隨著納米材料在生產(chǎn)、生活中的廣泛應(yīng)用，人們對其可能導(dǎo)致的有害生物學(xué)效應(yīng)也越加重視［1－3］。納米二氧化硅（silica dioxide，SiO2）是應(yīng)用最廣泛的一種工程化納米材料。已有研究［4］表明：納米SiO2顆?？赏ㄟ^多種暴露途徑進入人體，如呼吸道和皮膚等。進入人體后，可進入血液循環(huán)，主要作用于肝、脾等網(wǎng)狀內(nèi)皮組織。有研究［5－6］表明：納米材料致細(xì)胞毒性的主要原因是引起細(xì)胞中過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生。N－乙酰半胱氨酸（N－acetyl－cysteine，NAC）是谷胱甘肽的前體，是一種硫醇類化合物，常作為抗氧化劑被應(yīng)用于細(xì)胞實驗中。國內(nèi)外研究［7－9］表明：NAC對納米材料所致的細(xì)胞毒性和遺傳毒性有一定的抑制作用。然而，關(guān)于NAC對納米SiO2顆粒保護作用最適濃度的研究尚未見報道。本研究選用人正常肝細(xì)胞L－02，觀察NAC對納米SiO2顆粒導(dǎo)致細(xì)胞毒性的抑制作用，確定最適NAC濃度，為納米SiO2顆粒細(xì)胞毒性的研究提供實驗依據(jù)，以期能對納米SiO2顆粒的安全性評價和合理應(yīng)用提供幫助。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 L－02細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。粒徑為68nm的納米SiO2顆粒由吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院惠贈，RPMI－1640培養(yǎng)基購自美國 Hyclone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，胰蛋白酶購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，四甲基偶氮唑藍（MTT）購自美國Sigma公司，NAC粉末購自北京索萊寶生物有限公司，二甲基亞砜購自沈陽試劑五廠，DCFH－DA熒光探針購自碧云天生物技術(shù)研究所，本實驗所用化學(xué)試劑均為分析純。超凈工作臺（NUNR公司，美國），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（SANYO公司，日本），酶標(biāo)儀（Thermo公司，美國），倒置生物顯微鏡（Olympus公司，日本），高速離心機（Beckman公司，美國），熒光酶標(biāo)儀（Bio－Tek公司，美國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) L－02細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液中，加入100U·mL－1青霉素和100mg·L－1鏈霉素，置于37℃、5%CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3d傳代1次。取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

1.3 細(xì)胞存活率檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，用37℃水浴處理的胰蛋白酶消化后，1000r·min－1離心5min，以1×105mL－1密度接種于96孔板中，每孔100μL，并設(shè)空白孔，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。24h后，用PBS洗細(xì)胞1次，加入用RPMI－1640稀釋的不同濃度NAC工作液（1、2、5和10mmol·L－1），陰性對照組為RPMI－1640培養(yǎng)液，每孔100μL，每組6個復(fù)孔。37℃預(yù)處理1h后，用PBS洗細(xì)胞2次，加入無血清RPMI－1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，每孔加入濃度為5g·L－1MTT溶液10μL，37℃孵育4h。吸去孔內(nèi)液體，每孔加入二甲基亞砜100μL，搖床震蕩20min。用酶標(biāo)儀在490nm波長下測定各孔吸光度（A）值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率＝（實驗孔A值－空白孔A值）／（對照孔A值－空白孔A值）×100%。納米SiO2顆粒暴露組在加入NAC預(yù)處理1h后，用PBS洗細(xì)胞2次，加入用RPMI－1640稀釋的50mg·L－1納米SiO2顆粒，繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入MTT 10μL，在37℃條件下孵育4h，吸凈液體后加入二甲基亞砜100μL，震蕩20min后用酶標(biāo)儀測定。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 在倒置顯微鏡下觀察用5mmol·L－1NAC預(yù)處理后、暴露于50mg·L－1納米SiO2顆粒的L－02細(xì)胞的數(shù)目及形態(tài)學(xué)改變。

1.5 細(xì)胞中ROS水平檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，用37℃水浴處理的胰蛋白酶消化后，1000r·min－1離心5min，以1×105mL－1密度接種于96孔白板中，每孔100μL，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。24h后，先用PBS洗細(xì)胞1次，然后加入5mmol·L－1NAC工作液，在37℃預(yù)處理細(xì)胞1h，不加NAC組加入RPMI－1640培養(yǎng)液。用PBS洗2次，加入用RPMI－1640稀釋的不同濃度納米SiO2顆粒（10、20、50和100mg·L－1），對照組加入 RPMI－1640培養(yǎng)液，每孔100μL，每組6復(fù)孔，37℃染毒24h。棄培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞1次，加入用RPMI－1640稀釋的DCFH－DA工作液，每孔100μL，在37℃避光孵育30min之后用PBS洗3次，使用熒光酶標(biāo)儀測定熒光強度（激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長525nm）。結(jié)果用6個復(fù)孔的熒光強度均值表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組細(xì)胞存活率和熒光強度均以表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度NAC預(yù)處理后細(xì)胞的存活率MTT檢測結(jié)果表明：用濃度為1、2、5和10mmol·L－1NAC處理細(xì)胞1h后，細(xì)胞存活率均高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。當(dāng)NAC濃度為5mmol·L－1時，細(xì)胞存活率最高，為 108.80%；當(dāng)NAC濃度達到10mmol·L－1時，細(xì)胞存活率較5mmol·L－1NAC處理組有所下降，為106.87%。見表1。

2.2 不同濃度NAC預(yù)處理后暴露于納米SiO2顆粒的細(xì)胞存活率 MTT檢測結(jié)果表明：細(xì)胞暴露于50mg·L－1納米SiO2顆粒24h后，細(xì)胞存活率下降至72.79%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。加入不同濃度 NAC預(yù)處理，再用50mg·L－1納米SiO2顆粒染毒24h，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)隨NAC濃度先升高后降低的趨勢，并在5mmol·L－1時達到峰值。加入濃度為5mmol·L－1NAC對納米SiO2顆粒所致細(xì)胞毒性的抑制作用最明顯，與不加NAC的納米SiO2暴露組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 在不加入納米SiO2顆粒組中，NAC預(yù)處理組的細(xì)胞形態(tài)與不加NAC組比較無明顯變化，均可見數(shù)目較多的不規(guī)則形狀細(xì)胞，細(xì)胞邊界清晰。加入50mg·L－1納米SiO2顆粒后，與不加納米SiO2顆粒的對照組比較，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，圓形固縮細(xì)胞增多，邊界不清。與不加NAC組比較，NAC預(yù)處理的50mg·L－1納米SiO2顆粒暴露組細(xì)胞數(shù)目有所增加，細(xì)胞邊界較明顯。見圖1（插頁四）。

2.4 細(xì)胞中ROS水平 細(xì)胞暴露于不同濃度納米SiO2顆粒（10、20、50和100mg·L－1）后，隨納米SiO2顆粒濃度的升高，細(xì)胞中ROS水平呈升高趨勢，50和100mg·L－1納米SiO2顆粒暴露組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在相同納米SiO2顆粒濃度下，加入5mmol·L－1NAC處理組與不加NAC處理組細(xì)胞中ROS水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表1 不同濃度NAC預(yù)處理后L－02細(xì)胞存活率Tab.1 Cell viabilities of L－02cells after pretreatment of different concentrations of NAC （，η／%）

表1 不同濃度NAC預(yù)處理后L－02細(xì)胞存活率Tab.1 Cell viabilities of L－02cells after pretreatment of different concentrations of NAC （，η／%）

Group Concentration（mmol·L－1）Cell viabilit y Control 0 100.00±13.94 NAC 1 104.51±8.082 102.31±11.545 108.80±7.6810 106.87±8.50

表2 不同濃度NAC預(yù)處理后暴露于納米SiO2顆粒的L－02細(xì)胞存活率Tab.2 Cell viabilities of L－02cells after different concentrations of NAC pretreatment and SiO2nanoparticle exposure （，η／%）

表2 不同濃度NAC預(yù)處理后暴露于納米SiO2顆粒的L－02細(xì)胞存活率Tab.2 Cell viabilities of L－02cells after different concentrations of NAC pretreatment and SiO2nanoparticle exposure （，η／%）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs SiO2（50mg·L－1）group.

Group Cell viabilit y Control 100.00±13.94 SiO2（50mg·L－1）72.79±5.91＊SiO2（50mg·L－1）＋NAC（1mmol·L－1）77.89±5.90 SiO2（50mg·L－1）＋NAC（2mmol·L－1）81.96±10.61 SiO2（50mg·L－1）＋NAC（5mmol·L－1）86.37±20.06△SiO2（50mg·L－1）＋NAC（10mmol·L－1）74.93±5.84

表3 各組L－02細(xì)胞中ROS水平Tab.3 Intracellular ROS levels in L－02cells in various groups （）

表3 各組L－02細(xì)胞中ROS水平Tab.3 Intracellular ROS levels in L－02cells in various groups （）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs SiO2（10mg·L－1）group；#P＜0.05 vs SiO2（20mg·L－1）group；○P＜0.05 vs SiO2（20mg·L－1）group；▲P＜0.05 vs SiO2（100mg·L－1）group.

Group ROS level（fluorescence intensity Control 12.47±1.53 SiO2（10mg·L－1）12.79±0.71 SiO2（20mg·L－1）13.98±1.58 SiO2（50mg·L－1）15.40±1.98＊SiO2（100mg·L－1）15.84±3.85＊NAC（5mmol·L－1）10.52±0.29＊SiO2（10mg·L－1）＋NAC（5mmol·L－1）10.68±0.56△SiO2（20mg·L－1）＋NAC（5mmol·L－1）10.58±0.21#SiO2（50mg·L－1）＋NAC（5mmol·L－1）10.49±0.24○SiO2（100mg·L－1）＋NAC（5mmol·L－1） 10.26±0.22）▲

3 討 論

納米SiO2是目前世界上大規(guī)模生產(chǎn)的產(chǎn)量最高的一種納米粉體材料，具有化學(xué)純度高、分散性好和比表面積大等特性，在材料、化工、紡織、軍事和化妝品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。此外，其在醫(yī)藥領(lǐng)域如藥物載體、生物傳感器和癌癥治療方面也有十分廣闊的應(yīng)用前景［10］。納米SiO2顆粒的職業(yè)暴露、環(huán)境暴露和醫(yī)源性暴露使其可通過呼吸道、消化道以及皮膚等途徑進入人體，對機體造成潛在危害［11－12］。因此，本實驗以人正常肝細(xì)胞 L－02作為模型研究納米SiO2顆粒的細(xì)胞毒性，具有實際意義。

近年來，國內(nèi)外一些課題組的研究［13］結(jié)果表明：納米SiO2顆粒可被細(xì)胞攝取，分布于胞質(zhì)、溶酶體和線粒體等細(xì)胞器中。納米SiO2顆?？蓪?dǎo)致細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬，還可直接和間接損傷細(xì)胞DNA［14－15］。本課題組前期的體外實驗［4］表明：急性納米SiO2顆粒暴露可引起小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)以炎細(xì)胞浸潤和肉芽腫形成為主的病理改變。隨納米SiO2顆粒給藥劑量的升高，小鼠肝臟病理變化逐漸明顯。在高劑量組可觀察到肝細(xì)胞的空泡樣改變和多處小面積的炎性細(xì)胞浸潤灶。肝臟是納米SiO2顆粒毒作用的重要靶器官。

納米材料作用于細(xì)胞后，導(dǎo)致細(xì)胞中ROS水平升高是其細(xì)胞毒性和遺傳毒性的主要原因。納米顆粒特殊的理化特性，使其表面活性位點與細(xì)胞接觸后，與接觸面上的氧分子反應(yīng)，發(fā)生超氧離子歧化反應(yīng)，產(chǎn)生ROS。當(dāng)細(xì)胞中產(chǎn)生大量ROS而抗氧化系統(tǒng)不足以清除時，一方面可以損傷細(xì)胞膜，造成多細(xì)胞器的氧化損傷；另一方面，可導(dǎo)致堿基氧化損傷甚至DNA鏈斷裂。NAC是細(xì)胞實驗中常用的一種ROS抑制劑，具有直接抗氧化活性和間接抗氧化活性。NAC的巰基結(jié)構(gòu)可結(jié)合ROS的親電子基團，從而消除ROS毒性。此外，NAC易于透過細(xì)胞膜，脫乙酰基后生成半胱氨酸，作為GSH 前體，實現(xiàn)抗氧化作用［16－18］。有研究［9］表明：NAC作為抗氧化劑可以有效抑制納米材料對細(xì)胞的氧化損傷作用。本研究觀察比較NAC對納米SiO2顆粒所致細(xì)胞毒性的抑制作用。MTT實驗結(jié)果表明：5mmol·L－1NAC既不影響L－02細(xì)胞的正常生長，又能最大限度地保護細(xì)胞。ROS測定結(jié)果表明：隨著納米SiO2顆粒濃度的升高，細(xì)胞中ROS水平呈現(xiàn)明顯的升高趨勢。納米SiO2顆粒的濃度越高，NAC對ROS的抑制效果就越強；表明NAC能夠較好地抑制細(xì)胞中ROS產(chǎn)生，降低納米SiO2顆粒的細(xì)胞毒性。

綜上所述，納米SiO2顆粒可以導(dǎo)致L－02細(xì)胞的存活率下降和細(xì)胞中ROS水平升高，NAC能夠通過抑制ROS產(chǎn)生，對暴露于納米SiO2顆粒的L－02細(xì)胞起到保護作用。細(xì)胞中ROS水平升高是納米SiO2顆粒導(dǎo)致人正常肝細(xì)胞毒性的作用機制之一。

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