多發(fā)性骨髓瘤患者外周血清中microRNA－181a和microRNA－20a表達水平的檢測及其臨床意義

彭 晶，袁瑞麗，王曉琴，吳 鋒，郭 炫

（1.西安交通大學醫(yī)學院，陜西 西安 710061；2.西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科，陜西 西安 710061；3.西安交通大學醫(yī)學院醫(yī)學研究生教學實驗中心，陜西 西安 710061）

microRNA （miRNA，miR－）是一類內(nèi)源性短鏈非編碼的單鏈RNA，長度約為22個氨基酸，作用機制是microRNA與其靶mRNA的3′UTR區(qū)互補，當部分配對時阻礙靶mRNA的翻譯，當完全配對時可使靶mRNA降解，參與細胞增殖、凋亡、細胞分化、發(fā)育和逆境應答等多種生物學過程［1］。多發(fā)性骨髓瘤 （multiple myeloma，MM）是一種由漿細胞克隆性增生的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。研究［2－4］發(fā)現(xiàn)：一些microRNA可能參與 MM疾病的發(fā)生過程，并在MM中發(fā)揮致癌和抑癌的作用。研 究［5］發(fā) 現(xiàn)：microRNA－181a 是 造 血 相 關(guān)microRNA，在急性粒細胞白血病不同亞型中microRNA－181a的表達水平不同。Chen等［6］研究發(fā)現(xiàn)：microRNA－181a在B淋巴細胞轉(zhuǎn)化過程中起重要作用。另有研究［7］顯示：microRNA－181a在MM患者外周血清中高表達。目前有關(guān)microRNA－181a與MM關(guān)系的研究較少，尤其有關(guān)MM預后等方面的研究少見報道。Lionetti等［8］發(fā)現(xiàn)：microRNA－20a在MM中高表達，但亦有研究［9］顯示：microRNA－17～92簇在 MM 血漿中低表達。Xiao等［10］報道：microRNA－17～92簇可促進淋巴細胞增殖。microRNA－20a作為 microRNA－17～92簇中的一員，在MM中發(fā)揮致癌還是抑癌作用，尚有待于進一步研究。本研究探討microRNA－181a和 microRNA－20a在 MM 患者血清中的表達及其臨床意義，并初步探討其與MM發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 所有病例均為2013年1月—2014年5月于西安交通大學第一附屬醫(yī)院血液科住院的患者，正常對照者為西安交通大學第一附屬醫(yī)院查體中心同期健康體檢者。將病例組分為MM組和其他血液病組。所有MM患者均符合《血液病診斷和療效標準》中MM診斷標準且均經(jīng)臨床醫(yī)師確診，并排除心、肺和肝臟等其他器官衰竭且病情穩(wěn)定者。MM組患者32例，平均年齡（62±2）歲，其中男性21例，女性11例；其中初診14例，復發(fā)／難治18例。其他血液病組選擇無MM病史的血液科其他惡性腫瘤患者12例 （均符合 《血液病診斷和療效標準》），平均年齡 （57±4）歲，其中男性8例，女性4例；非霍奇金淋巴瘤4例，急性非淋巴細胞白血病3例，急性淋巴細胞白血病2例，慢性粒細胞白血病2例，慢性淋巴細胞白血病1例。正常對照組選擇與病例組年齡、性別相配匹并經(jīng)過常規(guī)體檢合格者20人，平均年齡 （58±3）歲，其中男性14人，女性6人。

1.2 主要試劑和儀器 BLOODmisi全血 （液體樣本）microRNA快速提取試劑盒、microRNA firststrand cDNA synthesis Kit和 microRNA Real－Time PCR Assay Kit（北京艾德萊生物科技有限公司），引物 （北京奧科鼎盛生物科技有限公司），白蛋白 （ALB）、乳酸脫氫酶 （LDH） （日本和光純藥工業(yè)株式會社），血清游離輕鏈 （FLC）（德國西門子公司），血清 M 蛋白 （法國西比亞公司），β2微球蛋白 （β2－MG） （寬范圍） （濰坊三維生物工程集團有限公司）。Bio－CFX96定量PCR儀 （美國Bio－Rad公司），LABOSPECT008全自動生化分析儀 （日本日立公司），BNⅡSystem全自動蛋白分析儀 （德國西門子公司），Sebia－2毛細管電泳分析儀 （法國西比亞公司），F(xiàn)M－2000γ免疫計數(shù)器 （西安凱普機電有限責任公司）。

1.3 血清的分離與保存 收集MM組、其他血液病組和正常對照組研究對象的新鮮血清于無菌無酶的EP管中，4℃離心機，12000×g離心5min。吸上清于新的無菌無酶EP管中 （去除紅細胞殘骸）。所有標本分2份，一份用于PCR檢測，另一份用于生化檢測，－80℃保存。

1.4 microRNA的提取和microRNA－181a 和microRNA－20a表達檢測 按照BLOODmisi全血（液體樣本）microRNA快速提取試劑盒說明書提取血清 microRNA。按照 microRNA first－strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書 ［加poly（A）尾法］進行反轉(zhuǎn)錄。以上述合成的cDNA為模板，U6為內(nèi)參，按照microRNA Real－time PCR Assay Kit試劑說明書在Bio－CXF定量PCR儀上進行擴增。microRNA－181a的 上游引物為 5′－AACATTCAACGCTGTCGGTGAGT－3′， microRNA－20a的上游引物為5′－GCGCTAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG－3′，microRNA－181a／20a 的下游共用引物由microRNA Real－Time PCR Assay Kit試劑盒提供。U6－F為 5′－CTCGCTTCGGCAGCACA－3′， U6－R 為 5′－AACGCTTCACGAATTTGCGT－3′。設(shè)定反應條件如下：94℃預變性3min；94℃、20s，60℃、40s，45個循環(huán)。然后進行溶解曲線擴增。實驗結(jié)束后進行溶解曲線分析，擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定產(chǎn)物的特異性。采用2－△CT計算microRNA－181a 和microRNA－20a的相對表達水平，U6作為內(nèi)對照，△CT＝目的基因的CT－內(nèi)參基因的CT。2－△CT的值越高，表明相對表達水平越高。

1.5 血清腫瘤負荷指標及M蛋白電泳 采用1.2中試劑及儀器測定血清腫瘤負荷指標：ALB水平、LDH活性、FLC及血清β2－MG水平，并測定 M蛋白百分比。所有檢測均在室內(nèi)質(zhì)控在控下進行，數(shù)據(jù)可靠。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。血清ALB水平、LDH活性、FLC及β2－MG水平符合正態(tài)性分布，結(jié)果以表示。M蛋白百分比、microRNA－181a 和microRNA－20a表達水平為非正態(tài)分布資料，以中位數(shù)和四分位數(shù)間距［M （P25－P75）］表示。microRNA－181a和 microRNA－20a表達水平組間比較采用Kruskal－Wallis或 Wilcoxon秩和檢驗，microRNA－181a和 microRNA－20a表達水平與血清腫瘤負荷指標及M蛋白百分比變量間的關(guān)系分析采用Spearman線性相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 microRNA－181a和 microRNA－20a擴增產(chǎn)物的溶解曲線及瓊脂糖凝膠電泳 本實驗構(gòu)建的實時熒光定量檢測microRNA－181a和 mirRNA－20a的方法特異性較好，溶解曲線分析未發(fā)現(xiàn)非特異性峰。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，只有1個目的條帶。見圖1和2。

圖1 microRNA－181a和microRNA－20a及U6產(chǎn)物的溶解曲線Fig.1 Dissolution curves of microRNA－181a，microRNA－20aand U6products

2.2 microRNA－181a和 microRNA－20a在 MM 患者血清中的表達水平 MM組、其他血液病組和正常對照組研究對象血清中 microRNA－181a和microRNA－20a表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（H＝15.218，9.891；P＝0.000，0.007）。與正常對照組比較，MM組患者血清中microRNA－181a （Z＝－2.702，P＝0.005）和 microRNA－20a（Z＝－1.979，P＝0.048）表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義。與其他血液病組比較，MM組患者血清中 microRNA－181a （Z＝－3.163，P＝0.001）和microRNA－20a （Z＝－2.722，P＝0.005）表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義。與正常對照組比較，其他血液病組患者血清中 microRNA－181a（Z＝－1.735，P ＝0.093） 和 microRNA－20a （Z ＝－1.302，P＝0.220）表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

圖2 microRNA－181a和microRNA－20a及U6產(chǎn)物的電泳圖Fig.2 Electrophoregram of microRNA－181a，microRNA－20aand U6products

表1 各組研究對象血清中microRNA－181a和microRNA－20a表達水平Tab.1 Expression levels of serum microRNA－181aand microRNA－20aof subjects in various groups ［M（P25－P75）］

2.3 microRNA－181a和 microRNA－20a表達水平與M蛋白百分比的相關(guān)性 采用Spearman線性相關(guān)分析，14例初診患者的microRNA－181a和microRNA－20a表達水平與 M蛋白百分比均呈正相關(guān)關(guān)系。見表2。

2.4 血清中 microRNA－181a和 microRNA－20a表達水平與血清腫瘤負荷指標相關(guān)性 14例初診患者的MM相關(guān)血清腫瘤負荷指標結(jié)果：FLC為（11.55±2.69）mg·L－1；ALB水平為 （30.68±1.75） g · L－1；LDH活性為（157.43 ±11.66）U·L－1；β2－MG水平為（4377.38±599.19）mg·L－1。將14例初診患者 microRNA－181a和microRNA－20a表達水平與血清腫瘤負荷指標進行Spearman相關(guān)性分析，microRNA－181a與FLC和β2－MG呈正相關(guān)關(guān)系（r＝0.780，0.552；P＝0.001，0.041）。見表3。

表2 血清中microRNA－181a和microRNA－20a表達水平與M蛋白百分比相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis on expression levels of serum microRNA－181a，microRNA－20aand M protein percentages

表3 血清中microRNA－181a和microRNA－20a表達水平與血清腫瘤負荷指標相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis on expression levels of serum microRNA－181a，microRNA－20aand tumor loaded indexes

3 討 論

研究［11］證實：microRNA參與了細胞生長發(fā)育過程中的多個環(huán)節(jié)，尤其是在腫瘤細胞的增殖、凋亡中起一定的調(diào)控作用。microRNA的調(diào)控作用在肝癌、肺癌、腸癌、胰腺癌和白血病等［12－16］多種惡性腫瘤中得到了證實。在MM的研究［17］中同樣發(fā) 現(xiàn) 有 microRNA 的 參 與。 研 究［2］發(fā) 現(xiàn)：microRNA－21在 MM 中可通過靶基因 PTEN、Rho－B及BTG2來發(fā)揮其致癌基因作用；在研究黃連素對MM的治療中發(fā)現(xiàn)：黃連素可降低microRNA－21表達水平，microRNA－21可使得靶基因IL－6／STAT3發(fā)生改變，并導致靶基因PDCD4表達上調(diào)，而后者又引發(fā)p53信號通路，最終使得腫瘤細胞發(fā)生凋亡［18］。

β2－MG主要由淋巴細胞生成，腫瘤細胞合成β2－MG的能力很強，β2－MG能反映細胞增殖、腫塊大小以及腎功能損傷情況。LDH特異性低，但其可用于觀察是否存在組織、器官損傷。ALB可間接地反映血清白細胞介素6（IL－6）的水平、肝功能和營養(yǎng)狀況。FLC是免疫球蛋白的輕鏈，分為κ和λ2種形式，是近年來作為研究腫瘤疾病的新指標之一。β2－MG、LDH、ALB和FLC作為MM腫瘤負荷指標，可反映MM疾病的療效及預后等。

本研究中 microRNA－181a在正常對照組、MM組和其他血液病組的表達水平分別為0.004、0.0452和 0.000。MM 患者血清中 microRNA－181a表達水平高于正常對照組，這與已往研究［7］結(jié)果一致。另外，MM 患者血清中 microRNA－181a表達水平與其他血液病組比較差異也有統(tǒng)計學意義，而其他血液病組患者microRNA－181a表達水平與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。由于臨床指標 （ALB、LDH、FLC、β2－MG、M蛋白）在治療后改變情況不一，本研究結(jié)果顯示：將MM組患者血清中microRNA－181a／20a表達水平與臨床指標進行相關(guān)性分析時相關(guān)性不及初診病例，初診病例用于臨床指標的相關(guān)性研究對象更佳。本研究結(jié)果顯示：microRNA－181a與M蛋白百分比呈正相關(guān)關(guān)系，血清M蛋白百分比現(xiàn)已是確診 MM疾病的特異性指標之一。microRNA－181a與腫瘤負荷指標β2－MG和FLC呈正相關(guān)關(guān)系，提示microRNA－181a參與了 MM發(fā)病過程，對MM的診斷有一定的作用，且其水平的高低與腫瘤負荷有關(guān)，對疾病的預后有良好的預測效果。

microRNA－20a在正常對照組、MM組和其他血液病組的表達水平分別為1.159、5.879和0.072。與正常對照組和其他血液病組比較，MM組患者血清中microRNA－20a表達水平差異均有統(tǒng)計學意義。其他血液病組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。此外，microRNA－20a與 M蛋白百分比相關(guān)性表現(xiàn)較 microRNA－181a更強，microRNA－20a和 microRNA－181a與 M 蛋白百分比相關(guān)系數(shù) （r）分別為0.739和0.574，且r越接近1表明相關(guān)性越好，表明microRNA－20a對于MM的診斷更有價值。

本研究曾將MM組患者按D－S標準進行分期后，發(fā)現(xiàn) microRNA－181a和 microRNA－20a表達水平在分期間比較差異無統(tǒng)計學意義?？紤]研究對象過少的緣故，本文作者在以后的研究中將不斷增加樣本數(shù)，使所研究的對象更有代表性，研究結(jié)果更有說服力。

目前MM臨床上表現(xiàn)為易復發(fā)、難治愈，這與缺乏良好的指標有關(guān)。本研究結(jié)果表明：microRNA－181a和 microRNA－20a均參與 MM 的發(fā)病過程，可作為 MM 的診斷標志物；microRNA－20a對 MM 診斷效果優(yōu)于 microRNA－181a；microRNA－181a表達水平升高表明患者的預后不良。將二者作為MM的檢測指標有助于對MM的診斷及預后判斷。

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