高溫脅迫對皺紋盤鮑幼鮑免疫因子的影響

賈艷麗，王江勇，孫敬鋒

（1.中國水產(chǎn)科學院 南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州510300；2.廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東 廣州510300；3.天津農(nóng)學院 水產(chǎn)科學系，天津300384）

鮑（Abalone）的分類地位屬于軟體動物門、腹足綱、前鰓亞綱、原始腹足目、鮑科、鮑屬［1］，賦有“海產(chǎn)八珍”之一的美譽，鮑自古便是餐桌上的上等菜肴，除去可食用部位，其外殼亦可入藥，具有很高的營養(yǎng)和藥學價值。在中國，鮑的養(yǎng)殖主要分布在大連、山東、福建、廣東、海南、廣西等沿海地區(qū)，主要養(yǎng)殖種類為北方沿海的皺紋盤鮑（HaliotisdicushannaiIno）以及南方沿海的雜色鮑（HaliotisdiversicolorReeve）［2］，2011年的產(chǎn)量居世界第一，中國已成為世界第一養(yǎng)鮑大國［3－4］。

然而由于大規(guī)模生產(chǎn)導致的環(huán)境惡化、近交嚴重、種質(zhì)退化以及病害頻發(fā)［5－9］等問題，嚴重影響了鮑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。作為鮑的主產(chǎn)區(qū)，南方海域雜色鮑不明原因的大規(guī)模死亡給鮑產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失［10－11］，科研工作者嘗試將北方的皺紋盤鮑引進南方養(yǎng)殖，在一定程度上緩解了這種壓力，然而皺紋盤鮑高溫季節(jié)的死亡率不容忽略，因此進一步提高皺紋盤鮑的耐高溫性能是科研工作者的研究方向。賈艷麗等①賈艷麗，王江勇，劉廣鋒，等.高溫脅迫對皺紋潘鮑幼鮑生長和存活的影響.南方水產(chǎn)科學，2014接收已經(jīng)篩選出具有一定抗逆性能的皺紋盤鮑雜交鮑，通過高溫脅迫試驗得出該鮑耐受溫度可超過30℃，該試驗從生理學角度探索其耐高溫性能，期望能夠為培育出抗逆性強的新品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗時間為2013年11月中旬至2013年12月末，選取生長健康殼長接近10mm的皺紋盤鮑360只，平均放置于15個尺寸為50cm×30cm×40cm的玻璃水缸中，玻璃缸內(nèi)放置鮑磚以供鮑附著并有一定的遮光作用。試驗共分4組，每組3個平行，每個平行30只鮑，試驗開始時選取殼長相近的幼鮑進行實驗，經(jīng)測量并進行數(shù)據(jù)分析后可知各組鮑的平均殼長為11±0.50mm，平均殼寬8±0.50mm，濕質(zhì)量為0.2±0.05g，均值、標準差和組間的差異性詳見表1。

表1 各組鮑試驗開始時的規(guī)格Table 1 Size of each group at the beginning of the research

1.2 日常管理

每個水缸接通一個充氣石保證溶氧不低于5mg·L－1。試驗期間每天下午投喂適量鮑配合飼料，次日早晨采用虹吸法從底部清除殘餌和糞便，并添加經(jīng)過濾及預(yù)熱至所需溫度的新鮮海水，依據(jù)試驗設(shè)計記錄死亡情況，通過控制加熱棒的溫度來調(diào)節(jié)試驗組溫度，溫差范圍控制在±0.5℃以內(nèi)。

1.3 試驗方法

將上述15個玻璃水缸平均分為4組，每組3個平行，其中一組為對照組，水溫維持自然水溫（實驗開始時溫度為22℃，在20～23℃變化），其他4組利用加熱棒（JEBO佳寶）采用溫度漸變（30℃以下每3d升溫1℃，30℃以上每周升溫1℃）的方式分別升溫至25，28和31℃。當溫度升至預(yù)定溫度并維持一周后采樣，每個平行取3只鮑，－80℃保存，由于鮑個體小，不能取出足夠血淋巴進行免疫因子的測定，該試驗所取樣本為鮑的肌肉組織。免疫因子（堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM））和組織中總蛋白含量（BCA）的具體測定方法見南京建成生物工程研究所研制的試劑盒使用說明，每個平行取3只鮑，分別測定每只鮑上述幾種免疫因子的活性。對各實驗組進行溫度控制時，用加熱棒對水體進行加熱，其他環(huán)境條件一致，在對結(jié)果進行分析時可以忽略其他因素的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理

按照所購買試劑盒說明書的公式計算各種酶的活性，并繪制溫度－酶活性柱形圖，應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 高溫脅迫對皺紋盤鮑幼鮑SOD活性的影響

水溫由22℃升到25℃時，皺紋盤鮑幼鮑體內(nèi)SOD活性升高3倍，差異顯著（P＜0.05，圖1）；當水溫升至28℃時，SOD活性在25℃的基礎(chǔ)上升高近2倍，同樣有顯著差異（P＜0.05，圖1）；然而，當溫度由28℃升至31℃時，SOD的活性變化不顯著（P＞0.05，圖1）。

圖1 各試驗組皺紋盤鮑幼鮑體內(nèi)SOD活性Fig.1 SOD activity of young Haliotis discus hannai Ino in test groups

2.2 高溫脅迫對皺紋盤鮑幼鮑AKP活性的影響

水溫由22℃升至25℃時，AKP的活性升高（P＞0.05，圖2）；水溫由25℃升至28℃時，AKP活性顯著升高（P＜0.05，圖2）；水溫由28℃升至31℃時，AKP活性不再上升，出現(xiàn)下降的趨勢（P＞0.05，圖2）。

圖2 各試驗組皺紋盤鮑幼鮑體內(nèi)AKP活性Fig.2 AKP activity of young Haliotis discus hannai Ino in test groups

2.3 高溫脅迫對皺紋盤鮑幼鮑ACP活性的影響

水溫由22℃升至25℃時，ACP的活性上升（P＞0.05，圖3）；水溫由25℃升至28℃時，ACP活性顯著升高（P＜0.05，圖3）；水溫由28℃升至31℃時，ACP活性顯著升高（P＜0.05，圖3）。

圖3 各試驗組皺紋盤鮑幼鮑體內(nèi)ACP活性Fig.3 ACP activity of young Haliotis discus hannai Ino in test groups

2.4 高溫脅迫對皺紋盤鮑幼鮑LZM活性的影響

水溫由22℃升至25℃時，LZM的活性升高（P＞0.05，圖4）；水溫由25℃升至28℃時，LZM活性顯著升高（P＜0.05，圖4）；水溫由28℃升至31℃時，LZM活性出現(xiàn)顯著下降的趨勢（P＜0.05，圖4）。

圖4 各試驗組皺紋盤鮑幼鮑體內(nèi)LZM活性Fig.4 LZM activity of young Haliotis discus hannai Ino in test groups

3 討論

非特異性免疫是生物與生俱來的保護屏障，對外界刺激有直接并迅速的反應(yīng)，因此非特異性免疫因子的變化情況能夠反映出生物體在外界刺激下的機體狀況，下面分別闡述在高溫脅迫下鮑幾種非特異性免疫因子的變化情況。

3.1 高溫脅迫對鮑肌肉組織中SOD活性的影響

SOD是參與防御抗氧化的關(guān)鍵酶之一，當生物機體受到外界刺激時會不同程度的影響SOD的活性，短期輕度的逆境脅迫會使SOD活性升高來消除這種脅迫造成的損傷，長期重度逆境脅迫往往會使SOD活性降低從而使機體受到傷害［12］。溫度升高會使機體產(chǎn)生過多的活性氧，此時就需要SOD來催化過氧陽離子的歧化反應(yīng)，消除自由基造成的傷害［13－15］。該試驗采用溫度漸變的方式對皺紋盤鮑幼鮑進行溫度脅迫，當溫度由22℃升高至28℃時SOD的活性顯著升高，這與上述理論相符，而當溫度由28℃升高至31℃時，SOD活性沒有顯著變化，這可能是因為SOD活性已經(jīng)升高到機體所能調(diào)控的最高值，如果溫度繼續(xù)升高可能會對機體造成傷害，就該實驗而言，皺紋盤鮑幼鮑對31℃這一溫度存在耐受性。溫度驟變條件下三疣梭子蟹［15］SOD活性變化以及溫度驟變對南美白對蝦［16］抗氧化系統(tǒng)的影響與該溫度漸變條件下皺紋盤鮑幼鮑SOD活性變化有異曲同工的效果，時少坤［17］研究的水溫脅迫對雜交鮑免疫因子的影響中，6，12，24℃組SOD活性與對照組18℃組無顯著差異，30℃組SOD活性顯著降低，而該實驗中31℃組SOD的活性仍處于較高水平，根據(jù)兩種鮑在高溫下SOD活性大小的差異可以推測該實驗所選皺紋盤鮑幼鮑比時少坤的研究中所選雜交鮑能夠耐受更高的溫度。

3.2 高溫脅迫對鮑肌肉組織中磷酸酶AKP、ACP活性的影響

磷酸酶是生物機體重要的代謝調(diào)控酶類，參與磷酸基團的代謝和轉(zhuǎn)移，同時也是溶酶體的重要組成部分，當機體受到外來物質(zhì)入侵時，能夠及時參與物質(zhì)的轉(zhuǎn)運來破壞或消除外來物質(zhì)的侵害，達到防御的作用［18－19］。隨著溫度由22℃升高到28℃，AKP和ACP活性均通過不同程度的升高來調(diào)控機體適應(yīng)這種外界條件的改變。在31℃條件下，ACP活性繼續(xù)升高而AKP活性沒有繼續(xù)升高，這可能是機體對兩種酶的調(diào)控存在一定的差異，也可推測31℃下的ACP或AKP活性已達到或接近機體承受的上限，溫度再高的話會引起機體損傷。這與時少坤［17］研究的溫度漸變下ACP活性無顯著變化，但30℃下活性顯著下降結(jié)果類似，也可支持該實驗的推測。同理，溫度驟變會引起ACP、AKP活性顯著變化這一現(xiàn)象也在吳丹華等［15］、李強等［19］對三疣梭子蟹免疫因子的影響研究中得到證實。

3.3 高溫脅迫對鮑肌肉組織中LZM活性的影響

溶菌酶是一種水解酶，可以減輕機體內(nèi)毒素帶來的傷害，可以增強機體免疫力，在非特異性免疫中也發(fā)揮重要作用，其活性大小受到溫度、pH和化學物質(zhì)等的影響［20］。溫度對水生動物的影響至關(guān)重要，機體溶菌酶活力的大小直接反映了水生動物的免疫狀況，因此機體LZM活力的大小是衡量該溫度是否適宜生物生存的重要指標［21］。該實驗中隨著溫度由22℃升高到28℃，機體通過調(diào)節(jié)LZM活性的升高提高了免疫狀況來度過這種外界脅迫，時少坤［17］的研究中高溫下（30℃）皺紋盤鮑LZM活性顯著下降，同樣也有研究證實水溫升高會使黑唇鮑［22］、近江牡蠣［23］、櫛孔扇貝［24］、菲律賓蛤仔［25］LZM 活性下降，在31 ℃ 條件下LZM活性相對于28℃有顯著下降的趨勢，但仍高于對照組22℃下的活性，說明該種幼鮑可以耐受31℃的高溫，但活性有所下降說明機體在過高溫度下會出現(xiàn)免疫下降的狀況。

本實驗通過幾種非特異性免疫因子的變化情況對所選皺紋盤鮑幼鮑的耐溫性進行了初步分析，實驗結(jié)果為進行下一步的篩選工作提供了很好的基礎(chǔ)，項目組將對28℃以上高溫中仍然存活下來的皺紋盤鮑幼鮑繼續(xù)進行選育，選出更具耐高溫潛力的品系，并進一步研究鮑體內(nèi)非特異性免疫因子在受外界刺激后的變化和對機體的保護機制，然而熱休克轉(zhuǎn)錄因子的信號轉(zhuǎn)導已經(jīng)在線蟲中展開了研究［26］，在后續(xù)的試驗中將選取不同地區(qū)選育的皺紋盤鮑幼鮑進行對比，結(jié)合其在高溫條件下的生長、死亡情況、體內(nèi)的生理生化反應(yīng)［27］和溫度驟變條件下熱休克蛋白的表達情況對比分析不同來源鮑對高溫的耐受性，試圖探尋其耐熱機理，為抗逆雜交鮑的選育提供依據(jù)。

（References）：

［1］LIU X H.Biological characteristics and artificial breeding technology of abalone［J］.Journal of Anhui Agriculture Science，2009，37（13）：5872－5874.劉孝華.鮑魚生物學特性及人工養(yǎng)殖技術(shù)［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37（13）：5872－5874.

［2］ZHAO H E.Culture and proliferation of abalone［M］.Shenyang：Shenyang Press，1999：67－89.趙洪恩.鮑的增養(yǎng)殖［M］.沈陽：沈陽出版社，1999：67－89.

［3］KE C H.Present situation and prospect of Chinese abalone culture industry［J］.China Fisheries，2013，56（1）：27－30.柯才煥.我國鮑魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與展望［J］.中國水產(chǎn)，2013，56（1）：27－30.

［4］FAO Fish Department.Fish Stat Plus：Universal software for fishery statistical time series，version2.3［DB／OL］.（2013－04）［2014－06－13］http：∥www.fao.org／fishery／stastics／software／fishstat／en.

［5］YE L，YU K K，WANG R C，et al.The study on the pathogenic bacteria of the fester disease of cultured juvenile discus abalone［J］.Journal of Fishery Science of China，1997，4（4）：43－48.葉林，俞開康，王如才，等.皺紋盤鮑幼鮑潰爛病病原菌的研究［J］.中國水產(chǎn)科學，1997，4（4）：43－48.

［6］LI X，WANG B，LIU S F，et al.Studies on pathogeny and histopathology of“Crack Shell Disease”ofHaliotiadiscushanni［J］.Journal of Fisheries of China，1998，22（1）：61－66.李霞，王斌，劉淑范，等.皺紋盤鮑”裂殼病”的病原及組織病理研究［J］.水產(chǎn)學報，1998，22（1）：61－66.

［7］ZHANG C X，WANG J，SU Y Q，et al.Virosis of culturedHaliotisdivesicolorin southern Fujian［J］.Journal of Xiamen University：Natural Science，2003，42（3）：363－369.張朝霞，王軍，蘇永全，等.閩南養(yǎng)殖九孔鮑暴發(fā)性流行病的病原研究［J］.廈門大學學報：自然科學版，2003，42（3）：363－369.

［8］LIU G F，ZHOU S N，XU L W，et al.Studies on the pathogenic bacteria of acute death and striping off disease in cultured post larvae small abaloneHaliotisdiversicolorReeve［J］.Journal of Fishery Sciences of China，2006，13（4）：655－661.劉廣鋒，周世寧，徐力文，等.雜色鮑幼苗 “急性死亡脫落癥”病原菌分析［J］.中國水產(chǎn)科學，2006，13（4）：655－661.

［9］WANG J Y，LIU G F，XU L W，et al.Studied on epidemiology of the“BOARD－DETACHED”disease of juvenile abalone，HaliotisdiversiclolorReeve［J］.Transactions of Oceanology and Limnology，2008，30（3）：161－167.王江勇，劉廣鋒，徐力文，等.雜色鮑鮑苗“掉板癥”病因的探討［J］.海洋湖沼通報，2008，30（3）：161－167.

［10］WANG J Y，LIU G F，WU Z Y，et al.Abalone，Present and prospect of laval rearing ofHaliotisdiversiclolorReeve in Guangdong Province［J］.Fisheries Science＆Technology，2006，23（3）：1－3.王江勇，劉廣鋒，吳忠業(yè).廣東省雜色鮑苗種培育的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢［J］.水產(chǎn)科技，2006，23（3）：1－3.

［11］YANG R，JIANG J Z，WANG J Y，et al.Research progress of the Low－temperature Virus Disease ofHaliotisdiversicolor［J］.Agriculture Science of Guangdong，2013，（2）：114－117.楊銳，姜敬哲，王江勇，等.雜色鮑低溫病毒病研究進展［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2013，（2）：114－117.

［12］TANG X X，ZHANG P Y.Effects of anthrance on SOD activity ofGymnocorymbusternetzi［J］.Journal of Fisheries of China，2000，24（3）：217－220.唐學璽，張培玉.蒽對黑鮶超氧化物岐化酶活性的影響［J］.水產(chǎn)學報，2000，24（3）：217－220.

［13］WINSTON G W.Oxidants and antioxidants in aquatic animals［J］.Comparative Biochemistry Physiology Part C：Comparative Pharmacology，1991，100（1－2）：173－176.

［14］CHEN C S，WANG S H，JI D H，et al.Effects of ammonia－N on activities of CAT and SOD inHaliotisdiversicolorsupertexta［J］.Journal of Shanghai Fisheries University，2001，10（3）：218－222.陳昌生，王淑紅，紀德華，等.氨氮對九孔鮑過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活力的影響［J］.上海海洋大學學報，2001，10（3）：218－222.

［15］WU D H，ZHENG P P，ZHANG Y Y，et，al.Effect of temperature stress on serum nonspecific immune factors in swimming crabPortunustrituberculatus［J］.Journal of Dalian Ocean University，2005，（4）：370－375.吳丹華，鄭萍萍，張玉玉，等.水溫脅迫對三疣梭子蟹血清中非特異性免疫因子的影響［J］.大連海洋大學學報，2005，（4）：370－375.

［16］SUN J H，XU X，JI Y B，et al.Effects of sudden drop in temperature on activities of antioxidant enzymes ofLitnpenaeusvannamei［J］.Journal of Tianjin Agriculture University，2008，15（3）：7－10.孫金輝，徐霞，季延濱，等.溫度驟降對南美白對蝦仔蝦抗氧化機能的影響［J］.天津農(nóng)學院學報，2008，15（3）：7－10.

［17］SHI S K.Studies on the immune parameters of mollusc stimulated by environmental［D］.Shanghai：Shanghai Ocean University，2013.時少坤.環(huán)境因子對貝類幾種免疫因子影響的研究［D］.上海：上海海洋大學，2013.

［18］CHEN Q X，CHEN S L，SHI Y，et al.Characterization of alkaline phosphatase fromPenaeuspenicillatus［J］.Journal of Xiamen University：Natural Science，1996，35（2）：257－261.陳清西，陳素麗，石艷，等.長毛對蝦堿性磷酸酶性質(zhì)［J］.廈門大學學報：自然科學版，1996，35（2）：257－261.

［19］LI Q，LI H，JIANG C J，et al.Comparison of immune parameters in the haemolymph of white－leg shrimpLitopenaeusvannameiat different temperatures［J］.Journal of Dalian Ocean University，2008，23（2）：132－135.李強，李華，姜傳俊，等.溫度對凡納濱對蝦血淋巴免疫指標的影響［J］.大連水產(chǎn)學院學報，2008，23（2）：132－135.

［20］CHEN Y，JIANG M F，YE Y H，et al.Advances in the study of lysozyme［J］.Journal of Biology，2009，26（4）：4－6.陳艷，江明鋒，葉煜輝等.溶菌酶的研究進展［J］.生物學雜志，2009，26（4）：4－6.

［21］GUO L.Study on physiological and biochemical of turbot at different temperature，salinity，and their interaction［D］.Shanghai：Shanghai Ocean University，2012：5.郭黎.大菱鲆在不同溫度－鹽度及其交互作用下機體生理生化指標［D］.上海：上海海洋大學，2012：5.

［22］DANG V T，SPECK P，BENKENDORFF K.Influence of elevated temperatures on the immune response of abalone，Haliotisrubra［J］.Fish＆Shellfish Immunology，2012，32（5）：732－740.

［23］PAILLARD C，ALLAM B，OUBELLA R.Effect of temperature on defense parameters inmanila clamRuditapesphilippinarumchallenged withVibriotapetis［J］.Diseases of Aquatic Organisms，2004，59（3）：249－262.

［24］ZHANG W Z，YU Z L，AI W L，et al.Effects of environmental stresses on plasma protein and bactericidal activities ofChlamysfarreri［J］.Journal of Guangdong Ocean University，2011，31（1）：62－66.張維柱，余招龍，艾偉嶺，等.環(huán)境脅迫對櫛孔扇貝（Chlamysfarreri）血漿蛋白及其抗菌活性的影響［J］.廣東海洋大學學報，2011，31（1）：62－66.

［25］YU J H，SONG J H，CHOI M C，et al.Effects of water temperature change on immune function in surf clams，Mactraveneriformis（Bivalvia：Mactridae）［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2009，102（1）：30－35.

［26］BAIRD M A.DOUGALAS P M，SIMIC M S，et al.HSF－1－mediated cytoskeletal integrity determines thermotolerance［J］.Science，2014，346（6207）：360－363.

［27］DUAN Z G，WU J Y，LI W S.Research progress on effects of low temperature on tilaplia［J］.South China Fisheries Science，2011，7（6）：77－82.段志剛，吳金英，李文笙.低溫對羅非魚類影響的相關(guān)研究進展［J］.南方水產(chǎn)科學，2011，7（6）：77－82.