丁香酚對(duì)大西洋鮭麻醉效果的實(shí)驗(yàn)研究＊

李 靖，劉寶良，2，王順奎，于凱松，劉 鷹＊

（1.中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所，山東 青島266071；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島266071；3.山東東方海洋科技股份有限公司，山東 煙臺(tái)264051）

大西洋鮭（Salmosalar）屬鮭科，鮭屬，中文俗稱“三文魚”，英文俗稱“Atlantic salmon”［1］。大西洋鮭是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值均很高的魚類，它的存活和生長(zhǎng)對(duì)水質(zhì)要求很高，且生性活潑，對(duì)多種理化刺激應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈，導(dǎo)致其在分選和運(yùn)輸過(guò)程容易受到損害。尤其是活魚運(yùn)輸過(guò)程中密度大、時(shí)間較長(zhǎng)、水質(zhì)易變壞、魚體容易受傷等原因，會(huì)嚴(yán)重影響運(yùn)輸過(guò)程中的成活率，降低經(jīng)濟(jì)效益。將麻醉劑應(yīng)用在活魚運(yùn)輸中是一種目前較為常用的方法，該方法不僅可以降低運(yùn)輸過(guò)程中魚類的耗氧率和氨氮排泄率，防止水質(zhì)變壞，而且可以抑制魚類的過(guò)度活動(dòng)，從而有效防止魚類在運(yùn)輸容器內(nèi)因碰撞而造成的傷亡，大大提高運(yùn)輸?shù)某苫盥剩岣呓?jīng)濟(jì)效益［2］等。

魚用麻醉劑是一類能不同程度抑制魚腦感覺(jué)中樞，使其失去反射動(dòng)作的物質(zhì)，其作用原理為：首先抑制腦的皮質(zhì)（觸覺(jué)喪失期），再作用于基底神經(jīng)節(jié)與小腦（興奮期），最后作用于脊髓（麻醉期）［3］。丁香酚（Eugenol）是一種成本低廉、效果明顯、在近年受較多關(guān)注的魚類麻醉劑［4］。丁香酚即4－烯丙基－2－甲氧基苯酚，又稱子丁香酚，廣泛存在于丁香酚、肉桂葉油、樟腦油等芳香油中［5］。近年來(lái)，丁香酚被廣泛應(yīng)用于金魚（Carassiusauratus）［6］、鯉魚（Cyprinuscarpio）［7］、虹鱒（Salmogairdneri）［8］和大黃魚（Pseudosciaenacrocea）［9］等魚類的親魚采卵、活魚運(yùn)輸過(guò)程中。目前已有報(bào)道使用丁香酚麻醉塞內(nèi)加爾鰨［10］、虹鱒（Oncorhynchusmykis）［8，11］、河鲀（Siganuslineatus）［12］、黃尾雀鯛（Pomacentrusamboinensis）［13］等的研究。迄今為止，有關(guān)丁香酚對(duì)大西洋鮭的麻醉效果研究報(bào)道相對(duì)較少。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

丁香酚（上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)），密度（25℃）為1.036～1.050g／mL，表觀為淺黃色揮發(fā)性稀薄液體。均在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天將試驗(yàn)中所用丁香酚與無(wú)水乙醇（V丁香酚∶V無(wú)水乙醇＝1∶9）混合乳化備用。實(shí)驗(yàn)用大西洋鮭來(lái)自山東東方海洋三文魚養(yǎng)殖基地，該基地養(yǎng)殖的大西洋鮭魚卵進(jìn)口自挪威，不同規(guī)格魚的飼喂時(shí)間為6～24個(gè)月不等。挑選體健無(wú)傷、規(guī)格適當(dāng)?shù)膫€(gè)體作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，選擇的個(gè)體體長(zhǎng)為15～50cm，體重為80～1 500g。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

根據(jù)實(shí)驗(yàn)用魚的規(guī)格和不同實(shí)驗(yàn)要求，在120cm×60cm×60cm的玻璃缸或最大容積為80L的泡沫箱內(nèi)進(jìn)行麻醉和復(fù)蘇試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)使用氣泵鼓氣維持水體中溶氧在8mg／L以上。實(shí)驗(yàn)用水為深井海水，pH為7.9～8.1，鹽度約為35。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究以Summerfelt等［14］描述的麻醉和恢復(fù)階段作為標(biāo)準(zhǔn)（表1）。未提及溫度的實(shí)驗(yàn)均采用養(yǎng)殖水溫（14 ℃）。

表1 麻醉表現(xiàn)及程度分期［14］Table 1 Behaviors and stages of anaesthesia induction［14］

1.3.1 浸浴10min麻醉濃度和半致死濃度（LC50）的研究

試驗(yàn)中根據(jù)大西洋鮭的體長(zhǎng)、體重，劃分出不同的規(guī)格，并據(jù)此選取大小不等的泡沫箱或玻璃缸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1）麻醉濃度：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)前5min配制6，7，8，9，10，11和12mg／L丁香酚溶液；取不同規(guī)格大西洋鮭各10尾，分別置于不同質(zhì)量濃度梯度丁香酚溶液中；浸浴10min，記錄最后狀態(tài)并轉(zhuǎn)移至充分曝氣的純凈海水中進(jìn)行恢復(fù)，所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置一組重復(fù)；計(jì)算麻醉率。

2）半數(shù)致死濃度（LC50）：使用孫氏改進(jìn)寇氏法［15］進(jìn)行計(jì)算。根據(jù)該方法對(duì)待測(cè)藥物濃度梯度的要求，實(shí)驗(yàn)前5min配制41，50，55，60，66，73mg／L丁香酚溶液；取不同規(guī)格大西洋鮭各10尾分別置于不同質(zhì)量濃度梯度丁香酚溶液中，每一規(guī)格每一質(zhì)量濃度設(shè)置一組平行；浸浴10min，轉(zhuǎn)移至充分曝氣的純凈海水中進(jìn)行恢復(fù)；計(jì)算死亡率。

1.3.2 最佳麻醉?xiàng)l件的研究

本文采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，I（丁香酚質(zhì)量濃度）、II（浸浴時(shí)間）、III（溫度）、IV（體質(zhì)量）分別代表4個(gè)因素（表2），按照不同的水平組合，分為24個(gè)實(shí)驗(yàn)組（表2，表4），每組設(shè)置6尾體重相近的大西洋鮭。實(shí)驗(yàn)中記錄不同麻醉?xiàng)l件下大西洋鮭的最終狀態(tài)，以及轉(zhuǎn)入正常海水中后所需要的恢復(fù)時(shí)間。

表2 丁香酚麻醉大西洋鮭試驗(yàn)因素Table 2 Factors in eugenol anesthesia experiments on Salmo salar

2 結(jié)果與分析

2.1 浸浴10min麻醉濃度和半致死濃度（LC50）

2.1.1 麻醉濃度

實(shí)驗(yàn)表明（圖1），不同規(guī)格的大西洋鮭對(duì)丁香酚的耐受能力有所不同，均重99g的大西洋鮭80%以上達(dá)到完全失去平衡狀態(tài)的丁香酚質(zhì)量濃度為11mg／L，均重159g的大西洋鮭80%以上達(dá)到完全失去平衡狀態(tài)的丁香酚質(zhì)量濃度為10mg／L，均重375g的大西洋鮭80%以上達(dá)到完全失去平衡狀態(tài)的丁香酚質(zhì)量濃度及以上為9mg／L。由圖1可知，低于400g的大西洋鮭對(duì)相同質(zhì)量濃度的丁香酚耐受能力隨體重呈現(xiàn)出遞減的趨勢(shì)，而體重高于400g的大西洋鮭對(duì)丁香酚的耐受能力趨于穩(wěn)定。

圖1 浸浴10min下大西洋鮭的麻醉率Fig.1 Anaesthesia rate of atlanitc salmon under 10min bath

2.1.2 半致死濃度（LC50）

實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，無(wú)論是分級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)還是長(zhǎng)途運(yùn)輸，一般采用的方法為常溫麻醉，且要求把浸浴時(shí)間控制在可以接受的時(shí)間范圍內(nèi)，10min左右或者更少為宜。因此本研究首先測(cè)定了大西洋鮭在14～15℃下10 min浸浴的半致死濃度，大西洋鮭的死亡率和最短恢復(fù)時(shí)間隨丁香酚質(zhì)量濃度的提高有明顯的上升（表3）。由表3可知，對(duì)于均重為549g的大西洋鮭，在丁香酚質(zhì)量濃度50mg／L條件下浸浴10min，其死亡率為0，最短恢復(fù)時(shí)間為11min 40s；在55mg／L條件下浸浴10min，其死亡率為20%，最短恢復(fù)時(shí)間為13min 10 s；在60mg／L條件下浸浴10min，其死亡率為60%，最短恢復(fù)時(shí)間為15min 30s；在66mg／L條件下浸浴10min，其死亡率為90%，最短恢復(fù)時(shí)間為17min 57s。根據(jù)孫氏改進(jìn)寇氏法，計(jì)算得到LC50的95%置信區(qū)間為（56.5，61.6）mg／L。

表3 10min浸浴下死亡率及最短恢復(fù)時(shí)間Table 3 Mortality rate and shortest recovery time under 10min bath

2.2 最佳麻醉?xiàng)l件

大西洋鮭生性活潑好動(dòng)，在進(jìn)行分選和運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中往往需要通過(guò)麻醉來(lái)避免其劇烈運(yùn)動(dòng)引起的傷害，以提高生產(chǎn)活動(dòng)的經(jīng)濟(jì)效益。而不同的麻醉?xiàng)l件下，大西洋鮭所達(dá)到的麻醉狀態(tài)和恢復(fù)到正常狀態(tài)所需要的時(shí)間各不相同，過(guò)度麻醉甚至?xí)霈F(xiàn)魚類死亡的現(xiàn)象。生產(chǎn)實(shí)踐中需要大西洋鮭保持在適當(dāng)?shù)穆樽頎顟B(tài)（表1中4或5）10～20min以完成分選、轉(zhuǎn)運(yùn)、手術(shù)等操作過(guò)程。本研究通過(guò)一組多因素多水平的正交試驗(yàn)確定了達(dá)到這一目標(biāo)的麻醉?xiàng)l件。

表4中記錄了終狀態(tài)、最短恢復(fù)時(shí)間、平均恢復(fù)時(shí)間、最長(zhǎng)恢復(fù)時(shí)間四個(gè)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，因90%處理中實(shí)驗(yàn)魚都達(dá)到了理想的大于4的終狀態(tài)并且未發(fā)生死亡，所以只選取最具代表性的平均恢復(fù)時(shí)間進(jìn)行分析。極差分析結(jié)果見(jiàn)表4。比較本實(shí)驗(yàn)的I，II，III，IV四個(gè)因素中Rj值大小，I因素（即丁香酚質(zhì)量濃度）為最重要的因素，然后依次為II因素（即浸浴時(shí)間），III因素（即溫度），而IV因素（即魚體重量）對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)值的影響并不顯著。方差分析的結(jié)果見(jiàn)表5，由方差分析可知I，II因素對(duì)大西洋鮭麻醉后恢復(fù)正常游動(dòng)的時(shí)間有極顯著的影響。

I因素多重比較分析結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可見(jiàn)，在α＝0.05水平下，I5與I6，I3與I4均數(shù)間差異不顯著，其余均數(shù)間差異顯著。以I5為最好，I6雖與I5間均數(shù)差異不顯著，但是I6的因素水平已經(jīng)超過(guò)了大西洋鮭的致死濃度，所以，從恢復(fù)時(shí)間和安全兩方面來(lái)講，I的最優(yōu)水平為I5，即丁香酚質(zhì)量濃度為50mg／L。II因素多重比較分析結(jié)果見(jiàn)表7。由表7多重比較的結(jié)果來(lái)看，在α＝0.05水平下，II4與II3，II3與II2均數(shù)間差異不顯著，其余均數(shù)間差異顯著。理論上講可取II2水平之上任意水平，實(shí)踐中可以從成本經(jīng)濟(jì)性、實(shí)驗(yàn)條件的可行性、操作安全性等方面綜合考慮來(lái)確定。生產(chǎn)實(shí)際中或可取較短浸浴時(shí)間，以較高的丁香酚質(zhì)量濃度來(lái)彌補(bǔ)時(shí)間這一因素造成的持續(xù)麻醉狀態(tài)時(shí)間的損失。

最后綜合平衡結(jié)果，最優(yōu)組合為I5II4III2，即最佳麻醉?xiàng)l件為丁香酚質(zhì)量濃度50mg／L，浸浴時(shí)間12 min，溫度14℃。

表4 實(shí)驗(yàn)條件、結(jié)果及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的極差分析Table 4 Experimental conditions，results and range analysis

續(xù)表

表5 實(shí)驗(yàn)因素方差分析Table 5 Variance analysis of experimental factors

表6 I因素（丁香酚質(zhì)量濃度）各水平平均值多重比較Table 6 Multiple comparison for factor I（mass concentration of eugenol）

表7 II因素（浸浴時(shí)間）各水平平均值多重比較Table 7 Multiple comparison for factor II（bath time）

3 討論

3.1 魚體規(guī)格對(duì)麻醉效果的影響

巴西學(xué)者使用體長(zhǎng)為6，10，14，18cm不等的尼羅羅非魚（Oreochromisniloticus）進(jìn)行苯唑卡因麻醉試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)體長(zhǎng)方面的差異對(duì)進(jìn)入麻醉所需的浸浴時(shí)間和恢復(fù)時(shí)間的影響并不顯著［16］。使用丁香酚作為麻醉劑時(shí)，較大規(guī)格的白魚（Coregonuslavaretus）相對(duì)于較小規(guī)格的個(gè)體，誘導(dǎo)至麻醉狀態(tài)所需要的浸浴時(shí)間更短，虹鱒卻恰恰相反；而不同規(guī)格的褐鱒魚（Salmotrutta）和大西洋鮭（Salmosalar）浸浴時(shí)間和麻醉后恢復(fù)時(shí)間上并沒(méi)有差異［17］。更早的報(bào)道也認(rèn)為魚體規(guī)格對(duì)于誘導(dǎo)至麻醉所需要的浸浴時(shí)間及恢復(fù)時(shí)間并沒(méi)有明確的單向性影響［18－21］。在確定最優(yōu)化麻醉?xiàng)l件的實(shí)驗(yàn)中，極差分析的結(jié)果顯示，IV因素（即魚體重量）對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)值的影響并不顯著，這與上述的引證相一致。在探究不同規(guī)格的大西洋鮭10min浸浴下進(jìn)入麻醉所需要的最低質(zhì)量濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)對(duì)于體重在400g以下的大西洋鮭，規(guī)格更小的個(gè)體對(duì)丁香酚的耐受力較強(qiáng)。Houston等［22］假設(shè)使魚類達(dá)到麻醉狀態(tài)需要一個(gè)麻醉劑“絕對(duì)”攝入量，“絕對(duì)”攝入量?jī)H在不同的魚種之間存在差異。而麻醉劑的攝入主要通過(guò)鰓部的水交換完成，規(guī)格較大的魚體具有更快的水交換速度，因此更易積累至“絕對(duì)”攝入量，對(duì)麻醉劑的耐受性較差。而對(duì)于體重高于400g的大西洋鮭，魚體規(guī)格對(duì)麻醉效果造成的影響并不顯著。

3.2 浸浴時(shí)間、麻醉劑濃度和溫度對(duì)麻醉效果的影響

提高麻醉劑濃度和延長(zhǎng)浸浴時(shí)間，能夠延長(zhǎng)受試魚的恢復(fù)時(shí)間已是許多學(xué)者［16，23－25］的共識(shí)。表4和圖2表明，隨著丁香酚質(zhì)量濃度的提高和浸浴時(shí)間的延長(zhǎng)，大西洋鮭恢復(fù)至正常游動(dòng)狀態(tài)的時(shí)間明顯延長(zhǎng)。在40mg／L下，14號(hào)I4II2III2IV1，即丁香酚質(zhì)量濃度40mg／L、浸浴時(shí)間6min、溫度14℃、均重500g，以及15號(hào)I4II3III1IV1，即丁香酚質(zhì)量濃度40mg／L、浸浴時(shí)間9min、溫度8℃、均重500g兩個(gè)處理的平均恢復(fù)時(shí)間分別為7min 54s和7min 18s，與延長(zhǎng)浸浴時(shí)間能夠?qū)е禄謴?fù)時(shí)間延長(zhǎng)的趨勢(shì)相悖，是由于丁香酚質(zhì)量濃度和浸浴時(shí)間與溫度的互作效應(yīng)導(dǎo)致了麻醉時(shí)間的顯著下降。在實(shí)驗(yàn)中觀測(cè)到較低溫度下，大西洋鮭鰓動(dòng)頻率下降的現(xiàn)象；另外，Cooke等［26］的研究表明大嘴鱸（Largemouth bass）、白鱸（Whitebass）和黑斑太陽(yáng)魚（Black crappie）三種魚類在3℃下的心臟指數(shù)（心輸出量、心率、每搏輸出量）均低于其在常溫下的水平。推測(cè)在較長(zhǎng)的浸浴時(shí)間（9～12min）下，低溫的刺激降低了大西洋鮭的反應(yīng)能力、鰓動(dòng)頻率及心輸出量，進(jìn)而降低了實(shí)驗(yàn)魚血液與外界環(huán)境的物質(zhì)交換速率，即相比常溫處理下的實(shí)驗(yàn)用魚，低溫環(huán)境降低了血液中的有效丁香酚質(zhì)量濃度，從而使15號(hào)處理實(shí)驗(yàn)魚呈現(xiàn)出較短的恢復(fù)時(shí)間。

圖2 恢復(fù)時(shí)間隨丁香酚質(zhì)量濃度和浸浴時(shí)間的變化Fig.2 Recovery time under different eugenol concentration and bath time

在50mg／L下，17號(hào)I5II1III1IV1，即丁香酚質(zhì)量濃度50mg／L、浸浴時(shí)間3min、溫度8℃、均重500g，以及18號(hào)I5II2III1IV2，即丁香酚質(zhì)量濃度50mg／L、浸浴時(shí)間6min、溫度8℃、均重1 000g兩個(gè)低溫處理的平均恢復(fù)時(shí)間分別為4min 52s和8min 02s，符合浸浴時(shí)間與恢復(fù)時(shí)間之間的正相關(guān)關(guān)系。說(shuō)明在較短的浸浴時(shí)間（3～6min）內(nèi)，魚體并未適應(yīng)低溫環(huán)境，因此鰓動(dòng)頻率和心率也沒(méi)有顯著降低，實(shí)驗(yàn)魚血液與外界環(huán)境的物質(zhì)交換速率也未受到影響，相比常溫處理下的實(shí)驗(yàn)魚，低溫環(huán)境并未影響實(shí)驗(yàn)血液中的有效丁香酚質(zhì)量濃度，從而18號(hào)處理實(shí)驗(yàn)魚恢復(fù)正常游動(dòng)的時(shí)間也未受到明顯影響。

由于時(shí)間和資源的限制，本實(shí)驗(yàn)選取的溫度梯度過(guò)少，為了更好地闡明水體溫度對(duì)不同麻醉劑麻醉效果的影響以及各因素之間的互作效應(yīng)，還需要在將來(lái)補(bǔ)充更加完善的實(shí)驗(yàn)。

致謝：宋秀賢研究員對(duì)文章撰寫和修改等方面給出寶貴建議，山東東方海洋有限公司提供實(shí)驗(yàn)條件和材料。

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