時(shí)差成像技術(shù)在常規(guī)體外受精周期中單原核胚胎的原核形成和卵裂模式及對(duì)其發(fā)育潛能的應(yīng)用

招 霞 王珊珊 蔣益群 張寧媛 孫海翔

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，江蘇南京 210008

時(shí)差成像技術(shù)在常規(guī)體外受精周期中單原核胚胎的原核形成和卵裂模式及對(duì)其發(fā)育潛能的應(yīng)用

招 霞 王珊珊 蔣益群 張寧媛 孫海翔▲

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，江蘇南京 210008

目的 通過時(shí)差成像系統(tǒng)（TLI）觀察常規(guī)體外受精-胚胎移植（IVF-ET）周期中單原核胚胎的發(fā)育特征，探討原核形成方式、卵裂模式與囊胚形成的關(guān)系，評(píng)估單原核胚胎的發(fā)育潛能。 方法選取2013年10月～2015年3月在南京鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行常規(guī)體外受精（IVF）周期患者的單原核胚胎的175個(gè)周期胚胎行TLI動(dòng)態(tài)觀察，對(duì)其中228個(gè)單原核胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，回顧性分析胚胎的原核形成方式、卵裂模式和囊胚形成結(jié)局。 結(jié)果原核形成方式上，10.09%（23/228）的胚胎的單原核為2個(gè)原核融合而成，其他胚胎始終只觀察到1個(gè)原核。卵裂模式上，21.93%（50/228）胚胎卵裂模式正常，異常的卵裂模式包括非軸性卵裂、不均卵裂、非二倍性卵裂、卵裂球碎裂、發(fā)育停滯及未卵裂，其中非二倍性卵裂和卵裂球碎裂較為多見，17.11%（39/228）單原核胚胎有可移植囊胚評(píng)分＞ⅣCC，7.46%（17/228）的胚胎形成的囊胚評(píng)分≥ⅣBB。原核形成方式上，2個(gè)原核融合為1個(gè)原核的單原核胚胎的可移植囊胚形成率顯著高于始終為1個(gè)原核者；卵裂模式上，可移植囊胚均來源于卵裂模式正常及僅發(fā)生非軸性卵裂的胚胎，其可移植囊胚形成率分別為66.00%和46.15%，而其他卵裂模式異常的胚胎無可移植囊胚形成。結(jié)論常規(guī)IVF周期的單原核胚胎具有一定的發(fā)育潛能，單原核胚胎的發(fā)育潛能與其原核形成方式和卵裂模式密切相關(guān)，2個(gè)原核融合為1個(gè)原核的單原核胚胎和卵裂模式正常者及僅發(fā)生非軸性卵裂者具有較高的可移植囊胚形成率。當(dāng)患者無可移植的雙原核胚胎時(shí)，可將2個(gè)原核融合為1個(gè)原核的單原核胚胎納入選擇范圍，卵裂模式亦有助于篩選具有發(fā)育潛能的單原核胚胎，對(duì)正常及僅發(fā)生非軸性卵裂的單原核胚胎進(jìn)行移植或冷凍，以提高卵子利用率。

單原核胚胎；時(shí)差成像；原核形成；卵裂模式；體外受精；胚胎發(fā)育

在體外受精-胚胎移植 （in-vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）周期中,觀察常規(guī)體外受精（IVF）或卵子胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）后的卵子在受精后16～18 h的狀態(tài)，具有兩個(gè)原核為正常受精，而多個(gè)原核和單原核被認(rèn)為是異常受精。異常受精的胚胎由于染色體可能存在異常而容易導(dǎo)致胚胎著床失敗和自然流產(chǎn)，一般不用于移植，降低胚胎利用率。IVF和ICSI后單原核胚胎的發(fā)生率為3%～6%[1]，單原核胚胎是否具有發(fā)育潛能，能否用于移植或冷凍尚無定論。研究顯示[2-4]，常規(guī)IVF周期中48.7%～61.9%的單原核胚胎為二倍體，提示常規(guī)IVF周期中單原核胚胎具有一定的可利用價(jià)值。

近來研究發(fā)現(xiàn)，胚胎發(fā)育的動(dòng)態(tài)參數(shù)與胚胎活力和染色體是否正常有關(guān)，可用來評(píng)估胚胎質(zhì)量，預(yù)測(cè)其發(fā)育潛能。而某些動(dòng)態(tài)參數(shù)在傳統(tǒng)觀察方式下無法記錄，近年興起的時(shí)差成像系統(tǒng)（time-lapse imaging，TLI）將攝像裝置與培養(yǎng)箱結(jié)合，在培養(yǎng)箱內(nèi)每間隔一定時(shí)間對(duì)胚胎進(jìn)行自動(dòng)攝像，形成胚胎發(fā)育全過程的動(dòng)態(tài)影像。TLI克服了傳統(tǒng)胚胎觀察的弊端，在保證胚胎培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定的同時(shí)，對(duì)胚胎發(fā)育進(jìn)行更加全面和細(xì)致的記錄。一些與胚胎發(fā)育潛能密切相關(guān)的生物學(xué)特征，如原核的形成及消失、卵裂時(shí)間及同步性等已經(jīng)幫助胚胎學(xué)家更為有效地評(píng)價(jià)胚胎質(zhì)量。Meseguer等[5]大樣本回顧性研究證明，應(yīng)用TLI觀察的動(dòng)態(tài)參數(shù)挑選胚胎與傳統(tǒng)方法相比臨床妊娠率可提高約20%。目前對(duì)TLI技術(shù)應(yīng)用于胚胎評(píng)估的研究主要集中于時(shí)間參數(shù)[6-7]。Athayde等[8]研究表明，TLI可以識(shí)別形態(tài)學(xué)正常而卵裂模式異常的胚胎，如1個(gè)卵裂球直接分裂為3個(gè)卵裂球的異常卵裂，而非整倍體或基因異常是誘發(fā)胚胎異常卵裂的主要原因，如將此類胚胎進(jìn)行移植，可導(dǎo)致流產(chǎn)率升高，提示卵裂模式對(duì)胚胎發(fā)育結(jié)局具有重要影響。

本研究將常規(guī)IVF周期患者的胚胎通過TLI系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)和觀察，對(duì)其中單原核胚胎培養(yǎng)至囊胚期，回顧性分析其卵裂模式和囊胚形成情況的關(guān)系，以此評(píng)估卵裂期單原核胚胎的發(fā)育潛能，指導(dǎo)臨床患者單原核胚胎的利用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究于2013年10月～2015年3月在南京鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（以下簡(jiǎn)稱“我院”）進(jìn)行，對(duì)有單原核胚胎的175個(gè)周期資料進(jìn)行回顧性分析?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：①常規(guī)IVF周期；②女方年齡≤40歲；③周期數(shù)≤2；④月經(jīng)第3天促卵泡激素（FSH）≤12 U/mL；⑤常規(guī)長(zhǎng)方案促排卵[9]；⑥獲卵數(shù)為5～15?；颊吲懦龢?biāo)準(zhǔn)：①完全或部分受精失??；②卵子異常。采用短時(shí)受精，去除顆粒細(xì)胞后置于TLI中，培養(yǎng)至囊胚期。將受精后16～18 h原核數(shù)目為1個(gè)的單原核胚胎作為研究對(duì)象，記錄其原核形成方式、卵裂模式及囊胚形成情況。本研究通過我院倫理委員會(huì) （No.2013068）審批，所有患者夫妻雙方簽署知情同意書。

1.2 TLI系統(tǒng)

本研究采用Primo Vision TLI（Vitrolife，Sweden）時(shí)差成像系統(tǒng)[10]，此系統(tǒng)在傳統(tǒng)培養(yǎng)箱內(nèi)配置倒置胚胎顯微鏡，通過數(shù)據(jù)線與培養(yǎng)箱外的控制臺(tái)主機(jī)相連接，胚胎置于專用9孔集合培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每孔放置1個(gè)胚胎，具有明確的位置標(biāo)記，拍照頻率為5 min/次，直至胚胎發(fā)育至第6天。

1.3 IVF與胚胎培養(yǎng)

卵子取出后置于IVF(Vitrolife，瑞典)培養(yǎng)微滴中，37℃、6%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。獲卵3 h后加精，加精比例為10 000條精子/卵子。采用短時(shí)受精方法，精卵共孵育6 h后機(jī)械剝離顆粒細(xì)胞，置于倒置顯微鏡下觀察第二極體是否形成，以判斷卵子是否受精。受精卵子數(shù)目超過總卵數(shù)60%的患者被認(rèn)為受精成功。患者胚胎在判斷受精成功后即轉(zhuǎn)入含有G1（Vitrolife，瑞典）培養(yǎng)液的WOW培養(yǎng)皿中，置于TLI系統(tǒng)中進(jìn)行胚胎培養(yǎng)和觀察。第3天胚胎移植后，其余胚胎按照相同位置轉(zhuǎn)入含有G2（Vitrolife，Sweden）的WOW皿中進(jìn)行囊胚培養(yǎng)至第6天。

1.4 囊胚分級(jí)

對(duì)形成囊胚者根據(jù)ALPHA/ESHRE指南對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行分級(jí)[11]。根據(jù)囊胚的擴(kuò)張和孵出程度將其分為Ⅰ～Ⅵ級(jí)，根據(jù)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass，ICM）和滋養(yǎng)層（trophectoderm，TE）的質(zhì)量分為A～C級(jí)。本研究中在第5天或6天將囊胚分級(jí)＞ⅣCC者定義為可移植囊胚，≥ⅣBB者定義為優(yōu)質(zhì)囊胚。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胚胎觀察及其卵裂模式的定義

通過TLI動(dòng)態(tài)觀察單原核胚胎發(fā)育，記錄胚胎的卵裂模式。胚胎的卵裂模式包括正常卵裂和異常卵裂，其中異常卵裂模式包括不均、非軸性卵裂、非二倍性卵裂、發(fā)育停滯及卵裂球碎裂。見表1。

2.2 患者一般資料與胚胎發(fā)育情況

在175個(gè)周期中觀察到單原核胚胎共228個(gè)?；颊吣挲g為（31.75±3.21）歲，體重指數(shù)為（22.54±3.02）kg/m2，基礎(chǔ)FSH為（6.89±1.84）mU/mL，平均獲卵數(shù)為（10.96± 3.17）個(gè)，正常受精率為72.71%，正常卵裂率為98.55%，可移植囊胚形成率為17.11%，優(yōu)質(zhì)囊胚形成率為7.46%。

表1 胚胎主要的異常卵裂模式定義及圖示

2.3 單原核胚胎原核形成方式與囊胚形成

少部分單原核胚胎的1個(gè)原核為2個(gè)原核融合而成，大部分胚胎始終只觀察到1個(gè)原核。單原核直徑在22～32 μm，平均（27.13±2.54）μm。在原核后期原核直徑增大，之后消失。原核由2個(gè)原核融合而成的單原核胚胎與始終只有1個(gè)原核的胚胎相比，具有較高的可移植囊胚形成率及優(yōu)質(zhì)囊胚形成率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

1個(gè)單原核胚胎的原核由2個(gè)原核融合而成，胚胎在原核形成初期為2個(gè)原核，之后兩個(gè)原核相互靠近融合，在受精16～18 h觀察時(shí)，表現(xiàn)為1個(gè)原核。此胚胎分裂模式和發(fā)育速度同雙原核胚胎，即從受精卵分裂為2個(gè)細(xì)胞，在第2天發(fā)育為4個(gè)細(xì)胞，在第3天發(fā)育為8個(gè)細(xì)胞，在第5天發(fā)育為囊胚。見圖1。

表2 單原核胚胎原核形成方式與囊胚形成[n=228，n（%）]

2.4 單原核胚胎卵裂模式與囊胚形成

圖1 單原核胚胎的發(fā)育

單原核胚胎中，少部分胚胎卵裂模式正常，大部分胚胎卵裂模式出現(xiàn)異常，其中非二倍性卵裂和卵裂球碎裂較為多見，其次為發(fā)育停滯和未卵裂，再次為非軸性卵裂和不均卵裂。可移植囊胚僅來源于卵裂模式正常及發(fā)生非軸性卵裂的胚胎。卵裂模式正常的胚胎可移植囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚形成率最高，其次為僅發(fā)生非軸性卵裂的胚胎。而不均、非二倍性卵裂、發(fā)育停滯及卵裂球碎裂這些卵裂模式異常的胚胎無可移植囊胚形成。見表3。

表3 胚胎卵裂模式與囊胚形成[n=228，n（%）]

3 討論

受精是精卵相互協(xié)調(diào)發(fā)育的復(fù)雜過程，是輔助生殖技術(shù)中的首要環(huán)節(jié)。卵子取出后停滯于第2次減數(shù)分裂的中期，待精子進(jìn)入后繼續(xù)減數(shù)分裂，排出含有染色質(zhì)的第二極體，繼而出現(xiàn)分別來自母方和父方的兩個(gè)原核，這是正常受精的標(biāo)志。原核的形成可發(fā)生在受精后3～20 h，大部分正常受精的合子在受精后16～18 h表現(xiàn)為兩個(gè)原核。這個(gè)結(jié)論是基于卵子是成熟的，在受精時(shí)已完成第1次減數(shù)分裂。然而，有些卵子可能是正常受精，但是由于成熟過程延遲而表現(xiàn)為無原核或單原核[12]。單原核來源的胚胎能否用于移植一直為胚胎學(xué)家所困擾，目前單原核胚胎通常不作為移植胚胎的首選。

在早期IVF工作中，單原核合子被認(rèn)為是由化學(xué)、機(jī)械刺激引起的孤雌生殖，而非精子進(jìn)入的受精，卵胞漿內(nèi)精子注射（ICSI）術(shù)后的單原核多是這一來源，機(jī)械刺激激活了卵母細(xì)胞。然而，隨著基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，在單原核合子中檢測(cè)到Y(jié)染色體的存在，證實(shí)單原核的胚胎有受精的發(fā)生，這在常規(guī)IVF周期中較為常見。Porter等[13]應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)對(duì)常規(guī)IVF來源的單原核胚胎進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示54.35%胚胎為二倍體，且50%有Y染色體，這個(gè)結(jié)果遠(yuǎn)高于ICSI來源的單原核胚胎 （10%～34.62%）。Staessen等[3]與Sultan等[4]得到了與Porter等[13]相似的結(jié)果，IVF中單原核胚胎的二倍體比例為48.7%～61.9%。除了孤雌生殖，目前認(rèn)為單原核的形成機(jī)制包括：雌雄原核發(fā)育的非同步性，導(dǎo)致兩個(gè)原核形成或消失不一致，當(dāng)在某一時(shí)間點(diǎn)觀察時(shí)，僅見單個(gè)原核存在、雌雄原核形成障礙及雌雄原核的異常融合[14]。后者包括雌雄原核形成一個(gè)共用的核膜或者在原核形成之初為兩個(gè)原核，之后融合成大的單個(gè)原核。有些單原核合子由于核膜結(jié)構(gòu)異常，始終沒有第二原核出現(xiàn)。囊胚培養(yǎng)是對(duì)胚胎染色體狀態(tài)進(jìn)行自然篩選的有效方法[15]，對(duì)于人類胚胎，胚胎基因組決定胚胎形成8個(gè)細(xì)胞之后的發(fā)育。如果胚胎染色體正常，胚胎基因組正常激活，則胚胎在8個(gè)細(xì)胞之后順利發(fā)育到囊胚階段的可能性較高。因此，囊胚形成與否及其質(zhì)量反映了胚胎的染色體狀態(tài)和發(fā)育潛能。研究表明二倍體的單原核胚胎發(fā)育成囊胚的比例較高,我院生殖醫(yī)學(xué)中心數(shù)據(jù)顯示[16]，女方年齡＜35歲的常規(guī)IVF周期中，單原核胚胎≥ⅣBC囊胚的形成率為11.90%。目前有移植單原核胚胎分娩出健康新生兒的報(bào)道[17-18]，因此認(rèn)為IVF單原核胚胎具有一定的可利用價(jià)值。

在IVF臨床工作中，對(duì)于無雙原核來源的優(yōu)質(zhì)胚胎可用的患者，如果將優(yōu)質(zhì)單原核胚胎加以利用，可避免周期取消，提高卵子利用率。怎樣預(yù)測(cè)單原核胚胎的發(fā)育潛能，在不破壞胚胎的前提下最大限度地排除染色體異常的胚胎是目前亟待解決的問題。目前胚胎的觀察和篩選大多采用傳統(tǒng)的胚胎觀察方式，即在胚胎發(fā)育的數(shù)天中僅在某幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)胚胎進(jìn)行觀察，其中原核的形成、消失、胚胎的卵裂模式等動(dòng)態(tài)信息僅通過片面的靜態(tài)的胚胎形態(tài)觀察無法得知。近年來興起的IFN系統(tǒng)可在穩(wěn)定可控的環(huán)境中對(duì)胚胎發(fā)育進(jìn)行高頻率的觀察和記錄，形成胚胎發(fā)育的連續(xù)影像。應(yīng)用這種先進(jìn)的胚胎觀察模式，我們可捕捉胚胎發(fā)育過程中的動(dòng)態(tài)變化，通過分析胚胎的發(fā)育特征，尋找與囊胚形成具有密切關(guān)系的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，對(duì)于預(yù)測(cè)胚胎的發(fā)育潛能具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究將單原核胚胎培養(yǎng)至囊胚階段，囊胚形成結(jié)果顯示單原核胚胎整體可利用率為17.11%。為進(jìn)一步預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能，筆者應(yīng)用TLI系統(tǒng)對(duì)胚胎的發(fā)育特征進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察和分析，發(fā)現(xiàn)單原核胚胎的囊胚形成與其原核形成方式及卵裂模式密切相關(guān)。原核形成方式上，2個(gè)原核融合為1個(gè)原核的單原核胚胎的可移植囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚形成率顯著高于始終為1個(gè)原核的單原核胚胎，說明2個(gè)原核融合為1個(gè)原核的單原核胚胎擁有雌雄2個(gè)原核的比例較高，從而具有較高的發(fā)育潛能。傳統(tǒng)的原核觀察僅在受精后16～18 h對(duì)原核觀察1次，無法判斷單個(gè)原核是否為2個(gè)原核融合而成，TLI系統(tǒng)的應(yīng)用則有助于觀察原核的形成方式和動(dòng)態(tài)變化，識(shí)別原核的真正個(gè)數(shù)，進(jìn)而預(yù)測(cè)胚胎的囊胚形成情況和發(fā)育潛能。在卵裂模式上，只有卵裂模式正常及僅有非軸性卵裂的胚胎有發(fā)育為可移植囊胚的可能，其可利用比例分別為66.00%和46.15%。卵裂模式異常包括不均、非二倍性卵裂、發(fā)育停滯及卵裂球碎裂的單倍體胚胎無可移植囊胚形成。不均在胚胎發(fā)育中的較為常見，有研究顯示[19-20]，不均胚胎的非整倍體率和卵裂球多核率顯著高于均一胚胎（29.4%比8.5%、21.1%比2.1%）。胚胎非二倍性卵裂可能與染色體異常相關(guān)[21]，Athayde等[22]發(fā)現(xiàn)此類胚胎具有較低的囊胚形成率（11.7%）及種植率（3.7%）。發(fā)育停滯的胚胎亦多為非整倍體胚胎[23]，發(fā)育潛能低下，以上均與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，單原核胚胎具有一定的發(fā)育潛能，原核的形成方式和胚胎的卵裂模式與其發(fā)育潛能相關(guān)。傳統(tǒng)的胚胎觀察方法無法對(duì)以上現(xiàn)象做出觀察，而應(yīng)用TLI系統(tǒng)可通過記錄胚胎的原核形成方式和胚胎的卵裂模式預(yù)測(cè)胚胎的發(fā)育潛能。2個(gè)原核融合為1個(gè)原核的單原核胚胎和卵裂模式正常及僅發(fā)生非軸性卵裂的單原核胚胎具有較高的可移植囊胚形成率。對(duì)于獲卵數(shù)較少或該周期中沒有可移植的雙原核胚胎患者，可通過TLI系統(tǒng)的觀察，將2個(gè)原核融合為1個(gè)原核的單原核胚胎納入選擇范圍。TLI系統(tǒng)觀察到的卵裂模式亦有助于篩選具有發(fā)育潛能的單原核胚胎，選擇卵裂模式正常及僅發(fā)生非軸性卵裂的單原核胚胎進(jìn)行移植和冷凍，以提高卵子利用率。發(fā)育潛能較好的單原核胚胎與雙原核胚胎在染色體和基因上的正常率有無差異，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

[1]Plachot M，Crozet N.Fertilization abnormalities in human in vitrofertilization[J].Hum Reprod，1992，7（suppl 1）：89-94.

[2]Yan J，Li Y，Shi Y，et al.Assessment of sex chromosomes of human embryos arising from monopronucleus zygotes in in-vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles of Chinese women[J].Gynecol Obstet Invest，2010，69（1）：20-23.

[3]Staessen C，Van Steirteghem AC.The chromosomal constitution of embryos developing from abnormally fertilized oocytes after intracytoplasmic sperm injection and conventional in-vitro fertilization[J].Hum Reprod，1997，12（2）：321-327.

[4]Sultan KM，Munné S，Palermo GD，et al.Chromosomal status of uni-pronuclear human zygotes following in-vitro fertilization and intra-cytoplasmic sperm injection[J]. Hum Reprod，1995，10（1）：132-136.

[5]Meseguer M，Rubio I，Cruz M，et al.Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator：aretrospective cohort study[J].Fertil Steril，2012，98（6）：1481-1489.

[6]Dal CM，Coticchio G，Mignini RM，et al.Cleavage kinetics analysis of human embryos predicts development to blastocyst and implantation[J].Reprod Biomed Online，2012，25（5）：474-480.

[7]Hashimoto S，Kato N，Saeki K，et al.Selection of high-potential embryos by culture in poly（dimethylsiloxane）microwells and time-lapse imaging[J].Fertil Steril，2012，97（2）：332-337.

[8]Athayde WK，Chen AA，Conaghan J，et al.Atypical embryo phenotypes identified by time-lapse microscopy：high prevalence and association with embryo[J].Fertil Steril，2014，101（6）：1637-1648.

[9]Ding LJ，Wang B，Shen XY，et al.Withdrawal of GnRH agonist decreases oestradioland VEGF concentrations in high responders[J].Reproductive BioMedicine Online，2013，27（2）：131-139.

[10]Pribenszky C，MátyásS，KovácsP，etal.Pregnancy achieved by transfer of a single blastocyst selected by time-lapse monitoring[J].Reprod Biomed Online，2010，21（4）：533-536.

[11]AlphaScientistsinReproductiveMedicineandESHRESpecial Interest Group of Embryology.The Istanbul consensus workshop on embryo assessment：proceedings of an expert meeting[J].Hum Reprod，2011，26（6）：1270-1283.

[12]Noyes NI，F(xiàn)ino ME，Krey L，et al.Embryo biopsy：the fate of abnormal pronuclear embryos[J].Reprod Biomed Online，2008，17（6）：782-788.

[13]Porter R，Han T，Tucker MJ，et al.Estimation of second polar body retention rate after conventional insemination and intracytoplasmic sperm injection：in vitro observations from more than 5000 human oocytes [J].Assist Reprod Genet，2003，20（9）：371-376.[14]Otsu E，Sato A，Nagaki M，et al.Developmental potential and chromosomal constitution of embryos derived from larger single pronuclei of human zygotes used in in vitro fertilization[J].Fertil Steril，2004，81（3）：723-724.

[15]Blake DA，F(xiàn)arquhar CM.Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer inasisted conception [J].Cochrane Database Syst Rev，2012，7（7）：861-875.

[16]王珊珊，曾惠明，張寧媛，等.不同受精方式對(duì)單原核胚胎發(fā)育潛能的影響[J].中國(guó)性科學(xué)，2014，23（6）：45-48.

[17]Levron J，Munne S，Willadsen S，et al.Male and female genomes associated in a single pronucleus in human zygotes[J].Biol Reprod，1995，52（3）：653-657.

[18]Gras L，Trounson AO.Pregnancy and birth resulting from transfer of a blastocyst observed to have one pronucleus at the time of examination for fertilization [J].Hum Reprod，1999，14（7）：1869-1871.

[19]Hardarson T，Hanson C，Sjogren A，et al.Human embryos with unevenly sized blastomeres have lower pregnancy and implantation rates：indications for aneuploidy and multinucleation[J].Hum Reprod，2001，16（2）：313-318.

[20]Scott L，F(xiàn)inn A，O'Leary T，et al.Morphologic parameters of early cleavage-stage embryos that correlate with fetal development and delivery：prospective and applied data for increased pregnancy rates[J].Hum Reprod，2007，22（1）：230-240.

[21]Somfai T，Inaba Y，Aikawa Y，et al.Relationship between the length of cell cycles，cleavage pattern and developmental competence in bovine embryos generated by in vitro fertilization or parthenogenesis[J].J Reprod Dev，2010，56（2）：200-207.

[22]Athayde WK，Chen AA，Conaghan J，et al.Atypical embryo phenotypes identified by time-lapse microscopy：high prevalence and association with embryo[J].Fertil Steril，2014，101（6）：1637-1648.

[23]Qi ST，Liang LF，Xian YX，et al.Arrested human embryos are more likely to have abnormal chromosomes than developing embryos from women of advanced maternal age[J]. J Ovarian Res，2014，7（2）：180-186.

Study of the pronucleus formation and cleavage pattern of embryos de-rived from mononuclear oocytes after conventional in-vitro fertilization by time-lapse imaging and evaluation of the developmental potential

ZHAO Xia WANG Shanshan JIANG Yiqun ZHANG Ningyuan SUN Haixiang▲
Department of Reproductive Medicine Center,the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School,Jiangsu Province,Nanjing 210008,China

Objective To observe the developmental characteristic of embryos derived from mononuclear oocytes after conventional in-vitro fertilization (IVF)by time-lapse imaging(TLI),investigate the relationship of the pronucleus formation,the cleavage patterns and formation rates of blastocyst,and evaluate the developmental potential of mononuclear oocytes.Methods A retrospective study was performed to analyze the 228 mononuclear oocytes embryos of 175 conventional IVF treatment cycles using TLI from October 2013 to March 2015 in Reproductive Medicine Center of the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School.The pronucleus formation,cleavage patterns and blastocyst formation were analysed.Results There were 10.09%（23/228）embryos whose mononuclear were formed by the fusion of two pronuclei.The other embryos remained mononuclear throughout.21.93%（50/228）embryos had normal cleavage pattern.The abnormal cleavage patterns included non-axial cleavage,uneven cleavage,non-diploid cleavage, fragmented blastomere,developmental arrest and no cleavage,among which non-axial cleavage and fragmented blastomere were more common.17.11%（39/228）embryos derived from mononuclear oocytes formed good-quality(＞ⅣCC),7.46%（17/228）embryos formed blastocyst whichgrade reached or were greater thanⅣBB.The embryos whose mononuclear was formed by the fusion of two pronuclei have higher transferable blastocyst formation rates than the embryos remained mononuclear throughout.All the transferable blastocysts were developed from mononuclear oocytes with normal cleavage or non-axial cleavage,which the transferable blastocyst formation rates were 66.00%and 46.15%individually.Embryos with other abnormal cleavages had no transferable blastocyst formation.Conclusion Part of embryos after conventional IVF derived from mononuclear oocytes have the chance of forming blastocyst,the developmental potential is closely related to their pronucleus formation and cleavage patterns.Embryos whose mononuclear are formed by the fusion of two pronuclei and embryos with normal cleavage or non-axial cleavage have higher transferable blastocyst formation rates.When there are no good embryos derived from two pronucleus oocytes for transfer,the embryos whose mononuclear are formed by the fusion of two pronuclei can be considered.Cleavage pattern helps to distinguish the potentiality of embryo development.The mononuclear oocytes embryos with normal cleavage or non-axial cleavage can be selected for transplantation or cryopreservation to improve the utilization rate of oocytes.

Mononuclear oocytes;Time-lapse imaging;Pronucleus formation;Cleavage pattern;In-vitro fertilization; Embryo development

R329.1

A

1673-7210(2015)11(b)-0074-06

2015-06-25本文編輯：關(guān) 婧）

江蘇省省級(jí)條件建設(shè)與民生科技專項(xiàng)資金項(xiàng)目（BL2014003）。

▲通訊作者