黑龍江煙區(qū)煙草馬鈴薯Y病毒株系的分子鑒定

萬(wàn)秀清,喬 嬋,趙淑娟,李 若,李麗杰,郭振楠

牡丹江煙草科學(xué)研究所,黑龍江省牡丹江市西地明街425號(hào) 157011

黑龍江煙區(qū)煙草馬鈴薯Y病毒株系的分子鑒定

萬(wàn)秀清,喬 嬋*,趙淑娟,李 若,李麗杰,郭振楠

牡丹江煙草科學(xué)研究所,黑龍江省牡丹江市西地明街425號(hào) 157011

為明確黑龍江煙區(qū)煙草馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)株系種類(lèi)及其分布狀況,采用多重PCR技術(shù)及測(cè)序手段,對(duì)采集黑龍江省煙葉產(chǎn)區(qū)的107份疑似PVY樣品進(jìn)行了鑒定分析.結(jié)果表明:4個(gè)有代表性的PVY分離物HLJ-SH8、HLJ-SC2、HLJ-SC6和HLJ-MDJ4的基因組序列全長(zhǎng)分別為9 698、9 702、9 702和9 698 bp,都包含一個(gè)由9 186 bp組成的開(kāi)放讀碼框(ORF),編碼一個(gè)由3 061個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白.系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明這4個(gè)PVY分離物分別為PVYNTN、PVYN、PVYNW和PVYNTN-NW株系,其中PVYNTN-NW株系是侵染黑龍江煙草的優(yōu)勢(shì)株系.

黑龍江煙區(qū);馬鈴薯Y病毒(PVY);株系鑒定;多重PCR;測(cè)序

煙草馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是感染危害黑龍江省煙草的主要病毒之一,其寄主范圍廣,能侵染豆科、菊科等34屬163種植物,馬鈴薯、辣椒、番茄和煙草等茄科作物是主要對(duì)象[1-4].目前在全國(guó)16個(gè)煙草種植省(區(qū))均有PVY發(fā)生.隨著煙草馬鈴薯Y病毒病的日趨嚴(yán)重,對(duì)馬鈴薯Y病毒病的發(fā)生規(guī)律及綜合防治技術(shù)也進(jìn)行了相關(guān)的研究,在國(guó)內(nèi)多個(gè)煙草種植省(區(qū))已有報(bào)道[5-11].而植物病毒存在不同株系,在相同的寄主植物上可引起不同的癥狀,通常依據(jù)病毒的生物學(xué)特性、寄主范圍、血清學(xué)和核酸特異性等來(lái)劃分株系.近年來(lái),在歐洲、美洲等地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一系列具有高致病性的PVY新株系,主要包括PVYNTN、PVYNW、PVYN∶O和 PVYNA-NIN株系等[12].目前,中國(guó)農(nóng)科院煙草研究所鑒定出山東煙區(qū)主要有PVYO和PVYN兩個(gè)株系[13];吳元華等[14]鑒定出東北煙區(qū)主要有 PVYO、PVYVN、PVYC和 PVYNS4 個(gè)株系;國(guó)內(nèi)已被廣泛認(rèn)同的PVY株系種類(lèi)有PVYO、PVYN和PVYC3種[15];黑龍江煙區(qū)煙草尚未見(jiàn)有關(guān)PVY株系鑒定的系統(tǒng)報(bào)道.在國(guó)內(nèi)已有的馬鈴薯Y病毒的株系鑒定中多以P1和CP基因序列為主,但利用基因組序列全長(zhǎng)進(jìn)行株系劃分的報(bào)道并不多見(jiàn).雖然P1基因是整個(gè)基因組的易變異基因,CP基因的變異也對(duì)株系劃分有一定的意義,但馬鈴薯Y病毒的基因變異是由多個(gè)基因共同作用引起的,僅依據(jù)P1基因與CP基因?qū)VY進(jìn)行株系鑒定存在一定的局限性.為此,采用分子生物學(xué)手段及測(cè)序技術(shù),對(duì)采集的黑龍江煙區(qū)煙草PVY樣品進(jìn)行分類(lèi)、測(cè)序及分析,旨在合理進(jìn)行株系劃分,并進(jìn)一步設(shè)計(jì)不同株系特異PCR鑒定引物,對(duì)感染黑龍江煙草的PVY株系種類(lèi)、發(fā)生發(fā)展情況及其區(qū)域分布進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)控,為煙葉生產(chǎn)中PVY病毒的有效防治提供技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

植物病毒總RNA提取試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司);Ex-taq酶,RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司);DNA純化回收試劑盒E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit(美國(guó) OMEGA公司);低熔點(diǎn)瓊脂糖(美國(guó)Sigma公司);PVY免疫試紙條(美國(guó)Agida公司);其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PVY病毒樣品的采集

于2010年和2011年,在黑龍江煙區(qū)的綏化、肇州、雙城、賓縣及牡丹江采集各種煙草PVY疑似癥狀的樣品共計(jì)107份,其中牡丹江16份,綏化19份,賓縣24份,雙城16份,肇州32份.采集樣品時(shí)手戴一次性PE手套,避免不同樣品間相互污染.對(duì)采集的樣品進(jìn)行照相并標(biāo)注,注明樣品采集時(shí)間、樣品編號(hào)、采集地點(diǎn)和典型癥狀等.

1.2.2 PVY病毒樣品免疫試紙檢測(cè)

每個(gè)樣品使用一個(gè)研磨袋,并進(jìn)行標(biāo)記.首先用剪刀剪開(kāi)研磨袋的頂端,注意不要濺出緩沖液.用酒精擦拭消毒后的剪刀剪下有PVY典型癥狀的煙草葉片并稱(chēng)取約0.15 g,放入含有3 mL SEB緩沖液的研磨袋中.植物樣本與緩沖液比例為1∶20(g∶mL);把葉片置于研磨袋的研磨線之間,用筆或其他鈍物擠壓煙草葉片,使之完全破碎,再將樣品混合均勻;將標(biāo)有quot;samplequot;一頭的試紙條的端部浸入到煙草PVY提取緩沖液中,檢測(cè)過(guò)程中試紙條端部不能離開(kāi)提取液.(試紙條不使用時(shí)需儲(chǔ)存在4℃冰箱里,使用時(shí)需將其恢復(fù)到室溫).最長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間為30 min.當(dāng)檢測(cè)線和控制線均顯示為紅色時(shí),表明為PVY陽(yáng)性;只有控制線出現(xiàn)而檢測(cè)線未出現(xiàn)時(shí)為PVY陰性;如果控制線不顯示紅色,表明試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效或是試紙條失效.經(jīng)PVY免疫試紙條檢測(cè)呈陽(yáng)性結(jié)果的煙草樣品置于-60℃低溫冰箱中保存,備用.

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定

1.2.3.1 煙草總RNA的提取及cDNA合成

用RNeasy Plant Mini(50)提取試劑盒提取檢測(cè)結(jié)果為PVY陽(yáng)性的病毒樣品的總RNA.以O(shè)ligo dT-Adaptor Primer為引物,利用 RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,具體方法參照相關(guān)試劑盒使用說(shuō)明書(shū).

1.2.3.2 PVY株系多重RT-PCR檢測(cè)

以合成的cDNA為模板,以健康未染病的煙草葉片為陰性對(duì)照,多重PCR擴(kuò)增引物參照Ali M C[16]設(shè)計(jì)合成,見(jiàn)表1.多重RT-PCR反應(yīng)體系:總體積為25 μL,其中 2.5 μL 的 10XExTaq buffer,0.12 μL的TaKaRa Ex Taq酶,19.38 μL無(wú)菌水,2 μL引物混合物,1 μL cDNA模板.降落式PCR擴(kuò)增循環(huán)程序:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,64℃復(fù)性30 s,72℃延伸90 s,10次循環(huán);94℃變性30 s,62℃復(fù)性30 s,72℃延伸90 s,10次循環(huán);94℃變性30 s,60℃復(fù)性30 s,72℃延伸90 s,10次循環(huán);最后72℃延伸5 min.取3 μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

1.2.3.3 PVY基因組序列全長(zhǎng)擴(kuò)增及分析

通過(guò)PVY株系多重RT-PCR檢測(cè),根據(jù)各樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果,對(duì)樣品進(jìn)行初步分類(lèi),選取有代表性的4個(gè)PVY株系樣品進(jìn)行PVY全序列測(cè)定.根據(jù)PVY各株系比對(duì)結(jié)果,在保守區(qū)域設(shè)計(jì)合成3對(duì)PCR擴(kuò)增引物,3對(duì)引物擴(kuò)增片段全覆蓋PVY基因組,序列見(jiàn)表2.PCR反應(yīng)體系:5XPCR buffer 5 μL,無(wú)菌水 16.5 μL,Ex-taq 酶 0.125 μL,引物各0.25 μL,cDNA 3 μL,總體積為25 μL;PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性40 s,50.7℃復(fù)性40 s,72℃延伸2 min,72℃延伸7 min,35個(gè)循環(huán).PCR反應(yīng)完成后進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收目標(biāo)條帶,然后直接對(duì)回收純化的特異PCR擴(kuò)增條帶進(jìn)行測(cè)序.測(cè)序后對(duì)3對(duì)PCR擴(kuò)增的序列進(jìn)行拼接.

表1 多重RT-PCR檢測(cè)引物

表2 PVY全長(zhǎng)擴(kuò)增引物

1.2.3.4 PVY序列分析

在GenBank中下載已經(jīng)登錄的PVY全基因序列用于PVY病毒序列同源性分析及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù).序列比對(duì)采用MEGA5.0軟件中的ClustaW,選擇MEGA5.05軟件并采用鄰接法(Neighbor-joining,NJ)對(duì)本實(shí)驗(yàn)所得到的4個(gè)PVY基因組全長(zhǎng)序列和GenBank上登錄的PVY全長(zhǎng)序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù).本實(shí)驗(yàn)中分離的4個(gè)PVY基因組全長(zhǎng)間的核苷酸序列與氨基酸序列的一致率用Align plus 4軟件進(jìn)行比對(duì).

1.2.4 黑龍江省煙草PVY株系區(qū)域分布

根據(jù)多重RT-PCR檢測(cè)結(jié)果,統(tǒng)計(jì)分析2010年和2011年采集的煙草PVY各株系在黑龍江煙草種植區(qū)的分布情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯Y病毒樣品癥狀及免疫試紙檢測(cè)分析

采集的107份煙草病毒樣品典型癥狀如圖1,主要表現(xiàn)癥狀為葉脈壞死、褪綠斑駁、點(diǎn)刻褪綠條帶及明脈等.免疫試紙檢測(cè)結(jié)果表明:PVY陽(yáng)性結(jié)果(檢測(cè)線出現(xiàn)清晰紅色條帶)為97個(gè),陰性結(jié)果(檢測(cè)線未出現(xiàn)條帶)為10個(gè),陽(yáng)性檢出率為90.65%.典型免疫試紙條檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果如圖2.

圖1PVY樣品癥狀

圖2 PVY免疫試紙檢測(cè)結(jié)果

2.2 分子生物學(xué)檢測(cè)分析

2.2.1 PVY分離物總RNA的提取效果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖3.PVY分離物總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠分離,電泳條帶從上至下分別為28S、16S和5S,其中28S rRNA條帶較清晰,表明所提取的RNA質(zhì)量高、完整性較好,可以用來(lái)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及反轉(zhuǎn)錄后的PCR擴(kuò)增.

圖3PVY總RNA凝膠電泳圖

2.2.2 PVY多重RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

圖4結(jié)果表明:97個(gè)煙草PVY陽(yáng)性樣品的多重RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,除5個(gè)混合侵染樣品外,其余91個(gè)樣品顯示4種帶型,分別為1 307+633 bp、1 307+633+441 bp、1 076+633+441 bp和853+441 bp,參照Ali M C[16]的方法,對(duì)應(yīng)的株系類(lèi)型分別為PVYN、PVYNTN、PVYNTN-NW(SYR-Ⅰ)和 PVYNW,其中 PVYNTN、PVYNTN-NW(SYR-I)和PVYNW為重組株系.

圖4 多重RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2.3 PVY全序列擴(kuò)增結(jié)果

1%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖5)顯示出3條不同的電泳條帶,第一片段的條帶大小約為3 800 bp,第二片段大小約為4 100 bp,第三片段大小約為3 100 bp,條帶單一,符合預(yù)期擴(kuò)增片段大小.對(duì)每個(gè)片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)均取50 μL并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收測(cè)序.

圖5 PVY全序列的擴(kuò)增電泳圖

2.2.4 PVY分離物基因組全序列分析

2.2.4.1 PVY分離物的基因組結(jié)構(gòu)

將回收的3個(gè)DNA片段分別測(cè)序,測(cè)序后用DNAMan拼接得到PVY全基因組序列.4個(gè)PVY分離物HLJ-SH8、HLJ-SC2、HLJ-SC6和HLJ-MDJ4的基因組序列全長(zhǎng)分別為9 698 bp、9 702 bp、9 702 bp和9 698 bp.4個(gè)分離物的基因組序列都僅包含一個(gè)由9 186 bp組成的開(kāi)放讀碼框(ORF),編碼一個(gè)由3 061個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白.HLJ-SH8、HLJ-SC6和HLJ-MDJ4的3'-UTR均由331個(gè)堿基組成,HLJ-SC2的3'-UTR由330個(gè)堿基組成.各個(gè)PVY分離物全序列堿基含量見(jiàn)表3.

2.2.4.2 PVY分離物的同源性分析

對(duì)4個(gè)PVY分離物核苷酸及氨基酸進(jìn)行一致性比對(duì),以HLJ-SH8為參照,結(jié)果見(jiàn)表4.從表4中可以看出,所分離的4個(gè)PVY分離物在核苷酸水平和氨基酸水平都有一定的差異性.

4個(gè)PVY分離物序列全長(zhǎng)與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast比對(duì)分析,結(jié)果表明:HLJ-SH8與PVYNW株系相似性最高,為99%;HLJ-SC2與PVYN株系的分離物NE-11相似性最高,為99%;HLJ-SC6與PVYNTN株系的分離物相似性最高,為99%;HLJ-MDJ4與PVYNTN-NW株系分離物相似性最高,為99%.可以初步判定4個(gè)PVY分離物HLJ-SH8、HLJ-SC2、HLJ-SC6和HLJ-MDJ4分別屬于PVYNW株系、PVYN株系、PVYNTN株系和PVYNTN-NW株系.

2.2.4.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)從GenBank下載的55個(gè)PVY分離物的基因組全序列及本研究中克隆的4個(gè)PVY分離物的全基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖6.圖6結(jié)果表明,PVY分離物可分為8個(gè)亞組:PVYN,非重組的PVYNTN和PVYEu-N,重組的PVYNTN、PVYN∶O、PVYNW、PVYNTN-NW、PVYO、PVYC、PVYNP.PVY分離物HLJ-SH8與09-3a親緣性最高,同源性為99%,共同聚類(lèi)到PVYNW組,說(shuō)明此分離物屬于PVYNW亞組.PVY分離物HLJ-SC2與NE-11親緣性最高,同源性為99%,共同聚類(lèi)到PVYN株

系組,說(shuō)明此分離物屬于PVYN組.PVY分離物HLJ-SC6與HN1親緣性最高,同源性為99%,共同聚類(lèi)到PVYNTN組,說(shuō)明此分離物屬于PVYNTN亞組.PVY分離物HLJ-MDJ4與HN2親緣性最高,同源性為99%,與PVYNTN-NW株系分離物聚集到一起,說(shuō)明此分離物屬于PVYNTN-NW組.HLJ-SC6與湖南PVY分離物HN1同源性很高,在NCBI上Blast比對(duì)結(jié)果為99%.HLJ-MDJ4與湖南PVY分離物HN2、貴州分離物Guiding-3同源性很高,在NCBI上Blast比對(duì)結(jié)果均為99%,而與其他已知的PVY分離物全序列比對(duì)結(jié)果為98%以下,這說(shuō)明本試驗(yàn)中分離鑒定的PVYNTN與PVYNTN-NW很有可能起源于我國(guó),至于這兩個(gè)PVY株系與國(guó)外PVY株系是否有地理性的差異,還需要獲得更多的本地PVY全基因組序列并進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證.系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明,黑龍江省煙草PVY可劃分為PVYNW、PVYN、PVYNTN和PVYNTN-NW4個(gè)株系,與多重RT-PCR鑒定結(jié)果一致.

表3 PVY分離物的基因組結(jié)構(gòu)

表4 4個(gè)PVY分離物間的核苷酸與氨基酸同源性比對(duì) (%)

圖6 4個(gè)PVY株系分離物進(jìn)化樹(shù)分析(PVY分離物/基因登錄號(hào))

2.3 黑龍江煙草馬鈴薯Y病毒的區(qū)域分布

根據(jù)多重RT-PCR結(jié)果對(duì)在黑龍江省采集的91個(gè)PVY分離物進(jìn)行區(qū)域分布及各株系發(fā)生情況統(tǒng)計(jì),結(jié)果見(jiàn)圖7.

圖7 多重RT-PCR電泳圖

目前,除PVYO與PVYC株系,PVY其他株系在黑龍江省各個(gè)煙草種植區(qū)都有分布.其中PVYN的比例為18.75%～36.36%,PVYNTN的比例為3.13%～26.32%,PVYNW的比例為12.5%～46.88%,PVYNTN-NW的比例為21.05%～60.00%.具體株系分布情況見(jiàn)表5.

牡丹江煙區(qū)以PVYNTN-NW為主,綏化4個(gè)株系均勻分布,賓縣以PVYN和PVYNW為主,雙城以PVYN與PVYNTN-NW為主,肇州以PVYNW與PVYNTN-NW為主.總體來(lái)看PVYNTN-NW比例最高,分布最廣,是感染黑龍江煙草馬鈴薯Y病毒的優(yōu)勢(shì)株系,PVYNTN的比例最低.由此表明PVY各重組株系已經(jīng)在調(diào)查的黑龍江煙草種植區(qū)中大范圍流行.

表5 黑龍江省煙草PVY株系區(qū)域分布及發(fā)生率

3 結(jié)論與討論

黑龍江煙草種植區(qū)分離鑒定的4個(gè)分離物PVYN、PVYNTN、PVYNW和PVYNTN-NW全部為PVY的重組株系,說(shuō)明馬鈴薯Y病毒的重組株系已經(jīng)在黑龍江煙區(qū)大范圍流行.值得注意的是,PVYNTN-NW株系已經(jīng)成為該煙區(qū)的優(yōu)勢(shì)株系,這一株系是2010年敘利亞報(bào)道的新的馬鈴薯Y病毒株系類(lèi)型,其基因組全長(zhǎng)序列與PVYNTN高度相似.此外,在黑龍江煙草種植區(qū)進(jìn)行的PVY株系鑒定與調(diào)查均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PVYO與PVYC株系,也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PVYNTN-NW中的SYR-Ⅱ和SYR-Ⅲ型,有待于擴(kuò)大樣品的采集地點(diǎn)及寄主范圍,進(jìn)一步對(duì)煙草PVY病毒株系種類(lèi)進(jìn)行長(zhǎng)期檢測(cè)及調(diào)查.另外,還需分別對(duì)分離的幾個(gè)PVY株系材料進(jìn)行接種PVY抗感品種試驗(yàn),以獲得不同株系在不同抗感材料上的癥狀差異,并將分子鑒定與生物學(xué)癥狀聯(lián)系起來(lái),進(jìn)一步明確PVY致病型與基因型的關(guān)系.

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責(zé)任編輯 董志堅(jiān)

Molecular Identification of TobaccoPotato Virus YStrains in Heilongjiang Tobacco Planting Areas

WAN Xiuqing,QIAO Chan*,ZHAO Shujuan,LI Ruo,LI Lijie,and GUO Zhennan
Mudanjiang Tobacco Research Institute,Mudanjiang 157011,Heilongjiang,China

To clarify the kinds and distribution states of tobacco Potato virus Y (PVY)strains in Heilongjiang tobacco planting areas,107 suspected PVY isolates collected from Heilongjiang tobacco planting areas were identified with multiplex polymerase chain reaction(Multiplex-PCR)and sequencing techniques.The results indicated that the full length of genomes in four representative isolates(HLJ-SH8,HLJ-SC2,HLJ-SC6 and HLJ-MDJ4)were 9 698,9 702,9 702 and 9 698 bp,respectively.All of the four isolates contained an open reading frame(ORF)of 9 186 bp in length and encoded a polyprotein of 3 061 amino acids.Phylogenetic analysis indicated that the four isolates were PVYNTN,PVYN,PVYNWand PVYNTN-NWstrains,respectively;among which,PVYNTN-NWstrain was the dominant strain in Heilongjiang tobacco planting areas.

Heilongjiang tobacco planting area;Potato virus Y;Strain identification;Multiplex-PCR;Sequencing

S432.41

A

1002-0861(2015)10-0013-07

10.16135/j.issn1002-0861.20151002

2014-11-28

2015-06-19

黑龍江省煙草專(zhuān)賣(mài)局資助項(xiàng)目quot;煙草PVY抗性相關(guān)基因功能研究quot;(HN201203).

萬(wàn)秀清(1972-),碩士,高級(jí)農(nóng)藝師,主要從事煙草分子生物學(xué)研究.E-mail:wanxiuqing@aliyun.com.cn;*

喬嬋,E-mail:qiaochan_12@163.com

萬(wàn)秀清,喬嬋,趙淑娟,等.黑龍江煙區(qū)煙草馬鈴薯Y病毒株系的分子鑒定[J].煙草科技,2015,48(10):13-18,25.WAN Xiuqing,QIAO Chan,ZHAO Shujuan,et al.Molecular identification of tobacco potato virus Y strains in Heilongjiang tobacco planting areas[J].Tobacco Scienceamp;Technology,2015,48(10):13-18,25.