煙草青枯病抗性與分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析

吳 超,夏巖石,李榮華,呂永華,余義文,趙偉才,邱妙文,郭培國*

1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣州市番禺區(qū)大學(xué)城外環(huán)西路230號(hào) 510006

2.廣東省煙草專賣局(公司),廣州市天河區(qū)林和東路128號(hào) 510610

3.廣東省煙草南雄科學(xué)研究所,廣東省南雄市雄州鎮(zhèn)河南工業(yè)開發(fā)區(qū)東廂鋪1號(hào) 512400

煙草青枯病抗性與分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析

吳 超1,夏巖石1,李榮華1,呂永華2,余義文1,趙偉才3,邱妙文3,郭培國*1

1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣州市番禺區(qū)大學(xué)城外環(huán)西路230號(hào) 510006

2.廣東省煙草專賣局(公司),廣州市天河區(qū)林和東路128號(hào) 510610

3.廣東省煙草南雄科學(xué)研究所,廣東省南雄市雄州鎮(zhèn)河南工業(yè)開發(fā)區(qū)東廂鋪1號(hào) 512400

為了找到與煙草青枯病抗性相關(guān)的分子標(biāo)記、加快抗病品種的選育,以78份煙草種質(zhì)為自然群體材料,選用20對(duì)簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat,SSR)和37對(duì)微衛(wèi)星錨定片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Microsatellite-anchored Fragment Length Polymorphism,MFLP)引物組合對(duì)煙草種質(zhì)材料進(jìn)行基因分型,并利用等位變異數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析和群體結(jié)構(gòu)分析,同時(shí)采用TASSEL3.0軟件對(duì)煙草青枯病抗性與等位變異進(jìn)行連鎖不平衡關(guān)聯(lián)分析.結(jié)果顯示:SSR和MFLP標(biāo)記在78份煙草種質(zhì)中共檢測(cè)到252個(gè)等位變異,主成分分析和群體結(jié)構(gòu)分析均將煙草種質(zhì)分為5個(gè)組群;關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)6個(gè)MFLP標(biāo)記位點(diǎn)與煙草青枯病抗性顯著相關(guān),對(duì)青枯病抗性的解釋率在8.33%～19.49%之間.這些分子標(biāo)記可為評(píng)價(jià)具有青枯病抗性潛力的煙草種質(zhì)材料提供依據(jù).

煙草青枯病;分子標(biāo)記;遺傳多樣性;群體結(jié)構(gòu);關(guān)聯(lián)分析

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一種土傳病害[1].近年來隨著煙草生產(chǎn)集約化程度的提高,煙草青枯病已成為我國南方煙區(qū)煙葉生產(chǎn)上的主要病害之一,并且發(fā)病范圍有向北方煙區(qū)蔓延的趨勢(shì)[2].目前采用的耕作控制、生物防治、化學(xué)防治等措施能夠在一定程度上降低青枯病的危害,但均未取得滿意的防治效果[3-5],而根據(jù)煙草青枯病抗病遺傳特性選育出抗病品種則是控制該病害的最為科學(xué)有效的途徑.有研究表明,煙草青枯病抗性為受多基因控制的數(shù)量性狀,易受到基因型與環(huán)境交互作用(互作)的影響,因此采用傳統(tǒng)方法選育青枯病抗病品種的進(jìn)展較慢[6].分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)能減少環(huán)境互作的影響,提高篩選效率、加快育種進(jìn)程,且已成功應(yīng)用在多種作物上[6-7].基于連鎖不平衡的關(guān)聯(lián)分析是近10年來開展作物分子遺傳和育種應(yīng)用研究的一種新方法,以遺傳背景差異較大的自然群體為研究對(duì)象,經(jīng)過長(zhǎng)期重組保留的基因(或標(biāo)記)位點(diǎn)間的連鎖不平衡為基礎(chǔ),將目標(biāo)性狀表型的多樣性與基因(或標(biāo)記)位點(diǎn)的多態(tài)性相結(jié)合進(jìn)行分析,能直接獲得與表型相關(guān)且具有特定功能的基因(或標(biāo)記)位點(diǎn)[8];與經(jīng)典的連鎖分析相比,關(guān)聯(lián)分析利用自然群體材料多世代中的重組事件,可檢測(cè)同一座位的多個(gè)等位基因,具有更為廣泛的遺傳變異和較高的分辨率以及發(fā)現(xiàn)復(fù)雜性狀所涉及到的多基因及其相互關(guān)系的潛力[9].目前關(guān)聯(lián)分析已在水稻、小麥和大麥等農(nóng)作物的一些農(nóng)藝性狀和相關(guān)基因研究中得到應(yīng)用,并取得一定成效[10-12].但在煙草上的研究報(bào)道較少,余義文等[13]通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)了1個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat,SSR)和 6個(gè)微衛(wèi)星錨定片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Microsatelliteanchored Fragment Length Polymor-phism,MFLP)標(biāo)記的多態(tài)性位點(diǎn)與煙草特有亞硝胺含量顯著相關(guān),任民等[14]找到了24個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)與煙草致香物質(zhì)相關(guān)聯(lián),但未見有關(guān)煙草青枯病抗性關(guān)聯(lián)分析研究的報(bào)道.為此,以78份煙草種質(zhì)材料為自然群體,利用SSR和MFLP標(biāo)記技術(shù)對(duì)自然群體各材料進(jìn)行基因分型,并對(duì)自然群體的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,同時(shí)結(jié)合自然群體各材料的抗病數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,旨在發(fā)現(xiàn)與煙草青枯病抗性相關(guān)的分子標(biāo)記位點(diǎn),為煙草抗青枯病的分子標(biāo)記輔助選擇育種提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

供試78份煙草種質(zhì)材料來源于美國、印尼、毛里求斯、巴西、古巴以及中國(11個(gè)省份),包括烤煙、曬煙、白肋煙和雪茄煙4種類型,由廣東省煙草南雄科學(xué)研究所提供.各煙草種質(zhì)材料信息見表1.

1.2 煙草青枯病病情調(diào)查與分析

供試煙草種質(zhì)材料于2011年和2013年種植于廣東省煙草南雄科學(xué)研究所南雄試驗(yàn)田青枯病病圃,每個(gè)品種栽種20株,采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì).在煙草旺長(zhǎng)期采用莖部穿刺接種法人工注射莖稈接種煙草青枯病菌[15],按照標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23222─2008調(diào)查煙草病害發(fā)生情況[16],以成熟期煙草單株為單位,在晴天12:00-16:00調(diào)查,然后根據(jù)煙草病害等級(jí)計(jì)算每個(gè)煙草種質(zhì)的青枯病病情指數(shù)(DI).

病情指數(shù)=∑(各級(jí)病株數(shù)X該病級(jí)值)/(調(diào)查總株數(shù)X最高級(jí)值)X100

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB/T23224─2008[17]的方法對(duì)78份種質(zhì)進(jìn)行抗病性鑒定.采用SPSS17.0軟件進(jìn)行表型數(shù)據(jù)的描述性統(tǒng)計(jì)和方差分析,依據(jù)環(huán)境方差和遺傳方差計(jì)算廣義遺傳率(H2).

1.3 SSR和MFLP標(biāo)記全基因組掃描

采集不同種質(zhì)材料的煙草幼葉,利用李榮華等[18]改進(jìn)的CTAB方法提取各材料的基因組DNA,采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外可見分光光度法檢測(cè)提取的DNA品質(zhì)和濃度(ng.μL-1).20對(duì)SSR選自Bindler等[19]開發(fā)的引物,分別位于14條不同的染色體上.利用4個(gè)煙草種質(zhì)(D101、RG17、長(zhǎng)脖黃、C151)對(duì)8個(gè)加尾SSR錨定引物與32種MseI選擇性引物組成的256個(gè)MFLP引物組合進(jìn)行擴(kuò)增分析,從中篩選出條帶清晰、多態(tài)性好的37個(gè)MFLP引物組合用于78份煙草種質(zhì)分析.熒光SSR和MFLP標(biāo)記的操作流程及引物名稱、序列信息參考文獻(xiàn)[20-21].兩種標(biāo)記技術(shù)使用的熒光引物M13-F-IRDye 700購自于美國LICOR公司,其他引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

表1 78份煙草種質(zhì)材料的來源與類型Tab.1 The origins and types of 78 tobacco accessions

1.4 數(shù)據(jù)處理

對(duì)SSR和MFLP電泳圖譜進(jìn)行分析,排除圖譜中模糊不清和無法準(zhǔn)確標(biāo)識(shí)的條帶,每個(gè)多態(tài)性條帶視為一個(gè)等位變異位點(diǎn),在相同堿基大小范圍內(nèi)比較所有樣品,有條帶記為1,無條帶記為0,構(gòu)建0、1二元數(shù)據(jù)矩陣.利用PIC-Calc0.6軟件計(jì)算標(biāo)記的多態(tài)信息量(Polymorphism Information Content,PIC).

利用NTSYS-pc2.1軟件的Dcenter和Eigen對(duì)供試煙草材料進(jìn)行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA).利用POPGENE Version 1.31軟件計(jì)算基因多樣性與Shannon信息指數(shù).利用Structure 2.3軟件對(duì)78份煙草材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析,組群數(shù)量(K值)為1～10,將MCMC(Markov Chain Monte Carlo)的不作數(shù)迭代(Length of Burn-in Period)設(shè)為100 000次,再設(shè)置不作數(shù)迭代后的MCMC為100 000次,每個(gè)K值進(jìn)行5次計(jì)算.依據(jù)似然值最大原則選取最合適的K值,繪制群體遺傳結(jié)構(gòu)圖,并獲得關(guān)聯(lián)分析的校正系數(shù)(Q值).應(yīng)用SPAGeDi1.3d軟件計(jì)算煙草種質(zhì)間的親緣系數(shù),并將其中所有負(fù)值設(shè)為0[22].為獲得更準(zhǔn)確的關(guān)聯(lián)結(jié)果,避免亞群混亂造成的偽關(guān)聯(lián),以群體結(jié)構(gòu)Q值和親緣系數(shù)值矩陣作為協(xié)變量進(jìn)行群體校正[23],使用TASSEL3.0軟件的混合線性模型(Mixed Linear Model,MLM)程序[24],將煙草青枯病病情指數(shù)分別與標(biāo)記變異進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,找出與煙草青枯病抗性顯著關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記和MFLP標(biāo)記位點(diǎn),并計(jì)算標(biāo)記位點(diǎn)對(duì)表型變異的解釋率.閾值選擇以Plt;0.01為顯著水平,Plt;0.001為極顯著水平.

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草青枯病病情的統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)78份煙草自然群體進(jìn)行發(fā)病株數(shù)和發(fā)病等級(jí)調(diào)查,依據(jù)每株煙草的發(fā)病等級(jí)計(jì)算各品種的病情指數(shù)并進(jìn)行抗病分級(jí)鑒定,其中9個(gè)品種在兩年的統(tǒng)計(jì)中均表現(xiàn)為抗病(R)(0lt;DI≤20),結(jié)果見表2.青枯病病情指數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(表3)表明,2011年和2013年煙草青枯病病情指數(shù)的變異系數(shù)均較大,分別為51.49%和68.99%;兩年的病情指數(shù)廣義遺傳率均超過70%,分別為72.29%和73.72%.不同供試煙草種質(zhì)對(duì)青枯病抗性差異較大,說明抗病性變異豐富,適合進(jìn)行煙草青枯病抗性關(guān)聯(lián)分析,并能夠提供豐富的煙草種質(zhì)資源用于抗青枯病煙草品種的選育.

表2 煙草青枯病病情指數(shù)與抗性鑒定①Tab.2 Tobacco bacterial wilt disease index and resistance identification

表2(續(xù))

表3 供試煙草青枯病病情指數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析①Tab.3 Statistic data of tobacco bacterial wilt disease index

2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性分析

使用20對(duì)SSR引物對(duì)78份煙草種質(zhì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增,共檢測(cè)到85個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)目變化范圍2～8個(gè),平均每個(gè)SSR標(biāo)記存在4.25個(gè)等位變異.SSR標(biāo)記的PIC值變幅為0.246 1～0.795 9,平均PIC值為0.542 7.利用37對(duì)MFLP引物進(jìn)行擴(kuò)增,檢測(cè)到167個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),平均每對(duì)引物擴(kuò)增了4.51個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),PIC變幅為0.313 0～0.913 8,平均PIC值為0.629 8.表明所選SSR引物與MFLP引物具有較高的多態(tài)性,用這些引物對(duì)供試煙草材料進(jìn)行擴(kuò)增可以反映較豐富的多態(tài)性信息.具體每個(gè)SSR引物與MFLP引物擴(kuò)增的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)和PIC,見表4.利用兩種分子標(biāo)記共檢測(cè)到252個(gè)等位變異位點(diǎn).

表4SSR標(biāo)記與MFLP標(biāo)記的等位變異分析Tab.4 Allelic variation analysis of SSR markers and MFLP markers

表4(續(xù))

2.3 煙草種質(zhì)的主成分分析

對(duì)78份供試煙草種質(zhì)材料進(jìn)行基于0、1數(shù)據(jù)矩陣的PCA分析,第1主成分能夠解釋的遺傳變異為20.38%,第2和第3主成分解釋的遺傳變異分別為11.45%和10.87%,合計(jì)為42.70%.以78份材料的三維主成分?jǐn)?shù)據(jù)繪制三維分布圖(圖1).根據(jù)位置近則親緣關(guān)系近,位置遠(yuǎn)則親緣關(guān)系遠(yuǎn)的原則[25],78份煙草種質(zhì)可分為5個(gè)類群.類群a包含5份煙草種質(zhì),其中我國曬煙和烤煙品種各2份,另1份為美國烤煙品種NC60;類群b共有23份煙草種質(zhì),包括除NC60以外的全部17份供試美國烤煙品種和6份我國的地方烤煙品種;類群c包括24份煙草種質(zhì),含有供試的3份不同國家的白肋煙品種、1份古巴雪茄煙品種、8份曬煙品種以及12份烤煙品種;類群d含有18份煙草種質(zhì),除云煙87以外均為曬煙品種,其中14份為廣東曬煙品種;類群e包含8份煙草種質(zhì),7份廣東曬煙和1份海南曬煙品種.從PCA分析結(jié)果來看,供試的23份廣東曬煙中有21份被歸類到d和e類群,占供試廣東曬煙種質(zhì)的91.3%;廣東曬煙與美國烤煙分別歸屬到了不同的類群中,二者間的遺傳距離較遠(yuǎn).

2.4 種質(zhì)群體結(jié)構(gòu)與基因多樣性分析

圖1 78份煙草種質(zhì)材料的三維主成分分析Fig.1 Three-dimension principal component analysis of 78 tobacco accessions

圖2K值與ln P(D)值分布圖Fig.2 Distribution chart ofKand ln P(D)

利用Structure 2.3軟件對(duì)78份煙草種質(zhì)材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析.K值取1～10,以K值為橫坐標(biāo),相應(yīng)ln P(D)值為縱坐標(biāo)做圖.結(jié)果(圖2)顯示:78份煙草種質(zhì)的等位變異頻率特征類型數(shù)K=5(即服從Hardy-Weinberger平衡的組群數(shù)目為5)時(shí)其ln P(D)值最大,表明當(dāng)K=5時(shí)其模型后驗(yàn)概率最大.因此78份煙草種質(zhì)材料可分為5個(gè)組群,群體結(jié)構(gòu)如圖3所示.

對(duì)各煙草種質(zhì)材料在不同組群的Q值進(jìn)行分析,其中66個(gè)種質(zhì)材料在所屬組群的Q值大于0.5,占全部供試材料的84.62%,這些種質(zhì)遺傳組分相對(duì)單一,可歸入5個(gè)組群中某一個(gè),另外12個(gè)種質(zhì)在組群中的Q值均小于0.5,列為混合群體,其組群歸屬特征不明顯(表5).

圖3 78份煙草種質(zhì)材料的群體結(jié)構(gòu)Fig.3 Population structure of 78 tobacco accessions

表5 78份煙草種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)Tab.5 Population structure of 78 tobacco accessions

表5(續(xù))

表5(續(xù))

對(duì)66份歸入指定組群的煙草種質(zhì)材料進(jìn)行分析表明,在5個(gè)組群中,組群I包括5個(gè)煙草種質(zhì),其中有3個(gè)烤煙和2個(gè)曬煙.組群II包括23個(gè)煙草種質(zhì),全部為烤煙,其中包含了除NC60以外的全部17個(gè)供試美國烤煙品種與6個(gè)中國烤煙品種.組群III包括15個(gè)煙草種質(zhì),其中包括2個(gè)白肋煙、9個(gè)烤煙、4個(gè)曬煙.組群IV包括15個(gè)煙草種質(zhì),其中包括14個(gè)曬煙和1個(gè)云南烤煙(云煙87),該組群14個(gè)曬煙中有12個(gè)為廣東曬煙品種.組群V包括8個(gè)煙草種質(zhì),其中7個(gè)為廣東曬煙.組群IV和V中絕大多數(shù)為廣東曬煙.PCA分析中類群c的24個(gè)煙草種質(zhì)中除組群III包含的15份種質(zhì)材料外,另有5份在組群III的Q值最大,4份在組群III的Q值較大;類群d的18個(gè)種質(zhì)中包括了組群IV的15份種質(zhì)材料和3個(gè)在組群IV的Q值最大的種質(zhì).群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果與PCA分析結(jié)果基本一致.

種質(zhì)材料間的親緣系數(shù)計(jì)算結(jié)果顯示:兩種質(zhì)間親緣系數(shù)位于0～0.05之間的組合占總組合的73.96%,其中54.11%親緣系數(shù)為0,所有親緣系數(shù)均小于0.5.表明大多數(shù)供試種質(zhì)材料間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)或無親緣關(guān)系.對(duì)利用群體結(jié)構(gòu)分析產(chǎn)生的5個(gè)組群進(jìn)行基因多樣性和Shannon指數(shù)分析,基因多樣性大小和Shannon指數(shù)大小基本一致,5個(gè)組群的基因多樣性由大到小依次為組群IIIgt;組群Vgt;組群IVgt;組群Igt;組群II,Shannon指數(shù)大小依次為組群IIIgt;組群Vgt;組群IVgt;組群IIgt;組群I.對(duì)各組群的基因多樣性和Shannon指數(shù)分別進(jìn)行了差異顯著性分析,結(jié)果見表6.從表6中可見,組群IV和組群V間基因多樣性與Shannon指數(shù)均無顯著差異,遺傳距離相對(duì)較近,而在PCA圖上距離較遠(yuǎn)的群體差異顯著.

表6 組群的遺傳多樣性①Tab.6 Summary statistics of genetic diversity of groups

2.5 煙草青枯病抗性與分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析

將78份煙草群體結(jié)構(gòu)分析中K=5時(shí)對(duì)應(yīng)的Q值以及計(jì)算的親緣系數(shù)值作為關(guān)聯(lián)分析的協(xié)變量,將252個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)與供試煙草材料的青枯病病情指數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果見表7.發(fā)現(xiàn)6個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)與煙草青枯病抗性存在顯著關(guān)聯(lián),其中MFLP標(biāo)記位點(diǎn)M142與2011年和2013年病情指數(shù)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均顯著相關(guān),對(duì)表型變異的解釋率分別為10.42%和9.04%.標(biāo)記M184和M221與2013年青枯病病情指數(shù)顯著相關(guān),M146、M206和M237與2011年青枯病病情指數(shù)顯著相關(guān).各標(biāo)記位點(diǎn)對(duì)青枯病抗性表型變異的解釋率在8.33%～19.49%之間,平均解釋率為11.08%.

表7 與煙草青枯病病情指數(shù)關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)及對(duì)表型變異的解釋率Tab.7 Marker loci associated with tobacco disease index of bacterial wilt and their explained portion of phenotypic variation

3 結(jié)論與討論

群體結(jié)構(gòu)的存在會(huì)通過對(duì)等位變異位點(diǎn)(LD)的影響而影響關(guān)聯(lián)分析的準(zhǔn)確性.在不考慮試驗(yàn)材料群體結(jié)構(gòu)的情況下,組群的混合使整個(gè)自然群體所估計(jì)的LD強(qiáng)度增強(qiáng),有可能造成表型性狀與多態(tài)位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性并不是由功能性等位基因引起,從而造成假關(guān)聯(lián)[26].納入結(jié)構(gòu)分析后的Q值可矯正關(guān)聯(lián)分析的偏差,避免了組群混合造成的偽關(guān)聯(lián)[27].在本試驗(yàn)中利用252個(gè)分子標(biāo)記等位變異數(shù)據(jù),對(duì)供試煙草種質(zhì)材料進(jìn)行的群體結(jié)構(gòu)分析在K值為5時(shí)ln P(D)值出現(xiàn)拐點(diǎn),從而將78份煙草分為5個(gè)組群.絕大多數(shù)烤煙與曬煙品種被歸到不同組群,表明烤煙與曬煙之間具有一定的遺傳差異.從美國烤煙與部分中國烤煙分在同一組群,以及中國不同省份烤煙分在同一組群這一結(jié)果可以看出,不同地區(qū)烤煙的遺傳多樣性差異并不大.廣東曬煙分布在兩個(gè)組群,與其他地區(qū)曬煙組群不同,表明廣東曬煙與其他地區(qū)曬煙間的遺傳差異較大,該結(jié)果與何其芳等[20-21]的研究結(jié)論基本一致;亦與早期報(bào)道的我國煙草材料不同煙草類型間遺傳差異較大,烤煙遺傳多樣性水平較低,曬煙遺傳變異較豐富的研究結(jié)果基本一致[28-29].另外,種質(zhì)材料的PCA分析與群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果基本一致,兩種方法的結(jié)合以及相互驗(yàn)證,提高了試驗(yàn)結(jié)果的可靠性;同時(shí)PCA分析結(jié)果進(jìn)一步證明了K值為5時(shí)群體結(jié)構(gòu)劃分的合理性,用該條件下的各個(gè)體Q值作為關(guān)聯(lián)分析的一個(gè)協(xié)變量是合理的.

煙草青枯病抗性屬于典型的數(shù)量性狀遺傳,由多基因共同控制,并受環(huán)境因素影響較大,準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)煙草的抗青枯病表型數(shù)據(jù)對(duì)研究抗病標(biāo)記至關(guān)重要[30].本研究中以種植于南雄煙科所試驗(yàn)田青枯病病圃的78份親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的煙草種質(zhì)為研究材料,采用國標(biāo)中的病情統(tǒng)計(jì)和鑒定方法進(jìn)行分析,避免了標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一造成的誤差,保證了表型數(shù)據(jù)的可靠性.對(duì)病情指數(shù)的分析結(jié)果表明:2011年和2013年病指的變異系數(shù)均大于50%,種質(zhì)間遺傳差異大,適用于關(guān)聯(lián)分析.對(duì)群體的基因分型所得0、1矩陣進(jìn)行了Kinship分析,再次驗(yàn)證了供試種質(zhì)間親緣關(guān)系較遠(yuǎn).正確的自然群體結(jié)構(gòu)對(duì)于有效控制假陽性、提高關(guān)聯(lián)分析可靠性至關(guān)重要.以群體結(jié)構(gòu)Q值和親緣系數(shù)值作為協(xié)變量,采用MLM_Q+親緣系數(shù)值模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)了M142、M146和M184等6個(gè)與煙草抗病顯著關(guān)聯(lián)的MFLP標(biāo)記位點(diǎn),其中標(biāo)記M142與兩年的病指均顯著關(guān)聯(lián).有研究表明MLM_Q+親緣系數(shù)值模型為煙草群體關(guān)聯(lián)分析的最優(yōu)模型之一,能夠有效控制假陽性的產(chǎn)生[23],因此研究結(jié)果可靠性較高.

篩選與目的基因相關(guān)的分子標(biāo)記是分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)育種的前提,連鎖分析和基于連鎖不平衡的關(guān)聯(lián)分析是現(xiàn)今解析復(fù)雜性狀遺傳、發(fā)現(xiàn)與目標(biāo)基因緊密連鎖或共分離關(guān)系分子標(biāo)記、進(jìn)而開發(fā)出分子標(biāo)記并用于MAS育種的主要方法[26].已有一些研究報(bào)道了利用兩個(gè)煙草親本的雜交后代作材料,對(duì)青枯病抗病性進(jìn)行了連鎖分析并取得了一些成績(jī),發(fā)現(xiàn)一些與青枯病抗性密切相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTLs)[6,31-33].由于連鎖分析在構(gòu)建分離群體時(shí)受雜交和自交次數(shù)的限制,發(fā)生的重組次數(shù)較少,另外連鎖分析僅涉及同一座位的兩個(gè)等位基因;而青枯病抗性是由多基因控制的復(fù)雜性狀,每一個(gè)基因可能對(duì)抗病性起著微效作用,且有些基因的外顯力低,受環(huán)境的影響較大,連鎖分析方法難以完全解析這一復(fù)雜的關(guān)系[26].因此,現(xiàn)階段通過連鎖分析定位青枯病抗病QTLs的結(jié)果與離分子標(biāo)記輔助選擇育種的要求有一定的距離[34].而基于連鎖不平衡的關(guān)聯(lián)分析對(duì)發(fā)現(xiàn)復(fù)雜性狀所涉及的多基因及相互關(guān)系具有較大的潛力,這種方法選用遺傳背景差異大的自然群體為研究對(duì)象,檢測(cè)多世代重組事件中同一座位的多個(gè)等位基因,并對(duì)等位變異與表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,能較準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)等位變異與性狀的關(guān)系[25],是現(xiàn)今解析植物數(shù)量性狀遺傳的主要方法之一.本研究中利用SSR和MFLP標(biāo)記對(duì)煙草種質(zhì)材料進(jìn)行了煙草青枯病抗性關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)了與青枯病抗性相關(guān)的6個(gè)MFLP分子標(biāo)記位點(diǎn),這一結(jié)果可為煙草抗青枯病的分子標(biāo)記輔助選擇育種提供理論依據(jù).

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責(zé)任編輯 董志堅(jiān)

Association Analysis of Tobacco Bacterial Wilt Resistance with Molecular Markers

WU Chao1,XIA Yanshi1,LI Ronghua1,Lü Yonghua2,YU Yiwen1,ZHA O Weicai3,QIU Miaowen3,and GUO Peiguo*1

1.School of Life Sciences,Guangzhou University,Guangzhou 510006,China
2.Guangdong Tobacco Monopoly Administration,Guangzhou 510610,China
3.Nanxiong Tobacco Science Research Institute of Guangdong Province,Nanxiong 512400,Guangdong,China

In order to find out the molecular markers related to tobacco bacterial wilt(TBW)resistance and speed up the breeding process of cultivars resistant to TBW,78 tobacco accessions were selected as natural population,genotyping was performed with 20 pairs of simple sequence repeat(SSR)primers and 37 pairs of microsatellite-anchored fragment length polymorphism(MFLP)primers.Principal component analysis and population structure analysis were conducted with allelic variation data,and the linkage disequilibrium association analysis between TBW resistance and allelic variants was carried out by TASSEL3.0 software.The results showed that 252 allelic variants were detected by SSR and MFLP in 78 tobacco accessions,these accessions were classified into 5 groups by both principal component analysis and population structure analysis.Association analysis indicated that 6 MFLP loci significantly associated with TBW resistance,which explained 8.33%-19.49%of the phenotypic variation of TBW resistance.These molecular markers can be used as reference indexes for evaluating the tobacco accessions with potential TBW resistance.

Tobacco bacterial wilt;Molecular marker;Genetic diversity;Population structure;Association analysis

S432.41

A

1002-0861(2015)10-0001-12

10.16135/j.issn1002-0861.20151001

2014-12-12

2015-04-30

廣東省煙草專賣局(公司)科技計(jì)劃項(xiàng)目quot;連鎖和連鎖不平衡聯(lián)合作圖技術(shù)在煙草青枯病抗性育種上的應(yīng)用quot;(201201);quot;煙草抗青枯病育種及分子標(biāo)記輔助選擇研究quot;(201403).

吳超(1987-),在讀碩士研究生,研究方向:煙草分子生物學(xué).E-mail:wuchao02207101@foxmail.com;*

郭培國,E-mail:guopg@yahoo.com;guopg@gzhu.edu.cn

吳超,夏巖石,李榮華,等.煙草青枯病抗性與分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析[J].煙草科技,2015,48(10):1-12.WU Chao,XIA Yanshi,LI Ronghua,et al.Association analysis of tobacco bacterial wilt resistance with molecular markers[J].Tobacco Scienceamp;Technology,2015,48(10):1-12.