基于山梨醇多次同步化處理的惡性瘧原蟲體外培養(yǎng)同步化方法

姚 瑤 張連惠 席玨敏 郭 莉 李 月 王 恒

(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所病原生物學系,北京 100005)

瘧疾是由瘧原蟲引起的危害最嚴重的寄生蟲病，據(jù)據(jù)2014年WHO 瘧疾報告報道，全世界仍有99個國家和地區(qū)，約33億人受到感染瘧疾的威脅。2013年全球有1億9千萬瘧疾報告病例，58.4萬人死亡(Chan, 2014)。能引起人類患病的瘧原蟲種包括惡性瘧原蟲Plasmodiumfalciparum、間日瘧原蟲P.vivax、三日瘧原蟲P.malariae、卵形瘧原蟲P.ovale、諾氏原蟲P.knowlesi五種( Cox-Singhetal., 2008; Barberetal., 2011; Kanteleetal., 2011)。其中惡性瘧原蟲的毒力最強，致死率也最高(Lutyetal., 2000)，因此針對惡性瘧原蟲致病機制的研究具有重要的意義。

惡性瘧原蟲紅內(nèi)期是從瘧原蟲裂殖子在肝細胞破裂釋放入外周血循環(huán)后侵入紅細胞開始的，由于紅內(nèi)期是導致患者出現(xiàn)臨床癥狀以致威脅生命的階段，因此受到廣泛的重視和研究(Maieretal., 2013)。惡性瘧原蟲在紅內(nèi)期發(fā)育和增殖的一個周期大約為48 h，包括裂殖子期(Merozoite)、環(huán)狀體期(Ring Stage)、早期和晚期滋養(yǎng)體期(Trophozoite Stage)以及成熟裂殖體期(Schizont Stage)(Cox, 2010)。在這些發(fā)育過程中，惡性瘧原蟲的生長代謝非常活躍，并且與宿主之間在不同發(fā)育階段表現(xiàn)出不同的分子間相互作用(Maieretal., 2013)，全面揭示這些分子機制將有助于人類更有效地預防和控制瘧疾。而完成上述研究工作的前提是獲得瘧原在紅細胞各發(fā)展階段較為精準的蟲體材料，即實現(xiàn)對在人紅細胞內(nèi)生長的瘧原蟲進行有效的同步化(Trageretal., 1976)。能否達到此目標，將明顯影響對惡性瘧原蟲生長周期調(diào)節(jié)機制以及對其精細組學特點的研究質(zhì)量。

目前常用的瘧原蟲體外培養(yǎng)同步化處理方法包括濃度分離法(The density method)(Jensen, 1978)、滲透壓分解法(The osmotic lysis method)(Lambrosetal., 1979)、Percoll梯度法(Percoll gradient method)(Rivadeneiraetal., 1983)、溫度周期法(Temperature cycling method)(Haynesetal., 2002)、Plasmion富集法(Plasmion enrichment method)(Lelievreetal., 2005)、磁性分離法(Magnetic separation method)(Ahnetal., 2008; Spadaforaetal., 2011)以及溫度處理法，即將培養(yǎng)瓶放在4 ℃環(huán)境一段時間可以同步化蟲體(Yuanetal., 2014)。這些方法均難以達到精準的同步化程度，給實驗結(jié)果的分析帶來很大的困擾。其中“濃度分離法”基于被惡性瘧原蟲感染的紅細胞沉降速度受原蟲不同發(fā)育階段的影響所顯示的差異，此方法可以分離出各個時期的瘧原蟲，但同步化程度相對較低(郝明明等, 2012)。Percoll是一種經(jīng)聚乙烯吡喀烷酮(PVP)處理的硅膠顆粒，利用Percoll液經(jīng)高速離心后形成一個連續(xù)密度梯度的原理，可將密度不等的細胞分離純化?；诒粣盒辕懺x感染紅細胞在不同發(fā)育階段細胞密度的差別，可將Percoll配置成不同的濃度梯度來分離各期瘧原蟲，該法是分離純化各期瘧原蟲較好的一種方法，不足之處在于操作流程較長，步驟較多，尤其對處于滋養(yǎng)體晚期和成熟裂殖體期的瘧原蟲區(qū)分度低?！皽囟忍荻确ā蓖ㄟ^在某個時期升高和降低培養(yǎng)溫度，來抑制瘧原蟲的進一步發(fā)育，然后將培養(yǎng)溫度恢復到37 ℃，此時瘧原蟲會很快發(fā)育到裂殖體，使裂殖子同時釋放并侵染紅細胞，但該方法的同步化程度并不盡如人意。

“磁性柱分離法”利用磁性吸附柱(Magnetic bead column)吸附瘧原蟲產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物瘧色素，可對瘧色素含量各異的各期瘧原蟲進行有效的分離，由于方法需要使用特殊的儀器，加大了試驗成本。其他化學方法，例如肝素，可抑制裂殖子表面與侵襲紅細胞有關(guān)的重要蛋白(MSP-1)的結(jié)合(Boyleetal., 2010a)，從而使大部分破裂的裂殖子無法侵襲感染新的紅細胞而死亡，從而獲得較少的同步化的裂殖體，但是，該方法對于瘧原蟲的生長發(fā)育過程中的生物代謝與調(diào)節(jié)過程可能有較大影響，不適宜進行后期的組學或者其他功能方法學研究。

本研究旨在通過改進滲透壓分解技術(shù)，探索在體外培養(yǎng)過程中獲得在生長各階段同步化程度高的惡性瘧原蟲實驗方法。

1 材料方法

1.1 實驗材料

D-山梨醇購自上海生工，葡萄糖購自北京化工廠，慶大霉素購自天津藥業(yè)焦作有限公司，L-谷氨酰胺和次黃嘌呤購自Sigma公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清(FBS)和Albumax II購自Invitrogen公司，HEPES buffer購自Andybio公司，Giemsa′s染液購自萬類生物有限公司。

1.2 惡性瘧原蟲體外培養(yǎng)

本研究用瘧原蟲蟲株為P.falciparum3D7蟲株(Gardneretal., 2002)，由美國ATCC下屬MR4惠贈。

采用標準的體外連續(xù)培養(yǎng)法培養(yǎng)P.falciparum3D7蟲株。培養(yǎng)條件：紅細胞容積為5%(5% CO2濃度，5% O2濃度，37 ℃)。

1.3 感染血涂片Giemsa′s染色

將感染血滴于載玻片的一端(約5 μL)，推片形成厚薄適中的均勻血膜；快速吹干血膜，然后用甲醇固定。然后在載玻片上以7∶1的比例滴加PBS 溶液和Giemsa′s染液，室溫靜置10 ～ 15 min。用蒸餾水洗去染液，吹干，油鏡觀察。

1.4 體外培養(yǎng)惡性瘧原蟲同步化處理

體外培養(yǎng)的惡性瘧原蟲進行同步化處理之前，先密切觀察其生長周期(48 h)。在不同時間點，采用5%山梨醇連續(xù)2～3次處理P.falciparum3D7蟲株，來獲得處于不同時期(環(huán)期、早期滋養(yǎng)體期(T1期)、晚期滋養(yǎng)體期(T2期)、成熟裂殖體期和裂殖子期)的同步化蟲株。

第1次同步化處理 選擇環(huán)狀比例較高(約80%)的P.falciparum3D7蟲株，收集到15 mL 無菌離心管里，1 600 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用37 ℃ 預熱5% 山梨醇溶液重懸，二者的體積比例為 1∶12，混勻后37℃放置15 min。取出后，用1 600 r/min 離心5 min 棄去上清，用10 mL 不完全培養(yǎng)基洗兩次，加入合適體積的完全培養(yǎng)基37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)。

第2次同步化處理 繼續(xù)培養(yǎng)蟲株，并在44 h之后密切觀察瘧原蟲生長發(fā)育情況，當有瘧原蟲進入第2個新的生長周期后，繼續(xù)培養(yǎng)蟲株數(shù)小時(4 ～ 6 h，培養(yǎng)時間根據(jù)想要獲得的瘧原蟲的同步化的窗口以及蟲血率不同而不同)，用5%的山梨醇進行第2次同步化處理。第2次同步化處理后，可以直接收集同步化程度高的環(huán)狀體期，或者繼續(xù)培養(yǎng)12、24和36 h后收集早期滋養(yǎng)體、晚期滋養(yǎng)體和成熟裂殖體。如果生長到相應生長周期的蟲株同步化程度達不到80%,可以再進行一次同步化處理。

體外培養(yǎng)惡性瘧原蟲經(jīng)兩次連續(xù)同步化處理后，培養(yǎng)至裂殖體期(40 ～ 44 h)，觀察到有已經(jīng)成熟的裂殖子在紅細胞內(nèi)已經(jīng)形成后，將培養(yǎng)皿置于室溫條件下繼續(xù)培養(yǎng)(17～ 20 ℃)，每隔1 h觀察裂殖體破裂情況。當有大量裂殖子游離在培養(yǎng)基中時(超過50%)，用孔徑1.2 μm的無菌濾膜過濾，收集裂殖子。

1.5 統(tǒng)計學方法

蟲血率(%)= 感染瘧原蟲紅細胞數(shù)/總紅細胞數(shù)，紅細胞計數(shù)1 000個以上。

同步化程度(%)=處于特定時期惡性瘧原蟲感染紅細胞數(shù)/感染紅細胞總數(shù)，感染紅細胞計數(shù)200以上。

2 結(jié)果

2.1 惡性瘧原蟲體外培養(yǎng)形態(tài)學特征

油鏡下觀察，惡性瘧原蟲有如下特征：(1)位于紅細胞內(nèi)；(2)紫紅色的細胞核和淡藍色的胞漿；(3)細胞內(nèi)可見棕褐色的折光顆粒(瘧色素顆粒)。不同時期的惡性瘧原蟲見圖1。

圖1 體外培養(yǎng)惡性瘧原蟲未同步化蟲株Fig.1 Unsynchronized P. falciparum 3D7 parasites cultured in vitro綠色、黑色、藍色和紅色分別指示裂殖子、環(huán)期、滋養(yǎng)體期和成熟裂殖體期。Green, black, blue and red arrows indicated merozoites, ring stage, trophozoite and mature schizont stage P. falciparum 3D7 parasites.

2.2 惡性瘧原蟲體外培養(yǎng)同步化結(jié)果

經(jīng)同步化處理之后，惡性瘧原蟲在環(huán)期、早期滋養(yǎng)體期、晚期滋養(yǎng)體期和成熟裂殖體期的同步化程度分別在90%、85%、85%和80%以上。環(huán)狀體期窗口為4～8 h，早期滋養(yǎng)體期窗口為16～20 h，晚期滋養(yǎng)體期窗口為24～28 h，成熟裂殖體期窗口為40 ～44 h；各期惡性瘧原蟲同步化后的蟲血率可達10%～20%。圖2A-D為同步化后處于不同時期的惡性瘧原蟲的示意圖。

圖2 體外培養(yǎng)惡性瘧原蟲同步化Fig.2 Synchronized P. falciparum 3D7 parasites cultured in vitroA～D分別表示處于環(huán)期、早期滋養(yǎng)體期、晚期滋養(yǎng)體期和成熟裂殖體期的惡性瘧原蟲同步化示意圖。A-D represented synchronized P. falciparum 3D7 parasites in ring stage, early and late trophozoite, as well as mature schizont stage, respectively.

經(jīng)同步化處理，同樣能收集同步化程度較高的裂殖子。圖3-A和B分別為用孔徑1.2 μm的無菌濾膜過濾收集前、后的裂殖子示意圖。

圖3 過濾收集前(A)、后(B)裂殖子Fig.3 Merozoites harvested before(A) and after(B) filtration

3 討論

在本研究中，通過多次使用山梨醇對紅內(nèi)期的瘧原蟲進行同步化處理，證實獲得在各個時期的同步化率達到80%以上的惡性瘧原蟲，并能獲得較高的蟲血率。山梨醇方法是目前實驗室使用的最為經(jīng)典的同步化方法，其作用原理為山梨醇溶液對較成熟的瘧原蟲的紅細胞有選擇性的溶解作用，因此通過山梨醇處理可使體外培養(yǎng)的惡性瘧原蟲的生長維持在環(huán)狀體期。本研究利用多次連續(xù)使用山梨醇同步化處理初始環(huán)狀體比例較高的瘧原蟲，在未對瘧原蟲的生長發(fā)育過程產(chǎn)生不良影響的前提下，除可獲得同步化程度較高的蟲株，由于通過控制后續(xù)同步化的時間點，可縮短同步化蟲株的周期窗口至4 h以內(nèi)。

此外，在收集有活性的裂殖子時，目前一般采用E64蛋白酶抑制劑(N-(反式-環(huán)氧丁二酰基)-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺)來抑制裂殖體的破裂(Boyleetal., 2010b)，從而達到收集裂殖子的目的。但該方法試劑價格昂貴，操作較為繁瑣復雜。本實驗利用室溫法培養(yǎng)晚期裂殖體，減慢裂殖子侵襲感染新鮮紅細胞的速度，再利用直徑小于紅細胞小，大于裂殖子的濾膜來收集裂殖子，能快速便捷獲得有活性的裂殖子。

在使用本文建立的方法進行操作時，仍需考慮以下影響因素：如山梨醇多次連續(xù)處理感染紅細胞對細胞有的一定毒性(Songetal., 2012)，因此，連續(xù)同步化的次數(shù)不要超過3次，或者在2次同步化后繼續(xù)培養(yǎng)兩個以上周期之后再進行同步化處理，對于紅細胞和瘧原蟲的生長恢復較為有利；再者，室溫法培養(yǎng)瘧原蟲是否會一定程度影響裂殖體的生長代謝過程尚不能定論。

綜上所述，通過連續(xù)多次使用山梨醇對紅細胞內(nèi)期的瘧原蟲進行同步化處理，即可將各期瘧原蟲發(fā)育階段的周期窗口縮小，也可獲得同步化程度高達80%、蟲血率在10%～20%的不同階段瘧原蟲，供進一步的實驗研究使用。由于本方法操作步驟簡便易行，無需復雜昂貴的試劑儀器等實驗條件，對惡性瘧原蟲紅內(nèi)期感染的基礎性研究的實驗室更為實用。