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    龍葵鮮藥對人鼻咽癌細胞CNE-1增殖抑制和凋亡的影響*

    2015-11-26 10:53:34徐俊鴻高卓維黃景彬仇志坤伍志勇
    黑龍江中醫(yī)藥 2015年3期
    關(guān)鍵詞:煎液龍葵藥水

    徐俊鴻 高卓維 黃景彬 仇志坤 伍志勇

    (廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬順德中醫(yī)院(佛山市順德區(qū)中醫(yī)院)· 佛山 528333)

    1 材料和方法

    1.1 細胞株與試劑

    人鼻咽癌細胞CNE-1(由中國科學(xué)院提供),細胞培養(yǎng)試劑:胎牛血清(Hyclone,Cat.No.SH30087.01),RPMI-1640 培養(yǎng)基(Hyclone,Cat.No.SH30809.01B),青鏈霉素(Hyclone,Cat.No. H30010),PBS 磷酸鉀緩沖液(Hyclone,Cat.No.SH30256.01B)

    1.2 實驗用藥與儀器實驗用藥與儀器:實驗用藥:龍葵鮮藥由順德中醫(yī)院提供。龍葵鮮藥水煎提取液(1g/ml)的制備:取鮮龍葵500g,加水1000m1煎煮,得第一次提取液約500ml;再將其藥渣用水700ml煎煮,得第二次提取液約500ml。兩次提取液混合,過濾,濾液再加熱濃縮至500ml,即得。龍葵鮮藥水煎提取液由順德中醫(yī)院制劑室制備。儀器:蘇州安泰潔凈工作臺(SWCJ-IFD),低速離心機(中佳,SC3614),倒置光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS CKX41, U-CTR30-2), 細胞恒溫培養(yǎng)箱(Thermo scientific, HERACELL150i) 倒置熒光顯微鏡生產(chǎn)商:Leica型號:DMI6000B

    1.3 實驗方法

    1.3.1 藥物配制及分組 藥物過濾除菌,藥液配成濃度為1g/ml于-20℃保存,實驗時取出用新鮮培養(yǎng)基配成相應(yīng)的濃度進行給藥。實驗分組:按龍葵鮮藥水煎液濃度分為5mg/ml組、10mg/ml組、30mg/ml組、50mg/ml組和80mg/ml組,對照組不加藥。

    1.3.2 CNE-1細胞培養(yǎng) 復(fù)蘇CNE-1細胞。將其用RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清青霉素、鏈霉素100U/ml)于37℃,5%C02飽和濕度培養(yǎng)條件下培養(yǎng),每隔2~3天換一次液。置倒置顯微鏡下觀察,待細胞取匯合率達80%~90%時,

    用0.25%胰酶(含0.02%EDTA)消化,按1:2~3傳代培養(yǎng)或者進行實驗。

    1.3.3 MTS法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期細胞,經(jīng)消化后吹打散細胞,計數(shù),調(diào)整細胞濃度為1×105 個/ml,分到96孔板,每孔100ul,即每孔細胞為1×104個,每個濃度組(5mg/ml、10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、80mg/ml)和對照組均做3個復(fù)孔。貼壁細胞需待細胞貼壁后,再收集各時間點細胞進行檢測。收集各個時間點的細胞(24h,48h,72h)加入cellTiter96AQ 單溶液細胞增殖檢測試劑(Promega,Cat.No.G3582),比例為1/10(即100ul培養(yǎng)液加入10ul 檢測液)。

    孵育4 小時后,使用KC-100酶標儀讀板(波長490),讀取OD值數(shù)據(jù)。抑制率=(1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值 )×100%。

    1.3.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡/壞死 上述各組細胞培養(yǎng)48h后,將細胞培養(yǎng)板各組的培養(yǎng)基分別轉(zhuǎn)移到15 ml的錐形管中,并置于冰上。用2 ml PBS溶液輕輕洗細胞2次。加入0.5ml 0.25%胰酶(不含EDTA)消化。用預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液中使得其密度約為1×106細胞/ml。將細胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi),加入1.25 μl Annexin V-FITC后與室溫(18-24°C)避光反應(yīng)15分鐘。室溫1000×g離心5分鐘,去除上清。將細胞用0.5 ml 預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液輕輕重懸。加入10 μl Propidium Iodide試劑后,將樣本放置在冰上避光保存。室溫孵育15分鐘,立即用流式細胞儀檢測分析。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示。采用SPSS 16.0軟件,多組計量資料分析采用One way ANOVA,多重比較采用Dunnett’s 法進行比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 龍葵鮮藥水煎液對CNE-1細胞增殖的抑制作用(表1)

    在加入龍葵鮮藥水煎液24小時后,對照組5mg/ml、10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、80mg/ml組的CNE-1細胞平均抑制率分別為0.00%、4.21%、5.88%、7.40%、6.68%和4.43%,各劑量組的平均抑制率與對照組比較,差異均有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);各劑量組的的平均抑制率間相合比較,差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    表1 龍葵鮮藥水煎液對CNE-1細胞增殖的影響

    在加入龍葵鮮藥水煎液48小時后,對照組5mg/ml、10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、80mg/ml組的CNE-1細胞平均抑制率分別為0.00%、6.11%、15.00%、19.52%、28.53%和47.60%,CNE-1細胞平均抑制率隨著龍葵鮮藥水煎液濃度的增高而逐漸增加。各劑量組的平均抑制率分別與對照組比較,均有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05;各劑量組間平均抑制率相互比較,10mg/ml組與30mg/ml組間平均抑制率的差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),其余各劑量組間平均抑制率相互比較,差異均有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    在加入龍葵鮮藥水煎液72小時后,對照組5mg/ml、10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、80mg/ml組 的 CNE-1細 胞平均抑制率分別為 0.00%、20.87%、27.56%、37.46%、42.14%和59.09%,CNE-1細胞平均抑制率隨著龍葵鮮藥水煎液濃度的增高而逐漸增加。各劑量組的平均抑制率分別與對照組比較,均有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);各劑量組間平均抑制率相互比較,差異均有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    在 5mg/ml、10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、80mg/ml這5個濃度組,在不同時間點平均抑制率的由多到少均為:24h<48h<72h,分別比較同一濃度組在24h、48h、72h這3個時間點平均抑制率的差異,其中5mg/ml濃度組在24h和48h的抑制率差異之間無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),其余同一濃度組在不同時間點平均抑制率之間的差異均有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    2.2 龍葵鮮藥水煎液對CNE-1細胞凋亡和壞死的影響:

    流式細胞儀檢測分析不同濃度龍葵鮮藥水煎液與CNE-1細胞凋亡的相關(guān)性,CNE-1細胞凋亡率由大到小依次為80mg/ml >50mg/ml >30mg/ml >10mg/ml >5mg/ml >對照組,隨著龍葵鮮藥水煎液濃度的增加,CNE-1細胞凋亡率相應(yīng)增多(圖1、表2)。不同龍葵鮮藥水煎液濃度組與對照組比較,CNE-1細胞凋亡率的差異均有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    CNE-1細胞壞死率由大到小依次為50mg/ml>80mg/ml>10mg/ml >30mg/ml >5mg/ml >對照組(表2),不同龍葵鮮藥水煎液濃度組與對照組比較,CNE-1細胞壞死率的差異均有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    圖1 流式細胞儀檢測分析不同濃度龍葵鮮藥水煎液與CNE-1細胞凋亡的相關(guān)性

    表2 龍葵鮮藥水煎液對CNE-1細胞凋亡和壞死的影響

    4討論

    鼻咽癌為嶺南地區(qū)常見頭頸部惡性腫瘤。因鼻咽部位的特殊解剖特點,大部分患者就診是已屬晚期。局部晚期鼻咽癌治療上以放療為主,根據(jù)患者的具體情況應(yīng)用化療。盡管調(diào)強放療技術(shù)的得以開展的今天,使得鼻咽癌五年生存率也一直徘徊在70%-80%左右[1]。因此,在常規(guī)西醫(yī)治療的基礎(chǔ)上,如何進一步提高療效,研究發(fā)掘民間中藥方,具有重大的現(xiàn)實意義。

    嶺南地區(qū)為鼻咽癌的高發(fā)區(qū)之一。鮮龍葵湯為嶺南地區(qū)民間治療鼻咽癌的經(jīng)驗單方。中國古代哲學(xué)認為一物治一物。本課題通過研究嶺南地區(qū)民間經(jīng)驗單方鮮龍葵在體外對人鼻咽癌細胞增殖抑制和凋亡的影響,以期為今后研究鮮龍葵聯(lián)合西醫(yī)常規(guī)療法治療鼻咽癌提供參考。

    研究通過MTS法檢測龍葵鮮藥水煎液對鼻咽癌CNE-1細胞增殖的抑制作用,以及采用流式細胞檢測定量和定性地分析龍葵鮮藥水煎液對CNE-1細胞凋亡和壞死的影響。研究中發(fā)現(xiàn),各劑量組對CNE-1癌細胞作用24h、48h、72h均抑制CNE-1細胞增殖,而且抑制作用隨著用藥時間的增加而增強;5mg/ml、10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、80mg/ml濃度組在48h、72h時間點均表現(xiàn)為龍葵鮮藥水煎液濃度越高,抑制作用越強的趨勢,但在用藥24h時,藥物濃度的高低與抑制趨勢的無顯著關(guān)系。研究表明,不同濃度的藥物作用于CNE-1細胞后,CNE-1細胞增殖受到抑制,這一作用隨藥物濃度的變化而變化,且在一定范圍內(nèi)與用藥時間相關(guān),用藥時間越長,對CNE-1細胞的抑制越顯著。同時,隨著給藥劑量的增加,48h凋亡的CNE-1細胞也顯著增多。

    本研究證實了,在體外實驗中,龍葵鮮藥水煎液能誘導(dǎo)有效抑制CNE-1細胞的增殖和促進胞CNE-1凋亡,從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。本研究為龍葵鮮藥治療鼻咽癌提供一定的依據(jù)。

    [1] 馬駿.鼻咽癌治療的研究進展[J].中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2010,31(2):179-185.

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