檀香形成部位內(nèi)生真菌多樣性研究

孫思勝，張大為，孟志霞，郭順星

檀香形成部位內(nèi)生真菌多樣性研究

孫思勝，張大為，孟志霞，郭順星

目的 旨在考查檀香形成部位內(nèi)生真菌的定植情況，并探討檀香結(jié)香部位木材和正常生長(zhǎng)的健康木材之間內(nèi)生真菌的差異，揭示真菌誘導(dǎo)檀香結(jié)香的原因。

方法 采用組織塊分離法對(duì)檀香結(jié)香部位木材和正常生長(zhǎng)的健康木材進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)和統(tǒng)計(jì)分析，并采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)兩種方法對(duì)分離得到的真菌進(jìn)行鑒定。

結(jié)果 檀香結(jié)香部位木材內(nèi)生真菌定植率較高（92.5%），而正常木材內(nèi)生真菌定植率較低（27.5%）。分離率也是檀香結(jié)香部位木材較高（0.9），健康正常木材較低（0.25）。檀香正常生長(zhǎng)的健康白木材分離的內(nèi)生真菌只有 2種；結(jié)香部位木材分離得到 13種，隸屬于 4個(gè)屬，分別為擬莖點(diǎn)霉屬、鐮孢屬、曲霉屬和 Phaeoacremonium。在檀香結(jié)香部位分離的內(nèi)生真菌中，優(yōu)勢(shì)菌屬是鐮孢屬和擬莖點(diǎn)霉屬；在檀香健康木材分離的優(yōu)勢(shì)菌屬是擬莖點(diǎn)霉屬。

結(jié)論 檀香結(jié)香部位木材內(nèi)生真菌表現(xiàn)出了較高的種屬多樣性。檀香局部結(jié)香可能是由外界損傷和真菌的侵染誘導(dǎo)而形成的。

檀香； 內(nèi)生真菌； 結(jié)香部位木材； 健康正常木材

檀香（Santalum album Linn.）是檀香科（Santalaceae）檀香屬（Santalum）的一種常綠半寄生小喬木，原產(chǎn)于印度、印度尼西亞、澳大利亞、馬來(lái)西亞以及太平洋上的一些島嶼，我國(guó)于 1962年開始在廣東進(jìn)行引種栽培，經(jīng)過(guò)多年的種植推廣，目前已在廣東、云南、福建等南方各省成功引種栽培，但是較大規(guī)模種植的僅限于廣東地區(qū)。由于種植年限較短，迄今為止尚未形成商品藥材，因而國(guó)內(nèi)藥用的中藥檀香均為進(jìn)口商品。檀香在我國(guó)已有一千多年的使用歷史［1-7］，它是一種集藥用、香料、佛教用品、精細(xì)工藝雕刻材料于一體的重要經(jīng)濟(jì)樹種，素有“綠色黃金”之稱［1，3］。中藥檀香（Santali Albi Lignum）為檀香的芳香心材，供藥用需 30～40年，性溫味辛；歸脾、胃、心、肺經(jīng)；具有行氣溫中，開胃止痛之功效［8］。

檀香在自然狀態(tài)下需要 10年以上才開始形成有芳香氣味的心材（俗稱“結(jié)香”）［2］，并且不同種植地區(qū)，其結(jié)香的時(shí)間也不相同。人們?cè)谔聪愕姆N植生產(chǎn)實(shí)踐過(guò)程中，常發(fā)現(xiàn)某些檀香植株由于被一些微生物侵染后形成局部心材（結(jié)香）；此外人們?cè)谔聪銟湓耘噙^(guò)程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)機(jī)械損傷或因土壤排水不良引起爛根或在咖啡木蠹蛾（Zeuzera coffeae）蛀入樹干的蟲道，可以引起局部結(jié)香［9］。劉小金［10］利用四種外源真菌接種于未結(jié)香的幼齡檀香樹干，發(fā)現(xiàn)這四種真菌均可以誘導(dǎo)心材形成且均使心材 α-檀香醇含量升高。從這些現(xiàn)象分析，檀香的局部結(jié)香可能與微生物的侵染有關(guān)。

植物內(nèi)生真菌是指那些全部或部分生活史在健康植物的各種組織或細(xì)胞內(nèi)部度過(guò)的真菌，它們的存在不引起宿主感染明顯的癥狀，但是它們可以通過(guò)組織學(xué)方法或嚴(yán)格表面消毒的方法從植物組織中分離或從植物組織內(nèi)部擴(kuò)增出微生物 DNA的方法來(lái)證明其內(nèi)生性［11-13］。一些研究人員從植物中已分離獲得了許多可產(chǎn)生與宿主相似或相同的生物活性代謝產(chǎn)物的內(nèi)生真菌，這類真菌將成為尋找抗癌新藥及其他活性物質(zhì)的重要來(lái)源［14-15］。

本試驗(yàn)首次對(duì)檀香結(jié)香部位木材和正常生長(zhǎng)的健康白木材進(jìn)行了內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)及分子鑒定，分析檀香局部結(jié)香的形成與真菌的關(guān)系，獲得的菌株為未來(lái)真菌誘導(dǎo)檀香結(jié)香的研究以及其他生物活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)初步探明了內(nèi)生真菌在這兩種不同檀香木材中的分布差異。

1 材料與方法

1.1 材料

2011年 7月中旬，檀香結(jié)香部位木材和正常生長(zhǎng)的健康白木材均采集于廣東省揭陽(yáng)市綠世紀(jì)南藥種植有限公司的檀香林（東經(jīng) 115°59′，北緯23°19′），海拔 60 m。首先是尋找檀香局部結(jié)香的部位（10年生檀香樹的機(jī)械損傷位置），進(jìn)行樣品的采集；然后隨機(jī)選取 3株正常生長(zhǎng)的健康 7～8年生檀香，對(duì)其莖干進(jìn)行樣品的采集；將樣品置于低溫（4℃）的樣品盒中，在 24 h之內(nèi)進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離。檀香局部結(jié)香木材和正常生長(zhǎng)的莖干木材見圖1。

圖1 檀香樹（A）及檀香局部結(jié)香木材（B）和正常生長(zhǎng)的莖干木材（C）Figure 1 The tree of Santalum album（A），sandalwood（B）and normal white healthy wood（C）

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備 土豆培養(yǎng)基（PDA）配方：將去皮土豆 200 g、葡萄糖 20 g和瓊脂 12 g用去離子水定容至 1000 ml，pH自然；122℃ 滅菌22 min。孟加拉紅培養(yǎng)基配方：將孟加拉紅 35 g用去離子水定容至 1000 ml，pH自然。122℃ 滅菌22 min。

1.2.2 檀香內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng) 采用組織塊分離法［16］。將采集到的檀香結(jié)香部位木材和正常木材在自來(lái)水下沖洗干凈，晾干后分別切成 0.5 cm× 0.5 cm×0.5 cm大小的組織塊，在無(wú)菌條件下，浸入 75%乙醇中漂洗 30～60 s，然后再放入 3%的次氯酸溶液中浸泡 8～12 min，無(wú)菌水沖洗 4次，再用無(wú)菌濾紙吸干水分。然后在無(wú)菌條件下，將表面消毒后的樣品切成 0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm 大小的組織塊，從檀香結(jié)香部位木材和正常木材中各隨機(jī)選取 40個(gè)組織塊用于檀香莖內(nèi)生真菌的分離。將組織塊置于改良的 PDA培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基上，每個(gè)平皿接種 4個(gè)組織塊。將上述樣品置于 25℃ 恒溫培養(yǎng) 2個(gè)月，定期觀察內(nèi)生真菌菌落形成情況，當(dāng)絲狀真菌菌落直徑長(zhǎng)至 1 cm左右時(shí)，即可挑取其菌落邊緣部位，接種到新的PDA平板上，反復(fù)接種至單菌落時(shí)，根據(jù)菌株的菌落特征，進(jìn)行菌株合并，得到菌落特性不同的真菌菌株。菌株用 PDA試管斜面保藏和 10%甘油管妥善保藏；其中 PDA試管放 4℃ 冰箱保藏，10% 甘油管放于 –80℃ 超低溫冰箱保存。

1.2.3 內(nèi)生真菌的鑒定 對(duì)分離的真菌進(jìn)行編號(hào)之后，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)兩種方法對(duì)它們進(jìn)行鑒定；先根據(jù)形態(tài)和顯微特征以及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)對(duì)能夠產(chǎn)孢的菌株進(jìn)行鑒定；再對(duì)不能產(chǎn)孢的菌株初步歸為不產(chǎn)孢類群，然后利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定。

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)特征鑒定：將已經(jīng)純化好的真菌接種于 PDA平板上，觀察記錄菌落形態(tài)，生長(zhǎng)特性，結(jié)合顯微結(jié)構(gòu)中的孢子形態(tài)、大小和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等對(duì)其進(jìn)行經(jīng)典的形態(tài)鑒定［17-19］，同時(shí)，通過(guò)對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)的收集和查閱，最終鑒定出其種屬。

1.2.3.2 分子生物學(xué)手段鑒定：將分離獲得的真菌進(jìn)行純培養(yǎng)，提取核糖體 rDNA，對(duì)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1-5.8S-ITS2）進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增后獲得的DNA片段中 500～750 bp的序列與 GenBank （http://ncbi.nim.nih.gov）中的數(shù)據(jù)對(duì)比，確定其種屬類別。

主要操作步驟：

⑴將用于分子鑒定的真菌接種到 PDA培養(yǎng)基上，25℃ 恒溫暗培養(yǎng) 1～3周后待真菌菌落的直徑6 cm左右，就可以滿足提取 DNA所需要的1 g左右重量的菌絲。

真菌核糖體 DNA參照真菌 DNA提取試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行提取。

⑵PCR擴(kuò)增 DNA提取后，通過(guò)設(shè)計(jì)的引物對(duì)特定區(qū)段進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，從而使目的片段的濃度得以提高。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在 Eppendorf Mastercycler梯度 PCR儀上進(jìn)行。本研究所用的引物是真菌通用引物 ITS1和 ITS4，具體序列、反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件如下：ITS1：5'TCCGTAGGT GAACCTGCGG 3'；ITS4：5'TCCTCCGCTTATTGA TATGC 3'。25 μl PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：Mix 12.5 μl，ddH2O 9.5 μl，引物各 1 μl，模板 1 μl，總體積 25 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性 3 min；94℃ 變性30 s；55℃ 退火 30 s；72℃ 延伸 2 min；32個(gè)循環(huán)，之后再 72℃ 延伸 5 min，4℃ 保存。

DNA序列由蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，正反引物分別是 ITS1和 ITS4，得到 ITS（ITS1-5.8S-ITS4）序列，提交到 GenBank，得到序列號(hào) KC981090-KC981109。運(yùn)用 BLASTN程序在 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中進(jìn)行相似性查詢，獲得與其同源性最高的序列信息，進(jìn)而獲得試驗(yàn)菌株的鑒定信息。但是，在 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇同源性序列時(shí)，需要注意的是，目前GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中不少序列的注釋是不正確的；一般而言，已出版在權(quán)威專業(yè)雜志如 Mycotaxon、Studies in Mycology、Mycological Progress、Fungal Diversity和 Fungal Biology等，或者國(guó)際上一些比較著名的菌種保藏機(jī)構(gòu)（CBS、ATCC、AFTOL等）的序列可信度較高。序列比對(duì)后，如果目標(biāo)序列和參考序列有 95%以上的同源性，就暫定到參考序列所在的屬，如果 ≥99% 的相似性就暫定到種［20］。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

內(nèi)生真菌在每種植物組織中的豐度，采用定植率（colonization rate，CR）、分離率（isolation rate，IR）和相對(duì)頻率（relative frequency，RF）等指標(biāo)［21-22］運(yùn)用 Microsoft Excel 2003和 SASS 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

定植率能夠反映出不同植物或同一植物的不同器官受內(nèi)生真菌的侵染程度，表示的是百分?jǐn)?shù)；分離率可以衡量植物組織中內(nèi)生真菌的豐富程度和每個(gè)組織塊受多重侵染的頻率，不表示百分?jǐn)?shù)。相對(duì)頻率是指樣本中分離到的某種內(nèi)生真菌的菌株數(shù)占分離到的總菌株數(shù)的百分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果

2.1 檀香結(jié)香部位木材和正常木材內(nèi)生真菌的定植率和分離率

從檀香植物結(jié)香部位木材和正常木材的 80個(gè)表面消毒的組織塊中共分離獲得 46株內(nèi)生真菌菌株；其中從檀香結(jié)香部位分離獲得 36株，正常木材分離獲得 10株。檀香結(jié)香部位木材和正常木材內(nèi)生真菌的定植率和分離率見表 1。

由表 1可以看出，檀香結(jié)香部位木材內(nèi)生真菌定植率較高（92.5%），而正常木材內(nèi)生真菌定植率較低（27.5%）。分離率也是檀香結(jié)香部位木材較高（0.90），檀香健康正常木材較低（0.25）?？梢?，檀香結(jié)香部位的木材易于受到真菌的侵染，而健康的正常樹干木材不易受到真菌的侵染而定植。

2.2 正常莖干木材和結(jié)香木材中內(nèi)生真菌的組成和分布

通過(guò)對(duì) 2011年 7月份采集的檀香健康生長(zhǎng)的正常莖干木材和結(jié)香木材內(nèi)生真菌進(jìn)行嚴(yán)格的無(wú)菌分離培養(yǎng)，共得到 46株真菌菌株。通過(guò)形態(tài)鑒定和分子生物學(xué)手段分別對(duì)這些真菌進(jìn)行了鑒定，兩種方法的結(jié)果大部分是一致的，少數(shù)不一致的真菌，經(jīng)過(guò)查閱文獻(xiàn)［17-19］，進(jìn)一步分析鑒定，最終確定它們的屬或種；最后再對(duì)相同菌株進(jìn)行合并，共得到 13種真菌。從表 2可以看出，檀香正常生長(zhǎng)的健康莖干白木材中分離得到的內(nèi)生真菌只有 2種，分別隸屬于擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）和鐮孢屬（Fusarium），且內(nèi)生真菌分離率較低；結(jié)香部位木材分離得到 13種，隸屬于 4個(gè)屬，分別為擬莖點(diǎn)霉屬、鐮孢屬、曲霉屬（Aspergillus）、Phaeoacremonium；檀香結(jié)香部位木材內(nèi)生真菌表現(xiàn)出了較高的種屬多樣性。在檀香結(jié)香部位木材分離的內(nèi)生真菌中，優(yōu)勢(shì)菌屬是鐮孢屬和擬莖點(diǎn)霉屬；而在檀香正常生長(zhǎng)的健康白木材分離的內(nèi)生真菌中，優(yōu)勢(shì)菌屬是擬莖點(diǎn)霉屬。

表1 檀香結(jié)香部位木材和正常木材內(nèi)生真菌的定植率和分離率Table 1 Endophyte colonization rate and isolation rate in the two types wood

表2 檀香正常木材和結(jié)香部位木材內(nèi)生真菌的鑒定結(jié)果和分布頻率Table 2 Identification and distribution frequency of endophytic fungi in the two types wood of Santalum album

3 討論

從檀香結(jié)香部位木材和正常生長(zhǎng)的健康莖干白木材樣品中總共分離到 46株真菌，其中從檀香結(jié)香部位分離獲得 36株，正常木材分離獲得10株。在同等條件下，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的合并程序和形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)鑒定，最終確定從正常木材分離的 10株真菌分屬于擬莖點(diǎn)霉屬和鐮孢屬；從結(jié)香部位木材分離的 36株真菌分布于 4個(gè)屬，且內(nèi)生真菌定植率和分布率較高；此外，這兩種類型的木材的內(nèi)生真菌共有菌屬是擬莖點(diǎn)霉屬和鐮孢屬；這說(shuō)明此兩屬內(nèi)生真菌在檀香植物莖干部位中分布較廣。檀香結(jié)香部位木材分布真菌較多，可能是由于外界真菌的入侵并定植導(dǎo)致的；而正常生長(zhǎng)的健康莖干木材由于外面有樹皮保護(hù)和自身木質(zhì)較好，樹干硬度較大，導(dǎo)致真菌定植較少。根據(jù)內(nèi)生真菌的相關(guān)理論［11-13］，這里的真菌是不是內(nèi)生真菌還不能下結(jié)論。因?yàn)樘聪憬Y(jié)香部位一般都是機(jī)械

損傷或蟲咬的部位，這里的真菌很可能是來(lái)源于檀香樹干受傷以后，外界環(huán)境中的真菌通過(guò)傷口入侵并定植；也可能是由于檀香莖干內(nèi)生真菌由于外界環(huán)境的改變（濕度加大等）而導(dǎo)致的迅速生長(zhǎng)繁殖，也可能兩種現(xiàn)象同時(shí)存在。根據(jù)目前這兩種類型的木材分離得到的內(nèi)生真菌情況來(lái)看，由于內(nèi)生真菌的種屬專一性和環(huán)境差異性，應(yīng)該是兩種情況都存在。總體看來(lái)，檀香健康莖干部位的內(nèi)生真菌與環(huán)境中真菌通過(guò)傷口侵染莖干木材，然后形成特殊的真菌群落，進(jìn)而誘導(dǎo)檀香局部心材的形成（結(jié)香），因而本研究為內(nèi)生真菌誘導(dǎo)檀香木形成檀香奠定了一定的基礎(chǔ)。

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Methods Tissue block method was used to isolate and statistically analyze the endophytic fungi，which were then identified by morphology and molecular biology methods.

Results The colonization rate of endophytic fungi in sandalwood（92.5%）was higher than that in normal white healthy wood （27.5%）.Two fungal strains were recovered from normal white healthy wood，which belonged to two genus respectively.13 fungal stains were isolated from sandalwood，which belonged to four genus，Phomopsis，F(xiàn)usarium，Aspergillus and Phaeoacremonium.

Conclusion There are diverse endophytic fungi in sandalwood.The most frequently isolated genera are Fusarium and Phomopsisin the sandalwood.While，the most frequently isolated genera is Phomopsis in the normal white healthy wood.External damaging and fungi inducing maybe due to portion sandalwood formation.

Diversity of Endophytic Fungi in sandalwood forming section of Santalum album

SUN Si-sheng，ZHANG Da-wei，MENG Zhi-xia，GUO Shun-xing

Objective To investigate endophytic fungi colonization in sandalwood of Santalum album and the differences in endophytic fungi between sandalwood and normal white healthy wood，which may reveal the cause of sandalwood formation induced by fungi.

SANTALUMALBUM；Endophytic Fungi；Sandalwood；Normal white healthy wood

GUO Shun-xing，Email:sxguo1986@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.02.005

國(guó)家自然科學(xué)基金（31170016）

100193北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所生物技術(shù)中心（孫思勝、張大為、孟志霞、郭順星）；461000河南省許昌市，許昌學(xué)院食品與生物工程學(xué)院/河南省博士后研發(fā)基地（孫思勝）

郭順星，Email：sxguo1986@163.com

2014-09-30

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2015，10（2）:119-124

Author Affiliations:Biotechnology Research Center，Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College，Beijing 100193，China（SUN Si-sheng，ZHANG Da-wei，MENG Zhi-xia，GUO Shun-xing）；Food and Bioengineering College，Xuchang University/Henan Postdoctoral Research Base，Xuchang 461000，China （SUN Si-sheng）

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol，2015，10（2）:119-124