慢性乙型肝炎抗病毒治療對乙型肝炎病毒X蛋白表達的影響

錢賢峰，吳昌平，徐 君，鄭中偉，葛國洪，邵江波

（1.蘇州大學附屬第三醫(yī)院腫瘤生物治療中心，江蘇常州213003；2.常州市第三人民醫(yī)院消化內科，江蘇常州213001；3.鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院感染科，江蘇鎮(zhèn)江212005）

慢性乙型肝炎抗病毒治療對乙型肝炎病毒X蛋白表達的影響

錢賢峰1，吳昌平1，徐 君2，鄭中偉2，葛國洪3，邵江波3

（1.蘇州大學附屬第三醫(yī)院腫瘤生物治療中心，江蘇常州213003；2.常州市第三人民醫(yī)院消化內科，江蘇常州213001；3.鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院感染科，江蘇鎮(zhèn)江212005）

目的：觀察慢性乙型肝炎抗病毒治療對乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx）表達的影響。方法：選取96例慢性乙肝初治患者，其中HBeAg陽性56例，HBeAg陰性40例。兩組患者組內平均分為聚乙二醇干擾素α-2a治療組（干擾素組）和恩替卡韋治療組。聚乙二醇干擾素（180 μg，每周1次）療程48周，恩替卡韋（0.5 mg，1次/d）療程96周。應用蛋白質印跡法檢測治療前和治療后48周、96周3個時點各組病例肝組織內HBx的表達。結果：所有患者治療前肝組織HBx均為陽性表達。治療后48周，HBeAg陽性干擾素組、恩替卡韋組，以及HBeAg陰性干擾素組、恩替卡韋組HBx陰性表達率別為73.08％（19/26）、40.74％（11/27）、42.11％（8/ 19）、45.00％（9/20）。治療后各組HBx陰性表達率均明顯高于治療前（P均為0.00）。HBeAg陽性干擾素組HBx陰性表達率明顯高于其他3組（P均＜0.05）。恩替卡韋治療96周時，HBeAg陽性組和HBeAg陰性組HBx陰性表達率無明顯差異［48.15％（13/27）、55.00％（11/20）］，和48周時比較也無明顯差異（P均＞0.05）。結論：干擾素用于HBeAg陽性的慢性乙肝患者，其抑制X蛋白表達的效果明顯優(yōu)于恩替卡韋。

慢性乙型肝炎；乙型肝炎病毒X蛋白；恩替卡韋；干擾素

肝細胞癌是常見的惡性腫瘤，我國每年約有38.3萬人死于肝癌，約占全球肝癌死亡病例數(shù)51％，發(fā)生率和病死率均位居全球各國肝癌首位［1］。我國原發(fā)性肝癌的首要病因是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的慢性感染。在HBV持續(xù)感染過程中，病毒的大量復制及其引發(fā)的慢性炎癥促進了肝細胞癌的發(fā)生和發(fā)展［2］。導致HBV相關性肝癌發(fā)生的病毒學因素有HBV DNA水平、HBeAg陽性持續(xù)時間、HBV病毒基因型、C區(qū)啟動子變異、X基因變異等，因此通過抗病毒治療降低HBV復制水平是防治乙肝相關性肝癌的關鍵［3-4］。

HBV主要存在4個編碼區(qū)，其中HBx基因編碼X蛋白。HBx是一種重要的多功能調節(jié)蛋白，在肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用［5］。由于X蛋白并不釋放至肝細胞外，因此無法利用血清學實驗檢測，只能應用免疫組化或者蛋白質印跡法對肝組織活檢標本進行檢測。這就需要患者接受創(chuàng)傷性操作。目前慢性乙型肝炎患者抗病毒治療藥物主要分為干擾素和核苷類似物（nuc1eotide ana1ogues，NAs）兩類。臨床研究熱點關注于HBV DNA抑制效率、HBsAg和HBeAg的血清學轉換、NAs耐藥處理等問題。受限于HBx檢測方法，有關抗病毒治療對于HBx表達影響的研究較少。為此，本研究檢測了干擾素和NAs抗病毒治療后患者肝臟活檢組織HBx的表達，探討抗病毒治療在HBV相關性肝癌防治方面新的作用機制。

1 對象與方法

1.1 病例

隨機選取2012年1月至2013年6月常州市第三人民醫(yī)院、鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院收治的部分慢性乙肝初治患者96例，年齡23～51歲，診斷符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》標準。同時排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒感染，排除酒精性肝病、自身免疫性肝病、惡性腫瘤、糖尿病、精神疾病患者，排除妊娠、哺乳期患者，排除存在恩替卡韋耐藥基因患者。所有患者治療前均進行醫(yī)學倫理學評估，并告知抗病毒治療可能發(fā)生的不良反應、病毒耐藥可能，簽署知情同意書。

1.2 病例分組

依據(jù)2010年《慢性乙型肝炎防治指南》標準，將96例慢性乙型肝炎患者分為2組。HBeAg陽性組56例，年齡23～48歲，平均（39.6±7.28）歲；HBeAg陰性組40例，年齡25～51歲，平均（42.5± 8.85）歲。兩組患者年齡間差異無統(tǒng)計學意義。兩組患者各自組內平均分為聚乙二醇干擾素（pegy1ated-interferon a1fa-2a，Peg-IFNα-2a）治療組（干擾素組）和恩替卡韋治療組（恩替卡韋組）。

1.3 抗病毒方案

Peg-IFNα-2a（上海羅氏制藥公司）180 μg，每周皮下注射1次，療程48周。恩替卡韋（中美上海施貴寶制藥有限公司）0.5 mg，1次/d，空腹口服，療程96周。治療期間有任何因素導致中途停藥或者換藥的患者，判定為樣本脫落。

1.4 觀察項目

各組患者分別于治療前以及治療后48周、96周進行肝臟穿刺活檢，以蛋白質印跡法檢測肝組織內HBx的表達。

1.5 主要試劑和儀器

兔抗人HBx單克隆抗體、β-肌動蛋白抗體均為美國Santa Cruz公司產品，辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔二抗為美國Ce11 Signa1ing Tech公司產品。KR25i高速離心機（美國Thermo公司），Bio-Rad電泳儀、轉膜儀、凝膠成像儀（北京賽百奧科技有限公司）。

1.6 實驗方法

1.6.1 肝組織樣本處理 肝臟穿刺后肝組織樣本用NaC1-EDTA-Na2溶液洗去血液，再用預冷PBS溶液洗滌2次，加入含1％PMSF細胞裂解液，超聲破碎細胞，15 000 r/min離心5 min，取上清液-70℃保存。

1.6.2 蛋白質印跡法檢測HBx蛋白的表達 樣本檢測前，將十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖溶液和待檢蛋白按體積4∶1混勻，100℃煮沸5 min使蛋白變性。取等量蛋白上樣，15％SDS-PAGE分離蛋白并轉膜，5％脫脂牛奶室溫封膜80 min，加入HBx一抗（1∶1 000），4℃緩搖孵育過夜；次日換液洗膜加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫緩搖2 h，洗膜后采用電化學發(fā)光法在凝膠成像儀顯像，PDQuest軟件進行圖像分析（β-肌動蛋白為內參蛋白）。分別計算各樣本蛋白和β-肌動蛋白積分光密度比值，比值＞1.0判定為HBx蛋白表達陽性。

1.7 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件，計量資料采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 病例脫落

因藥物不良反應和治療依從性不良導致的樣本脫落病例數(shù)：HBeAg陽性Peg-IFNα-2a治療組2例，HBeAg陽性恩替卡韋治療組1例，HBeAg陰性Peg-IFNα-2a治療組1例，HBeAg陰性恩替卡韋治療組無脫落。4例脫落事件均在治療48周內發(fā)生。

2.2 治療48周各組HBx的表達

抗病毒治療前所有慢性乙肝患者HBx均為陽性表達。48周治療結束時，各組患者HBx陰性表達率均比治療前明顯增高（P均為0.00）。干擾素用于HBeAg陽性病例治療時HBx陰性表達率（19/ 26）明顯高于恩替卡韋治療的病例（11/27），也明顯高于HBeAg陰性干擾素組（8/19）。而HBeAg陰性恩替卡韋組（9/20）和同組的Peg-IFNα-2a治療組以及HBeAg陽性恩替卡韋治療組的HBx陰性表達率無明顯差異（P＞0.05）。見表1。結果顯示，干擾素用于HBeAg陽性的慢性乙肝治療，抑制HBx表達的效果明顯優(yōu)于恩替卡韋。

表1 抗病毒治療48周HBx陰性表達的病例分布

2.3 恩替卡韋治療96周HBx的表達

應用恩替卡韋治療的患者有47例維持治療至96周。其中，27例HBeAg陽性患者中，HBx陰性表達率為48.15％（13例）；20例HBeAg陰性患者中，11例HBx為陰性表達（55.00％）。HBeAg陽性組與陰性組HBx陰性表達率間的差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.216，P＞0.05）。而且，HBeAg陽性組與治療48周時HBx陰性表達率比較，也無明顯差異（χ2=0.300，P＞0.05）；HBeAg陰性組與治療48周時的HBx陰性表達率間的差異亦無統(tǒng)計學意義（χ2=0.400，P＞0.05）。

3 討論

HBx主要通過與核轉錄調節(jié)子的相互作用或激活信號傳導途徑，促進細胞周期進程、調節(jié)細胞凋亡、抑制腫瘤抑制基因的表達，從而促進肝癌的發(fā)生、發(fā)展［6-8］。高HBV DNA載量是乙肝病毒慢性感染者發(fā)生肝硬化、肝細胞癌的重要危險因素［9-10］，HBx C-端反式激活作用區(qū)域轉錄反式激活作用可能對增強HBV的復制能力至關重要［11］。Keas1er等［12-14］的體外實驗也證明HBx對HBV高復制水平是必需的。甲基化是細胞癌變過程中基因轉錄發(fā)生改變的最可能機制之一［15］。湯紹輝等［16］發(fā)現(xiàn)，HBx可以通過誘導P3啟動子低甲基化促進肝癌胰島素樣生長因子-Ⅱ（IGF-Ⅱ）表達。Tong等［17］和Zheng等［18］也分別發(fā)現(xiàn)多個由HBx激活的啟動子呈低甲基化的基因。以上結果均表明，HBx表達水平在HBV相關性肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程中具有極其重要的作用，因此降低HBx表達水平可以有效預防肝癌的發(fā)生。本研究所有患者在抗病毒治療前HBx均為陽性表達，經過干擾素和NAs治療后HBx的表達明顯下降，說明抗病毒治療能有效降低肝細胞癌的發(fā)生。

干擾素和NAs具有不同的抗病毒機制。干擾素具有免疫調節(jié)和抗病毒的雙重作用，通過增強HBV特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL）功能、經干擾素信號通路產生多種抗病毒蛋白等多個環(huán)節(jié)作用于HBV復制、轉錄等重要生物學過程，達到抗病毒及增強機體免疫功能的效果。NAs則主要通過競爭性抑制HBV DNA多聚酶的關鍵位點，直接抑制病毒復制，進而改善肝組織炎性反應。HBeAg陽性慢性乙肝患者和HBeAg陰性患者有諸多不同的臨床特點。HBeAg陰性慢性乙肝患者HBV變異更多發(fā)生在前C區(qū)、基本核心啟動子區(qū)（BCP），雖不表達或低表達HBeAg，但病毒仍能復制和裝配，導致肝組織產生活動性炎癥，自發(fā)緩解罕見，病變反復活動更易進展為肝硬化，也是肝細胞癌的高發(fā)人群，因此抗病毒療程更長，且應答率低［19-20］。本研究結果顯示，在相同療程下選擇Peg-IFNα-2a治療的HBeAg陽性慢性乙肝患者HBx陰性表達率明顯高于HBeAg陰性患者，說明在HBx陰轉應答方面，HBeAg陽性患者優(yōu)于HBeAg陰性患者，符合以上觀點。而在同樣療程下，選擇恩替卡韋治療無論48周還是96周，HBeAg陽性患者和陰性患者在HBx陰性表達率方面均未見明顯差異。這可能與NAs的抗病毒機制有關。由于NAs不具有免疫調節(jié)作用，不能提高細胞免疫水平，抑制HBx表達的作用弱于干擾素，這和以往干擾素抗病毒治療對于HBeAg血清學轉換率和HBsAg陰轉率高于NAs的研究結果類似［21-24］。繼續(xù)延長恩替卡韋療程，HBeAg陽性患者和HBeAg陰性患者HBx陰性表達率是否出現(xiàn)差異，我們將繼續(xù)觀察。

本研究顯示，HBeAg陽性慢性乙肝患者抗病毒治療選擇Peg-IFNα-2a較恩替卡韋能獲得更高的HBx陰性表達率，這仍然和干擾素獨特的免疫調節(jié)作用密切相關。而在HBeAg陰性慢性乙肝患者中，兩種藥物對HBx的陰轉率無明顯差異，我們推斷和HBx基因普遍存在變異以及HBV基因型有關。越來越多的研究表明［25-27］，聯(lián)合應用抗病毒藥物治療慢性乙型肝炎，能明顯提高HBV DNA抑制率、HBeAg血清轉換率和HBsAg轉陰率，但能否提高HBx陰性表達率尚需進一步研究。

綜上，本研究結果顯示，抗病毒治療能有效抑制HBx的表達，對于防止肝癌的發(fā)生起到重要作用。HBeAg陽性慢性乙肝患者首選Peg-IFNα-2a抗病毒治療在抑制HBx表達方面優(yōu)于恩替卡韋。屬于肝癌高危人群的慢性乙肝患者如能夠接受肝臟穿刺活檢，在抗病毒過程中監(jiān)測HBx表達水平對預測肝癌的發(fā)生有臨床意義。

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Effect of antiviral treatment for chronic hepatitis B patients on hepatitis B virus X protein expression

QIAN Xian-feng1，WU Chang-ping1，XU Jun2，ZHENG Zhong-wei2，GE Guo-hong3，SHA0 Jiang-bo3
（1.Department of Tumor Bio1ogica1 Treatment，the Third Affi1iated Hospita1 of Soochow University，Changzhou Jiangsu 213003；2.Department of Digestive Diseases，the Third Peop1e′s Hospita1 of Changzhou，Changzhou Jiangsu 213001；3.Department of Infectious Diseases，the Third Peop1e′s Hospita1 of Zhenjiang，Zhenjiang Jiangsu 212005，China）

Objective：To investigate the variation of hepatitis B virus X（HBx）protein expression during antivira1 treatment for chronic hepatitis B（CHB）patients.Methods：Fifty-six na?ve CHB patients with HBeAg-positive and 40 na?ve CHB patients with HBeAg-negative were divided random1y into the pegy1ated-interferon（Peg-IFN）therapy group receiving Peg-IFNα-2a（180 μg/week）for 48 weeks and entecavir therapy group receiving entecavir（0.5 mg/d）for 96 weeks.A11 patients were tested hepatic tissue for the HBx protein expression 1eve1s by Western-b1otting method at treatment weeks 0，48，and 96. Results：At week 0，The HBx protein expression of a11 patients were positive.At week 48，the rates of the HBx protein negative expression in Peg-IFNα-2a therapy group and entecavir therapy group with HBeAg-positive，and in Peg-IFNα-2a therapy group and entecavir therapy group with HBeAg-negative，were 73.08％（19/26），40.74％（11/27），42.11％（8/19），45.00％（9/20），and were significant1y different from at week 0（a11 P va1ues were 0.00）；then，the rate in Peg-IFNα-2a therapy group was significant difference from others three groups（a11 P va1ues were 1ess than 0.05）.At week 96，the rates of the HBx protein negative expression had no significant difference in entecavir therapy group with HBeAg-positive and with HBeAg-negative［48.15％（13/27），55.00％（11/20）］；and compared at week 48，the resu1ts were simi1ar（A11 P va1ues were greater than 0.05）.Conclusion：Compared to entecavir，Peg-IFN was more potent to suppress the HBx protein expression.

chronic hepatitis B；hepatitis B virus X protein；entecavir；interferon

R512.62

A

1671-7783（2015）06-0498-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y150215

2015-09-25 ［編輯］陳海林

江蘇省自然科學基金資助項目（BK2006083）

錢賢峰（1979—），女，江蘇宜興人，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事肝硬化、肝癌臨床診療研究；吳昌平（通訊作者），主任醫(yī)師，碩士生導師，E-mai1：wcpjjt@163.com