子癇前期外周血中間型單核細(xì)胞HLA-DR的表達(dá)及其臨床意義

呂連崢，藺 昕，錢(qián) 雷，徐衛(wèi)平，張國(guó)英

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京210014；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京210006；3.濱?？h人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鹽城224500）

子癇前期外周血中間型單核細(xì)胞HLA-DR的表達(dá)及其臨床意義

呂連崢1，藺 昕2，錢(qián) 雷3，徐衛(wèi)平1，張國(guó)英1

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京210014；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京210006；3.濱?？h人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鹽城224500）

目的：通過(guò)檢測(cè)子癇前期患者外周血中間型單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)并分析其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，探討中間型單核細(xì)胞HLA-DR在子癇前期疾病過(guò)程中的作用。方法：采集22例子癇前期患者（子癇前期組）和23例健康孕婦（對(duì)照組）肘前靜脈血4 mL，肝素抗凝。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中間型單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)和Th17細(xì)胞陽(yáng)性率；液相芯片檢測(cè)血清中腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-17和IL-10濃度；分析子癇前期患者中間型單核細(xì)胞HLA-DR陽(yáng)性頻率與血清細(xì)胞因子濃度、Th17細(xì)胞陽(yáng)性率的相關(guān)性。結(jié)果：子癇前期組中間型單核細(xì)胞HLA-DR陽(yáng)性細(xì)胞率為（29.4±8.4）％，比對(duì)照組［（20.1±3.8）％］明顯增高（P＜0.01）；平均熒光強(qiáng)度（MFI）為31.5±5.9，亦明顯高于對(duì)照組（26.4±4.3，P＜0.01）。與對(duì)照組比較，子癇前期患者血清中TNF-α、IL-6和IL-17濃度顯著升高，IL-10濃度明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；子癇前期患者中間型單核細(xì)胞HLA-DR陽(yáng)性細(xì)胞率與Th17細(xì)胞陽(yáng)性率、血清IL-17濃度均呈正相關(guān)（r=0.468、r=0.473，P＜0.05）。結(jié)論：子癇前期患者外周血中間型單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)明顯增加，參與子癇前期的疾病過(guò)程。

子癇前期；中間型單核細(xì)胞；HLA-DR；Th17細(xì)胞

子癇前期是一種妊娠期特有的系統(tǒng)性疾病，患者出現(xiàn)高血壓和蛋白尿?yàn)橹饕卣鞯亩嗥鞴贀p害，發(fā)病率為3％～14％［1］。目前認(rèn)為，子癇前期發(fā)病的病理機(jī)制是胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入性低下，導(dǎo)致子宮螺旋動(dòng)脈重鑄不良，引起胎盤(pán)缺氧、母體血管內(nèi)皮受損和母體系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)［2-3］。在正常妊娠過(guò)程中，單核巨噬細(xì)胞分布在母體蛻膜組織和胎盤(pán)滋養(yǎng)層共同構(gòu)成的母-胎界面，通過(guò)與滋養(yǎng)層細(xì)胞和蛻膜調(diào)節(jié)性T細(xì)胞間的相互作用，建立母胎耐受，參與胚胎的植入和胎盤(pán)的發(fā)育過(guò)程。在子癇前期疾病過(guò)程中，單核細(xì)胞異?；罨?，過(guò)度募集、浸潤(rùn)到蛻膜組織，阻礙滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化；并通過(guò)參與對(duì)病原微生物的吞噬、抗原提呈、T細(xì)胞功能調(diào)節(jié)等過(guò)程發(fā)揮致病作用［4］。但單核細(xì)胞活化的機(jī)制尚不完全清楚。

近年來(lái)的研究顯示，人類單核細(xì)胞可分為3個(gè)亞群：經(jīng)典型（CD14highCD16-）、中間型（CD14highCD16+）和非經(jīng)典型（CD141owCD16++），不同的亞群具有不同的表型和功能［5］。中間型單核細(xì)胞高表達(dá)編碼MHC-Ⅱ類分子相關(guān)基因（如HLA-DR和 CD74），在T細(xì)胞活化、增殖及抗原提呈過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并通過(guò)表達(dá)促血管生成的相關(guān)分子，發(fā)揮促血管生成的特性［6］。本研究通過(guò)檢測(cè)子癇前期患者外周血中間型單核細(xì)胞HLA-DR的表達(dá)并分析其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，探討中間型單核細(xì)胞HLA-DR在子癇前期疾病過(guò)程中的作用，以尋找控制母體炎癥反應(yīng)的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象

選擇2014年9月至2015年3月在南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院就診的住院患者45例，其中健康孕婦23例（對(duì)照組），診斷為子癇前期［5］的孕婦22例（子癇前期組）。兩組孕婦均無(wú)自身免疫性疾病和近期感染史，均無(wú)破膜、宮縮，無(wú)雙胎。兩組間年齡、孕次和孕周的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本次研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫研2014-03），參加者知情同意。采集肘前靜脈外周血4 mL，肝素抗凝，在24 h內(nèi)完成檢測(cè)。兩組患者的臨床資料見(jiàn)表1。

表1 兩組臨床資料比較

1.2 儀器和試劑

異硫氰酸熒光素（FITC）鼠抗人-CD14、別藻藍(lán)蛋白（APC ）-鼠抗人HLA-DR單克隆抗體、多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物（PerCP）-Cy5.5-鼠抗人-CD4、PerCP-Cy5.5-鼠抗人-CD16、PE-鼠抗人IL-17及同型對(duì)照、莫能霉素、紅細(xì)胞裂解液、破膜/固定劑、Perm/Wash緩沖液以及FACS Canto流式細(xì)胞儀均為BD公司產(chǎn)品。C反應(yīng)蛋白、尿微量白蛋白采用BNProSpec特定蛋白分析儀及配套試劑檢測(cè)。佛波酯和離子霉素為Sigma公司產(chǎn)品。液相芯片檢測(cè)儀為美國(guó)Luminex公司產(chǎn)品，血清細(xì)胞因子腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-12P70、IL-10、IL-17檢測(cè)試劑均為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中間型單核細(xì)胞HLA-DR的表達(dá) 每100 μL外周血加入10 μL FITC鼠抗人-CD14單克隆抗體、10 μL PerCPCy5.5-鼠抗人-CD16和10 μL APC-鼠抗人HLA-DR及同型對(duì)照，室溫避光孵育30 min，紅細(xì)胞裂解液破壞紅細(xì)胞后，PBS洗滌，500×g離心6 min，棄上清，400 μL PBS重懸細(xì)胞。采用FACS Canto流式細(xì)胞儀，以前向散射光（FS）和側(cè)向散射光（SS）區(qū)別單核細(xì)胞，以CD14highCD16+單核細(xì)胞設(shè)門(mén)，檢測(cè)中間型單核細(xì)胞HLA-DR平均熒光強(qiáng)度（mean f1uorescence intension，MFI）和陽(yáng)性細(xì)胞頻率。

1.3.2 液相芯片檢測(cè)血清各細(xì)胞因子濃度 外周血2 mL經(jīng)500×g離心5 min，收集血漿，立即儲(chǔ)存在-80℃冰箱。按細(xì)胞因子試劑說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清TNF-α、IL-6、IL-12P70、IL-17和IL-10濃度，Luminex 200液相芯片平臺(tái)讀取各細(xì)胞因子濃度，每個(gè)標(biāo)本測(cè)2次，取均值。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞陽(yáng)性率 取外周血100 μL，加入50 ng/mL佛波酯、1 μg/mL離子霉素和2.0 μmo1/L莫能霉素，刺激培養(yǎng)4 h，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液破壞紅細(xì)胞后，PBS洗滌，500×g離心6 min棄上清，100 μL PBS重懸細(xì)胞。加入10 μL PerCPCy5.5鼠抗人-CD4，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌，加入500 μL破膜/固定劑，室溫避光孵育20 min，經(jīng)Perm/Wash緩沖液洗滌并重懸，100 μL細(xì)胞懸液中加入10 μL PE-鼠抗人IL-17，室溫避光孵育30 min。PBS洗滌后，400 μL PBS重懸細(xì)胞。以CD4陽(yáng)性細(xì)胞設(shè)門(mén)，讀取Th17細(xì)胞陽(yáng)性頻率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，本次研究全部為計(jì)量資料，正態(tài)性分布用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)；偏態(tài)資料用中位數(shù)M（25-75百分位數(shù)）表示，兩組比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearson相關(guān)系數(shù)。行雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子癇前期患者中間型單核細(xì)胞高表達(dá)HLA-DR

外周血細(xì)胞經(jīng)FITC-鼠抗人-CD14、PerCP-Cy5.5-鼠抗人-CD16和APC-鼠抗人HLA-DR標(biāo)記后，流式細(xì)胞測(cè)定中間型單核細(xì)胞HLA-DR陽(yáng)性細(xì)胞頻率和MFI。結(jié)果見(jiàn)圖1和表2。與對(duì)照組比較，子癇前期組中間型單核細(xì)胞HLA-DR陽(yáng)性細(xì)胞頻率和MFI明顯升高（P＜0.05），經(jīng)典型和非經(jīng)典型單核細(xì)胞HLA-DR陽(yáng)性細(xì)胞頻率和MFI與對(duì)照組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中間型單核細(xì)胞HLA-DR的表達(dá)

表2 兩組外周血單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)比較±s

表2 兩組外周血單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)比較±s

MFI子癇前期組2229.4±8.422.4±4.114.5±3.031.5±5.922.6±分組n中間型陽(yáng)性（％）經(jīng)典型陽(yáng)性（％）非經(jīng)典型陽(yáng)性（％）中間型MFI經(jīng)典型MFI非經(jīng)典型4.824.1±3.6對(duì)照組2320.1±3.820.5±3.713.8±3.826.4±4.323.6±3.923.8±3.8 t值4.821.630.683.320.760.27 P值＜0.0010.1090.4970.0010.4460.787

2.2 血清細(xì)胞因子濃度的比較

子癇前期組患者外周血TNF-α、IL-6和IL-17濃度高于對(duì)照組，IL-10濃度低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組間IL-12P70濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

2.3 子癇前期患者Th17細(xì)胞陽(yáng)性率升高

外周血細(xì)胞經(jīng)PerCP-Cy5.5-鼠抗人-CD4、PE-鼠抗人IL-17標(biāo)記后，流式細(xì)胞儀測(cè)定CD4+T細(xì)胞IL-17陽(yáng)性細(xì)胞率。結(jié)果見(jiàn)圖2。與對(duì)照組比較，子癇前期組外周血IL-17+CD4+/CD4+細(xì)胞陽(yáng)性率為（1.17±0.48）％，明顯高于對(duì)照組［（0.52± 0.14）％，t=6.226，P＜0.05）］。

表3 兩組血清細(xì)胞因子含量的比較pg/mL

圖2 兩組外周血Th17細(xì)胞陽(yáng)性率

2.4 子癇前期患者中間型單核細(xì)胞HLA-DR陽(yáng)性率與臨床數(shù)據(jù)相關(guān)性分析

子癇前期患者中間型單核細(xì)胞HLA-DR陽(yáng)性率與血清IL-17濃度、Th17陽(yáng)性細(xì)胞率呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.473（P=0.022）、0.468（P= 0.024），見(jiàn)圖3；與血清C反應(yīng)蛋白、尿白蛋白、IL-6、TNF-α濃度不相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.029（P= 0.896）、0.019（P=0.930）、0.024（P=0.906）、0.026（P=0.901）。

圖3 單核細(xì)胞HLA-DR陽(yáng)性率與血清IL-17、Th17細(xì)胞相關(guān)性

3 討論

中間型單核細(xì)胞約占外周血單核細(xì)胞5％左右，與經(jīng)典型和非經(jīng)典型單核細(xì)胞在表型、功能及炎癥活化潛能方面存在著明顯差異［7］。Me1gert等［8］研究表明，子癇前期患者外周血經(jīng)典型單核細(xì)胞比例下降，中間型單核細(xì)胞比例上升。對(duì)其他一些炎性疾病的研究也證實(shí)中間型單核細(xì)胞在多種自身免疫性疾病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、川崎病、膿毒性休克、多發(fā)性硬化癥、1型糖尿病等［9-10］。因此，中間型單核細(xì)胞增加可能是自身免疫性和感染性疾病的普遍現(xiàn)象。

HLA-DR是MHC-Ⅱ類分子，含有2個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量分別為36 000和27 000的亞基（α亞基和β亞基）。HLA-DR表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞（如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等）和活化T淋巴細(xì)胞等細(xì)胞表面?？乖岢始?xì)胞（APC）HLA-DR在將抗原提呈給CD4+T細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。單核細(xì)胞半衰期長(zhǎng)，其HLA-DR表達(dá)呈相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)［11］，用流式細(xì)胞儀能快速、定量檢測(cè)，是判定患者免疫功能的有效指標(biāo)，并可用于療效及預(yù)后評(píng)估［12］。

本次研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者中間型單核細(xì)胞HLA-DR陽(yáng)性率和MFI均明顯高于健康孕婦。Oggé等［13］在未對(duì)外周血單核細(xì)胞亞群分類的條件下，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)子癇前期患者外周血單核細(xì)胞HLA-DR的表達(dá)與健康孕婦無(wú)明顯差異，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典型和非經(jīng)典型單核細(xì)胞HLA-DR與健康孕婦相比無(wú)明顯差異。因中間型單核細(xì)胞占外周血單核細(xì)胞比例較低，即使中間型單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)升高，對(duì)總體單核細(xì)胞HLA-DR均值難以產(chǎn)生明顯影響。子癇前期患者中間型單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)升高，反映細(xì)胞處于活化狀態(tài)。

子癇前期患者外周血循環(huán)中存在的高濃度纖維蛋白原、熱休克蛋白70（HSP70）、胎盤(pán)來(lái)源的合體滋養(yǎng)細(xì)胞膜微粒等物質(zhì)均可活化單核細(xì)胞，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［14-15］。單核細(xì)胞活化后，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，包括酪氨酸激酶通路、蛋白酶C通路以及NF-κB通路等［16］，導(dǎo)致各種轉(zhuǎn)錄因子的激活，從而在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控細(xì)胞因子的表達(dá)，合成和分泌大量的炎癥介質(zhì)或趨化因子，如TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1（MIP）、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（VCAM-1）、內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞黏附分子-1（ELAM-1）等［17］。Giorgi等［18］研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者單核細(xì)胞NF-κB活化后，產(chǎn)生的TNF-α和IL-1β明顯高于健康孕婦。本研究結(jié)果顯示，子癇前期患者外周血IL-6、IL-17、TNF-α明顯升高，IL-10明顯降低，說(shuō)明母體處于炎癥狀態(tài)。

在機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)中，Th屬于適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，初始CD4+T細(xì)胞分化方向受抗原的性質(zhì)、局部微環(huán)境及細(xì)胞因子等多種因素的調(diào)控。目前子癇前期患者免疫紊亂除了存在Th1/Th2失衡，Th17/Treg失衡也發(fā)揮了重要的致病作用［19］。健康妊娠孕婦Th細(xì)胞存在向Th2、Treg偏倚，但子癇前期患者存在Th1、Th17偏倚［20］。Th1分泌干擾素γ（IFN-γ）、IL-2和TNF-α等，Th17分泌IL-17和IL-22等細(xì)胞因子。IL-17可以促進(jìn)T細(xì)胞的激活，并刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如IL-6、IL-8、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子（GM-CSF）和化學(xué)增活素及細(xì)胞黏附分子-1，這些細(xì)胞因子單獨(dú)或者協(xié)同作用，導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生，引起子癇前期的病理改變。本研究證實(shí)，子癇前期患者Th17陽(yáng)性細(xì)胞頻率增加。而且，外周血中間型單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)與Th17陽(yáng)性細(xì)胞頻率、外周血細(xì)胞因子IL-17濃度具有相關(guān)性。

綜上所述，本次研究表明，子癇前期患者外周血中間型單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)明顯升高，并與外周血細(xì)胞因子IL-17濃度、Th17陽(yáng)性細(xì)胞頻率存在相關(guān)性，因而推測(cè)子癇前期患者外周血中間型單核細(xì)胞HLA-DR高表達(dá)，可能參與調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，影響Th17細(xì)胞分化，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷或母體過(guò)度炎癥反應(yīng)，從而參與子癇前期的疾病過(guò)程。因此，調(diào)控子癇前期患者中間型單核細(xì)胞HLA-DR的表達(dá)可能是治療子癇前期的新途徑。

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Expression of HLA-DR on peripheral blood intermediate monocytes and its functional implication in pre-eclampsia

Lü Lian-zheng1，LIN Xin2，QIAN Lei3，XU Wei-ping1，ZHANG Guo-ying1
（1.Department of Laboratory Medicine，Nanjing Integrated Traditiona1 Chinese and Western Medicine Hospita1 Affi1iated to Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing Jiangsu 210014；2.Department of Laboratory Medicine，the Affi1iated Nanjing Hospita1 of Nanjing Medica1 University，Nanjing Jiangsu 210006；3.Department of Laboratory Medicine，Binhai Peop1e′s Hospita1，Yancheng Jiangsu 224500，China）

Objective：To investigate the ro1e of HLA-DR on periphera1 b1ood intermediate monocyte in the pathogenesis of pre-ec1ampsia，and the expression of HLA-DR on periphera1 b1ood monocytes from patients with pre-ec1ampsia and their corre1ation with the c1inica1 biomarkers.Methods：Twenty-two patients with estab1ished pre-ec1ampsia patients and 23 cases of hea1thy pregnant women（HP contro1s）were se1ected in this study.Four mL of fresh venous b1ood was co11ected into a tube containing heparin after a11 participants gave informed written consent.The expression of HLA-DR on intermediate monocyte and the frequency of Th17 were eva1uated with the methods of f1ow cytometry.The concentrations of IL-6，IL-17，IL-10 and TNF-α in serum were ana1yzed with the method of Luminex 1iquichip p1atform.The corre1ation between the frequencies of HLA-DR+intermediate monocytes and serum cytokine 1eve1s were a1so eva1uated.Results：Compared to HP contro1s，the percentage of HLA-DR+intermediate monocyte was marked-1y higher in pre-ec1ampsia patients［（29.4±8.4）％vs（20.1±3.8）％，P＜0.01］，as we11 as the mean f1uorescence intension of HLA-DR（31.5±5.9 vs 26.4±4.3，P＜0.01）.The serum concentrations ofIL-6，IL-17 and TNF-α in pre-ec1ampsia patients were significant1y higher than that of HP contro1s（P＜0.05），whi1e the 1eve1 of IL-10 were significant1y 1ower than that of HP contro1s（P＜0.05）.In addition，a positive corre1ation has been found between the percentage of HLA-DR+intermediate monocytes and the serum 1eve1s of IL-17 and the frequency of Th17 in pre-ec1ampsia patients（r=0.468，r=0.473，P＜0.05）.Conclusion：Intermediate monocytes from patients with pre-ec1ampsia exhibited increased HLADR expression，which might p1ay a crucia1 ro1e in the pathogenesis of preec1ampsia.

pre-ec1ampsia；intermediate monocyte；HLA-DR；Th17 ce11s

R714.245

A

1671-7783（2015）06-0482-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y150151

2015-07-05 ［編輯］ 陳海林

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81471199）

呂連崢（1970—），男，江蘇南京人，副主任技師，主要從事免疫學(xué)研究；藺昕（通訊作者），主管技師，E-mai1：x.1in007@ 163.com