亞甲藍-光動力療法對大鼠口腔中變異鏈球菌的殺傷作用及其影響齲病發(fā)生的實驗研究

張 蕾, 盧志山, 孟 磊, 劉 雪, 荊曉艷

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬煙臺市口腔醫(yī)院 牙體牙髓科, 山東 煙臺 264008)

亞甲藍-光動力療法對大鼠口腔中變異鏈球菌的殺傷作用及其影響齲病發(fā)生的實驗研究

張 蕾, 盧志山, 孟 磊, 劉 雪, 荊曉艷

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬煙臺市口腔醫(yī)院 牙體牙髓科, 山東 煙臺 264008)

目的: 探討以亞甲藍(MB)為光敏劑的光動力療法(PDT)對大鼠口腔中變異鏈球菌的殺傷作用，及其對齲病發(fā)生的影響。方法: 取22 d齡 Wistar大鼠56只，通過口腔接種變異鏈球菌構(gòu)建致齲模型后，隨機分成7組(n=8)：MB- PDT 120 s組 、MB- PDT 240 s組、MB- PDT 480 s組、單純MB組、單純PDT組、2 g/L NaF陽性對照組、生理鹽水陰性對照組。然后按上述分組分別進行相應(yīng)處理(激光組所用光源為810 nm的半導(dǎo)體激光)；每周處理1次，連續(xù)處理8周后，分別采用平板菌落計數(shù)法觀察各組對變異鏈球菌的殺傷作用；Keyes齲齒記分法觀察各組齲病發(fā)生、發(fā)展情況；掃描電鏡觀察各組磨牙的表面形貌。結(jié)果：菌落計數(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，MB- PDT 120 s、240 s、480 s 3組均可使大鼠口腔中的變異鏈球菌數(shù)量顯著減少(P<0.05)，且隨著照射時間的延長，其殺菌率不斷增加，Keyes齲齒記分也呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢；掃描電鏡結(jié)果顯示，MB- PDT各組均可有效封閉釉質(zhì)表面脫礦孔，且照射時間越長，封閉效果越好。結(jié)論：MB- PDT 對大鼠口腔中變異鏈球菌有明確的殺傷作用，并能在一定程度上預(yù)防齲病的發(fā)生。

光動力療法; 亞甲藍; 變異鏈球菌

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.09.008

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(9):544]

齲病是在以細菌為主的多種因素影響下，牙體硬組織發(fā)生慢性進行性破壞的一種疾病，其發(fā)病率在各種口腔疾病中位居前列。致齲菌在口內(nèi)的產(chǎn)酸代謝活動是齲病發(fā)生的直接原因，而變異鏈球菌是主要的致齲菌之一，有效干擾變異鏈球菌的生長代謝，對于齲病的預(yù)防和控制有著重要的作用。光動力療法(photodynamic therapy, PDT)是利用特定波長的光激發(fā)光敏劑產(chǎn)生光化學(xué)效應(yīng)，以達到抑制病原微生物的一種新型療法，可有效治療細菌性疾病而不產(chǎn)生耐藥性；且因其在抑菌方面具有獨特的優(yōu)勢而受到國內(nèi)外學(xué)者越來越多的關(guān)注[1]。

本研究旨在初步探討亞甲藍(MB)介導(dǎo)的光動力療法對變異鏈球菌的殺傷效果，及其對齲病發(fā)生的影響，并篩選最佳PDT效應(yīng)參數(shù)，為其用于齲病預(yù)防提供實驗室依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

變異鏈球菌NCTC(首都醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院)；胰蛋白胨大豆肉湯固體培養(yǎng)基(Trypticase Soy Agar, TSA)、 胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基(Trypticase Soy Broth, TSB)(北京陸橋有限公司)；注射用青霉素鈉(哈藥集團制藥總廠)；注射用硫鏈霉素(大連美羅大藥廠)；2 g/L的氟化鈉水溶液、40 μg/mL MB溶液(上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司)；HH- BLL360型電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津?qū)嶒瀮x器廠)；超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)；旋渦混合器(江蘇海門其林醫(yī)用儀器廠)；光學(xué)顯微鏡(OLMPUS，日本)；半導(dǎo)體激光器(810 nm，F(xiàn)otona，德國)；掃描電鏡(SS-550型，日本)。

1.2 方法

1.2.1 變異鏈球菌的復(fù)蘇和增菌培養(yǎng)

取變異鏈球菌NCTC，37 ℃厭氧條件下復(fù)蘇48 h 后，接種于TSB液體培養(yǎng)基中， 37 ℃厭氧條件下增菌培養(yǎng)18～24 h。涂片檢查確定為純培養(yǎng)后，將菌液進行梯度稀釋(稀釋104～106)；然后取0.1 mL 菌液涂于TSA平板上，37 ℃厭氧條件下孵育48 h后，進行菌落計數(shù)，取菌落數(shù)達到108/mL的菌液待用。

1.2.2 致齲動物模型的建立

選取同窩別、同鼠齡出生后21 d的Wistar大白鼠56只(雌雄各半)，于出生后22 d時用無菌棉簽取各大鼠的唾液，并將其涂于TSA固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，以檢測大鼠口內(nèi)的固有菌群情況；同天，給予含抗生素(青霉素200 μg/mL，鏈霉素1 500 μg/mL)的蒸餾水作為飲用水，3 d后(出生25 d)按上述同樣方法行口腔采樣培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)果顯示變異鏈球菌陰性后停藥。自25 d開始，分別用無菌棉簽蘸取變異鏈球菌溶液(1 mL/次)，對各大鼠磨牙的咬合面-頰舌面依次進行涂抹，剩余菌液以鈍頭注射器注于大鼠口腔用于漱口(整個過程為1 min)，處理后2 h禁飲食[2]；每天處理2次(早、晚8點各1次)，連續(xù)3 d，并喂以致齲飼料#2 000(組成[3]: 6%全麥粉、56%蔗糖、28%精練豆粉、3%蔬菜粉、1%脫水全肝粉、4%酵母、2%鹽)和5%蔗糖水溶液；所有操作均由同1人完成。上述接種處理后(28 d鼠齡時)，分別采集各大鼠刺激性唾液(100 μL/只)，通過平板菌落計數(shù)法記錄其菌落形成單位，確認變異鏈球菌定植成功，且定植菌落數(shù)超過108CFU/L(達到致齲效果)[4]時，用于后續(xù)實驗。

1.2.3 MB- PDT對變異鏈球菌活力和齲形成影響的觀察

1.2.3.1 實驗分組和處理方法

于28 d鼠齡期取上述建模成功的56只大鼠，經(jīng)全身麻醉并仰臥固定后，將其隨機分為7組(n=8)，分別為： MB- PDT 120 s組(A)、MB- PDT 240 s組(B)、MB- PDT 480 s組(C)、單純光敏劑處理組(D)、單純激光照射組(E)、陽性對照(2 g/L NaF處理)組(F)、陰性對照(生理鹽水處理)組(G)。其中A、B、C 3組首先將浸有等量MB光敏劑溶液(40 μg/mL)的棉球放于各大鼠磨牙的咬合面，避光條件下作用5 min，待其完全浸潤咬合面后，用功率為400 mW、波長為810 nm的半導(dǎo)體激光分別照射120 s、240 s、480 s(其相應(yīng)的能量密度分別為：4.8 J/cm2、9.6 J/cm2、19.2 J/cm2)，每組各照射1次；D組僅用40 μg/mL的光敏劑按上述相同的方法處理各大鼠的磨牙咬合面，不進行激光照射；E組各大鼠磨牙的咬合面不作其他處理，直接用400 mW功率的激光照射480 s；F組用2 g/L的NaF溶液處理各大鼠的磨牙咬合面5 min; G組用生理鹽水處理各大鼠的磨牙咬合面5 min。每周按上述方法處理各組大鼠1次，連續(xù)處理8周。實驗期間，各組大鼠均置于相同環(huán)境下以普通飼料喂養(yǎng)。

1.2.3.2 各組大鼠口腔中變異鏈球菌的檢測

上述處理結(jié)束后，分別用棉拭子在各大鼠的磨牙咬合面上順時針擦拭一圈，立即放入盛有 1 mL生理鹽水的離心管中震蕩2 min(3 000 r/min)；分別經(jīng)連續(xù)梯度稀釋后，取懸浮液涂于TSA平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h進行菌落計數(shù)。

1.2.3.3 掃描電鏡觀察各組磨牙表面形貌

實驗結(jié)束后，于90 d時每組中各隨機抽取3只大鼠，處死后取其所有磨牙，并按掃描電鏡觀察要求進行標(biāo)本制備；各標(biāo)本分別經(jīng)25 mL/L戊二醛液前固定、10 g/L四氧化鋨后固定、梯度乙醇逐級脫水后，常規(guī)干燥、噴碳鍍膜，掃描電鏡下觀察各組磨牙的釉質(zhì)表面形貌，并拍照。

1.2.3.4 Keyes記分法觀察各組齲損形成情況

90 d時處死各組所余的5只大鼠，分離各大鼠的上下頜骨，用清水洗凈，并在室溫干燥后，分別置于4 g/L紫脲酸銨染色液中浸泡12 h。上述處理結(jié)束后，分別拔取各組大鼠的所有磨牙，并制作磨片。然后將各磨片置于光學(xué)顯微鏡下，根據(jù)Keyes經(jīng)典評分方法[5]評估各大鼠磨牙的患齲情況：鏡下呈粉紅色者為齲損部位，不著色或著色很淺者為正常牙體部位，并將齲損深度分為4級記分, E級: 齲損僅限于釉質(zhì); Ds級: 齲損累及釉質(zhì)及牙本質(zhì)外層1/4以內(nèi); Dm級: 齲損累及牙本質(zhì)厚度的1/4～3/4；Dx級: 齲損累及深度超過牙本質(zhì)厚度的3/4，甚至累及牙本質(zhì)全層。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠口腔中變異鏈球菌菌落計數(shù)結(jié)果

各處理組分別與陰性對照組相比，除單純MB組變異鏈球菌菌落數(shù)(CFU/mL)和殺菌率無顯著性差異性(P>0.05)外，其他各組的變異鏈球菌數(shù)均明顯減少，殺菌率均明顯升高(P<0.05)，殺菌率由高到低依次為MB- PDT 480 s組>MB- PDT 240 s組>MB- PDT 120 s組>單純激光照射>2 g/L NaF組>單純MB組；各處理組間兩兩相比，除MB- PDT 120 s組與MB- PDT 480 s組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)外，其余各組兩兩相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

殺菌率×100% 表1 不同處理對變異鏈球菌的殺菌效果比較 ±s)

不同字母組間P<0.05

2.2 Keyes記分結(jié)果

在體視顯微鏡下對各組大鼠磨牙齲損進行Keyes記分結(jié)果顯示：各組平滑面齲均以E級、Ds級齲損為主，Dm級僅見于陰性對照組、單純激光組和單純MB組，無Dx級齲損發(fā)生。各組窩溝齲均以E級、Ds級、Dm級為主，Dx級僅見于陰性對照組；各處理組各級齲損記分分別與陰性對照組相比，除單純光敏劑組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)外，其他各組的記分均明顯低于陰性對照組(P<0.05)；其中以3個PDT實驗組的記分最低，與其他各組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且隨著照射時間的增加，其記分呈現(xiàn)降低的趨勢(表2～3)。

表2 各組大鼠平滑面齲Keyes記分的比較 ( ±s)

不同字母組間P﹤0.05

表3 各組大鼠窩溝齲Keyes記分的比較

不同字母組間P<0.05

2.3 各組大鼠磨牙表面形貌的掃描電鏡觀察結(jié)果

掃描電鏡觀察結(jié)果顯示：陰性對照組和單純光敏劑組的磨牙表面均較粗糙，表現(xiàn)為蜂窩狀改變，并可見釉柱和柱間區(qū)明顯溶解，部分脫礦孔相連成脫礦區(qū)(圖1a、b)；2 g/L NaF組的磨牙表面相對“清潔”，脫礦孔表淺(圖1c)；單純激光照射組的磨牙表面較平滑，脫礦孔表淺，可見少量脫礦孔熔融封閉(圖1d)；MB- PDT 120 s組和MB- PDT 240 s組的磨牙表面較光滑，脫礦孔表淺，可見較多脫礦孔封閉(圖1e、f)；MB- PDT 480 s組磨牙表面較光滑，脫礦孔表淺，且大部分脫礦孔封閉(圖1g)。

a.生理鹽水組b.單純光敏劑組 c.2g/LNaF組 d.單純激光照射組

e.MB-PDT120s組 f.MB-PDT240s組 g.MB-PDT480s組

圖1 各組磨牙表面形貌的掃描電鏡圖像(SEM, ×2 000)

3 討論

齲病是一種多因素感染性疾病，是繼心血管疾病和癌癥之后的世界第三大疾病，嚴(yán)重影響著人類的口腔健康水平和生活質(zhì)量。變異鏈球菌(S．mutans) 是主要的致齲菌，其致齲機制在于能黏附于牙面，并產(chǎn)酸和耐酸，因此抑制變異鏈球菌的生長是預(yù)防齲病的重要途徑之一。

目前由于抗菌劑的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致了大量耐藥菌株的產(chǎn)生[6]，尋找新的可以替代的新型抗菌方法一直是廣大研究者關(guān)注的焦點。PDT是激光技術(shù)、光導(dǎo)技術(shù)、光信息處理技術(shù)、生物光化學(xué)技術(shù)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)有機結(jié)合的產(chǎn)物，是利用特定波長的激光照射激發(fā)光敏劑，使之與氧聯(lián)合作用產(chǎn)生具有細胞毒性的單態(tài)氧和其他活性氧成分，以達到抑制病原微生物的一種新型療法[1]。其作用機制是采用一定波長的可見光照射光敏劑，使其分子處于激發(fā)態(tài)，這種激發(fā)態(tài)的光敏劑又可將能量傳遞給周圍低能態(tài)的氧分子，使其成為高能態(tài)的單態(tài)氧; 單態(tài)氧的活性極強，可與微生物體內(nèi)重要的生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸和脂類等發(fā)生氧化反應(yīng)，使這些生物大分子物質(zhì)的活性喪失，從而導(dǎo)致微生物死亡[7-8]。有研究表明，光敏劑分子帶有正電荷，能迅速與細菌細胞結(jié)合并穿透胞膜進入細胞內(nèi)部，并且其與細菌細胞結(jié)合的能力遠強于與哺乳動物體內(nèi)細胞的結(jié)合能力。因此PDT 表現(xiàn)出對組織表面或組織內(nèi)細菌的選擇性殺滅作用，而對正常組織細胞影響較小，故可以重復(fù)進行多次治療[9]。另外，PDT的抗菌作用原理是光化學(xué)反應(yīng)而非光熱效應(yīng)[10-11]，不會造成牙髓激惹或牙體硬組織的損傷，而且PDT產(chǎn)生的單態(tài)氧和多種生物活性氧物質(zhì)對細菌細胞分子及其胞外聚合物具有直接破壞作用，故不會產(chǎn)生耐藥性[11]。

MB是一種具有熒光和光敏特性的有機染料，在結(jié)合激光照射后，能夠有效滅活病毒和細菌[12]。MB帶有的陽性電荷還能促進其與細菌的有效結(jié)合，從而提高其殺菌效果[13]。 Soukos等[14]研究顯示，在牙菌斑上孵育MB 5 min時，MB 穿透生物膜的深度可以達到400 μm。本實驗采用的810 nm激光器與MB的特征性吸收峰相吻合，可較好的激發(fā)光敏劑使之產(chǎn)生較高的殺傷效應(yīng)。本實驗結(jié)果顯示，將濃度為40 μg/mL的MB定植有變異鏈球菌的大鼠磨牙5 min后，用810 nm波長的激光照射240 s時，即可達到96.72%的殺菌率；隨著照射時間的增加，殺菌率也隨著增加，當(dāng)照射時間為480 s時，殺菌率甚至達到98.81%。該實驗結(jié)果提示，光動力療法對變異鏈球菌具有較好的殺傷效應(yīng)[15]。據(jù)此我們認為，對于MB介導(dǎo)的光動力療法，以照射時間480 s的激光參數(shù)用于變異鏈球菌的殺傷效果已經(jīng)足夠，如果激光劑量過小，則達不到治療效果；但如果激光劑量過大，有可能會引起周圍正常組織的損傷。Keyes 記分結(jié)果顯示，MB- PDT 120 s、240 s、480 s 3組的抑齲作用均明顯優(yōu)于單純激光組、單純光敏劑組和2 g/L NaF組，說明PDT可一定程度上預(yù)防齲病的發(fā)生，從而為其進一步的臨床應(yīng)用提供了實驗室依據(jù)。

光動力對細菌的殺傷效應(yīng)與照射時間(即能量密度)密切相關(guān)，尋找合適的照射時間，從而提高光動力的殺傷效率，減少組織的損傷是值得進一步探索的。

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Cytotoxicity of MB-PDT onstreptococcusmutansand the effects of MB-PDT on caries development

ZHANG Lei, LU Zhi- shan, MENG Lei, LIU Xue, JING Xiao- yan

(DepartmentofCariologyandOperativeDentistry,theAffiliatedYantaiStomatologicalHospitalofBinzhouMedicalUniversity,Yantai264008,China)

AIM: To investigate the effects of photodynamic therapy(PDT) of different energy densities with methylene blue(MB) as photosensitizer onstreptococcusmutans(S.mutans) in vitro. METHODS: Fifty- six 22 d old Wistar rats were fed withstreptococcusmutansto establish dental caries. The rats were then randomly divided into 7 groups(n=8) and received different treatments: MB- PDT with irradiation time of 120 s, 240 s, 480 s, MB only, PDT only, 2 g/L NaF(positive control), and 0.9% normal saline(negative control), respectively. The rats were treated once a week for 8 weeks. CFU ofS.mutanswas observed by plate colony count method. The Keyes caries score method was used to observe the the development of dental caries. Tooth surface structure was observed by scanning electron microscopy (SEM). RESULTS: MB- PDT significantly reduced the number ofS.mutansin the rats oral cavity(P<0.05). Keyes caries score showed a decreasing trend of caries incidence(P<0.05). SEM results showed that MB- PDT irradiation could seal the demineralization holes on enamel surface. CONCLUSION: MB- PDT has bacterialcidal effect onS.mutans, and can close demineralized hole on enamel surface. The effect is positively related to exposure time.

photodynamic therapy; methylene blue; streptococcus mutans

2015-01-22;

2015-07-20

張 蕾(1984-)，女，漢族，山東煙臺人。碩士

盧志山，E-mail：luzhishan@126.com

R780.2

A

1005-2593(2015)09-0544-05