不同正畸力對大鼠牙周組織改建的相關(guān)研究

常 悅, 張小平, 王明潔, 王 月, 崔淑霞

(河南 鄭州 450052: 1.鄭州大學(xué)第四附屬醫(yī)院口腔科;2. 河南省中醫(yī)院口腔科; 3. 河南省口腔醫(yī)院正畸科)

不同正畸力對大鼠牙周組織改建的相關(guān)研究

常 悅1, 張小平2, 王明潔1, 王 月1, 崔淑霞3

(河南 鄭州 450052: 1.鄭州大學(xué)第四附屬醫(yī)院口腔科;2. 河南省中醫(yī)院口腔科; 3. 河南省口腔醫(yī)院正畸科)

目的: 觀察不同正畸力作用不同時(shí)間后，大鼠移動(dòng)牙張力側(cè)牙周組織中的BMP- 2表達(dá)變化及牙周組織的改建。方法: 將健康雄性Wistar大鼠60只，隨機(jī)分成4組(n=15)，分別施加0 g(A組)、30 g(B組)、50 g(C組)、80 g(D組)力，建立左上第一磨牙移動(dòng)模型。分別于加力后1、3、7、14、21 d，測量各組牙齒移動(dòng)的距離；取實(shí)驗(yàn)牙——牙周組織聯(lián)合切片，HE染色法觀察牙周組織變化,免疫組化法檢測張力側(cè)牙周組織中BMP- 2的表達(dá)。結(jié)果: 牙齒移動(dòng)以C組最大，B組次之，D組最??；HE染色顯示，A組牙周組織無明顯變化，B組和C組牙周組織改建活躍，張力側(cè)可見新生的成骨細(xì)胞，D組牙周膜纖維排列混亂,并可見牙根局限性的吸收；免疫組化染色顯示，BMP- 2主要分布于牙周韌帶中，尤其是近牙槽骨和牙骨質(zhì)的區(qū)域染色較強(qiáng)，各加力組BMP- 2表達(dá)水平均明顯升高，并隨著力值的增大而增加(P﹤0.05)，C組與D組相比，各時(shí)間點(diǎn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論: BMP- 2的表達(dá)與力值大小呈正相關(guān)，50 g的正畸力值促進(jìn)牙周組織改建最明顯。

正畸力; 大鼠; 牙槽骨改建; BMP- 2

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.09.004

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(9):529]

生理狀態(tài)下牙周組織處于成骨和破骨的動(dòng)態(tài)平衡之中，而在正畸力作用下牙周組織則會發(fā)生適應(yīng)性改建，表現(xiàn)為壓力側(cè)破骨細(xì)胞增生活躍，以骨吸收為主；張力側(cè)成骨細(xì)胞增生活躍，以骨生成為主。但在正畸治療過程中以多大的正畸力才能安全有效的加速牙齒移動(dòng)，一直是廣大學(xué)者關(guān)注的課題。BMPS是轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF- β)超家族成員，主要參與機(jī)體的成骨活動(dòng)；其中BMP- 2是其家族中研究最廣泛，誘導(dǎo)活性最強(qiáng)且唯一能單獨(dú)誘導(dǎo)成骨的因子[1-2]。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠牙齒移動(dòng)模型，觀察不同正畸力作用下，張力側(cè)牙周組織中BMP- 2表達(dá)的變化，以期更深入了解成骨細(xì)胞活化的時(shí)機(jī)和機(jī)制，并為進(jìn)一步探討不同力值與牙周組織改建的關(guān)系奠定生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料和儀器

Wistar大鼠(河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)；游標(biāo)卡尺(桂林廣陸數(shù)字測控股份)；彈簧測力計(jì)(杭州西湖生物材料)；鎳鈦螺旋拉簧(北京圣馬特科技)；正畸用0．020 mm結(jié)扎絲(杭州森風(fēng)齒科材料廠)；BMP抗體、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中山生物技術(shù)開發(fā))。

1.2 大鼠正畸牙移動(dòng)模型的建立

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

取10周齡雄性Wistar大鼠60只(體質(zhì)量210～227 g)，要求牙體、牙列完整，無齲齒及牙周組織疾??；普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)(分籠)1周后，按不同正畸力值將其隨機(jī)分為4組：0 g(A組)、30 g(B組)、50 g(C組)、80 g(D組)(n=15)。

1.2.2 不同正畸力值牙移動(dòng)裝置的安裝

所有大鼠經(jīng)100 mL/L水合氯醛腹腔注射麻醉并固定后，首先用牙科高速渦輪機(jī)和尖頭金剛砂車針分別在各大鼠上頜的中切牙和左側(cè)第一磨牙頸部、頰側(cè)面及近中軸面各制備一淺凹；然后分別將0.020 mm正畸結(jié)扎絲從各大鼠的左上第一、第二磨牙的鄰間隙穿過，并連接于預(yù)備好的NiTi拉簧一端備用。用正畸測力計(jì)將各組的正畸力分別調(diào)整至0、30、50、80 g后，用游標(biāo)卡尺分別測量各力值所拉伸的距離；然后，另取一段結(jié)扎絲，分別與各大鼠拉簧的另一端連接，將其拉伸至相應(yīng)組所設(shè)力值的長度，并固定于中切牙的固位溝內(nèi)，使之以上頜兩個(gè)中切牙為支抗向前移動(dòng)第一磨牙；最后用樹脂粘結(jié)劑覆蓋結(jié)扎絲和固位溝以加強(qiáng)固位(圖1)。牙移動(dòng)裝置安裝后，每日檢查動(dòng)物口腔并測量力值以保證力值恒定，發(fā)現(xiàn)螺旋拉簧脫落則重新加載。為補(bǔ)償螺簧應(yīng)力疲勞及牙移動(dòng)引起的力值衰減，每周加力1次。

圖1 牙移動(dòng)裝置安裝情況

1.3 牙移動(dòng)距離的測量

分別于牙齒移動(dòng)裝置安裝后1、3、7、14、21 d各時(shí)間點(diǎn)，每組各隨機(jī)抽取3只大鼠，分別用40 mL/L 多聚甲醛液心內(nèi)灌注處死后，分離各大鼠的左側(cè)上頜骨，并用游標(biāo)卡尺測量其上頜左側(cè)第一磨牙遠(yuǎn)中舌溝點(diǎn)與第二磨牙近中舌溝點(diǎn)間的距離。所有測量均由同一人完成，測量精確0.01 mm，每個(gè)樣本測量3次取均值。

1.4 移動(dòng)牙牙周組織切片的制備

上述測量結(jié)束后，立即截取含上頜第一、第二磨牙及其周圍牙槽骨的組織塊，并將其置于40 mL/L 中性多聚甲醛液中固定48 h。將固定后的各組織塊置于100 g/L EDTA(pH 7.4)中， 4 ℃條件下脫鈣至大頭針能順利扎入牙中(4～6周)后，常規(guī)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋；然后平行于牙體長軸，制備牙——頜骨近遠(yuǎn)中向縱切片(片厚5 μm)。

1.5 常規(guī)組織學(xué)觀察

取各大鼠的牙周組織切片，常規(guī)HE染色后光鏡下觀察其牙周組織的變化情況，并拍照。

1.6 免疫組化染色觀察各組牙周組織中BMP- 2的表達(dá)水平

取各組切片脫蠟至水化，30 mL/L過氧化氫液封閉10 min后, 1 g/L胰蛋白酶室溫孵育10 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶；PBS沖洗2 min×3次，滴加50 μL一抗(BMP- 2抗體的1 ∶50稀釋液)4 ℃過夜；PBS緩沖液(pH 7.2～7.6)洗滌10 min×3次，37 ℃ 復(fù)溫1 h；滴加50 μL DAKO二抗復(fù)合物，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗3 min×3次，DAB顯色；蒸餾水沖洗，蘇木素輕度復(fù)染；蒸餾水沖洗，常規(guī)脫水、透明、封片，光鏡觀察并拍照。

然后利用Biosens Digital Imaging Systen(上海山富科學(xué)儀器有限公司)高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng),對每張免疫組化染色后的組織切片進(jìn)行BMP- 2定量分析：以第一磨牙張力側(cè)(遠(yuǎn)中)根中1/3處的近牙骨質(zhì)側(cè)的牙周膜為測量部位，分別從每張切片的測量部位各隨機(jī)選擇3個(gè)視野，計(jì)算機(jī)計(jì)算各標(biāo)本該部位的平均積分光密度值(IOD)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同力值組大鼠的牙移動(dòng)距離比較

牙移動(dòng)距離測量結(jié)果顯示，各組牙移動(dòng)周期均符合3個(gè)階段：①瞬時(shí)運(yùn)動(dòng)階段(1～7 d); ②遲滯期(7～14 d); ③加速移動(dòng)階段(14～21 d)。各組各時(shí)間點(diǎn)的牙移動(dòng)距離均以C組最大(1 d時(shí)除外); B組次之，D組最??；B組與C組相比在7、14、21 d時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B組與D組相比在1、3、7、14 d時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); C組與D組相比在1、3、7、14、21 d差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 不同力值組大鼠牙移動(dòng)距離比較

2.2 HE染色觀察結(jié)果

A組各時(shí)間點(diǎn)的牙周膜近遠(yuǎn)中間隙均等寬，且膠原纖維排列規(guī)則，破骨細(xì)胞少見(圖2a)。B組壓力側(cè)牙周膜變窄，牙槽骨邊緣可見少量的骨吸收陷窩和破骨細(xì)胞(圖2b)。C組牙周組織反應(yīng)活躍,牙周膠原纖維排列不規(guī)則，牙槽骨邊緣可見大量的骨吸收陷窩和破骨細(xì)胞；張力側(cè)牙周膜間隙增寬，血管擴(kuò)張，新生的成骨細(xì)胞沿牙槽骨側(cè)排列(圖2c)。D組壓力側(cè)牙周膜纖維排列混亂，有明顯的牙槽骨和牙骨質(zhì)的吸收，破骨細(xì)胞少見；張力側(cè)牙周纖維斷裂，新生的成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞少見(圖2d)。

2.3 各組牙周組織中BMP- 2的定性、定量分析

正常對照組(A組)牙周組織中的BMP- 2主要分布于牙周膜及其周圍組織細(xì)胞的胞質(zhì)中，尤其是鄰近牙槽骨和牙骨質(zhì)的區(qū)域陽性染色較強(qiáng)，成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞染色均為陽性(圖3a)；其張力側(cè)牙周組織中的BMP-2在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均無明顯變化(表2)。B組隨著加力時(shí)間的延長張力側(cè)BMP- 2陽性細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，且染色加深，7 d時(shí)達(dá)到高峰(圖3b)，14 d開始逐漸下降，21 d接近正常組水平；其平均IOD與A組相比，在3、7、14、21 d各時(shí)間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(表2)。C組張力側(cè)BMP- 2陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增多(圖3c)，其平均IOD與A組相比，在各時(shí)間點(diǎn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P﹤0.05)，而與B組相比，在1、3、7、14 d各時(shí)間點(diǎn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；21 d時(shí)其平均IOD仍處于較高水平，與B組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。D組張力側(cè)BMP- 2染色加深(圖3d)，其平均IOD與A組相比，各時(shí)間點(diǎn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P﹤0.05)；與B組相比，在1、7、14、21 d各時(shí)間點(diǎn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；而與C組相比，各時(shí)間點(diǎn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表2 不同力值組張力側(cè)牙周膜中 BMP- 2的IOD值比較

不同字母組間P﹤0.05

圖2 各組牙周組織HE染色觀察(10×40)

圖3 各組張力側(cè)牙周組織中BMP- 2的表達(dá)和分布(10×40)

3 討論

正畸力適當(dāng)與否是正畸牙齒移動(dòng)的關(guān)鍵因素，King等[3]分別以20、40、60 g的正畸力對大鼠的牙齒進(jìn)行移動(dòng)時(shí)發(fā)現(xiàn)， 40～60 g是正畸牙齒移動(dòng)的適當(dāng)力值范圍，可以觀察到特征性的牙齒移動(dòng)及相關(guān)骨改建的過程。燕濱漪等[4]報(bào)道，對大鼠的磨牙施加80～100 g的力時(shí)，其壓力側(cè)出現(xiàn)了廣泛的透明樣變，并伴有潛行性骨吸收，且牙移動(dòng)緩慢。因此本實(shí)驗(yàn)分別選用小力值(30 g)、中力值(50 g)、大力值(80 g)來研究大鼠牙周組織的變化情況。

在正畸過程中，牙齒移動(dòng)會伴隨著牙槽骨的改建，因此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)常以牙移動(dòng)速度來動(dòng)態(tài)的反映骨改建的情況。本實(shí)驗(yàn)中牙齒移動(dòng)距離顯示，各組 1～7 d 時(shí)的牙齒移動(dòng)距離有明顯差異，即B組(30 g)和C組(50 g)的牙齒移動(dòng)快，說明其牙周組織改建活躍，從而導(dǎo)致了牙槽骨表面直接骨吸收，使其牙齒移動(dòng)距離較大; 7～14 d時(shí)各組牙齒移動(dòng)速度較慢。組織學(xué)觀察顯示：壓力側(cè)血管壓縮、血流受阻，在牙周膜內(nèi)出現(xiàn)玻璃樣變結(jié)構(gòu)，牙槽骨改建停滯(圖2b)；其中D組(80 g)的牙齒移動(dòng)距離最小，壓力側(cè)牙周組織中破骨細(xì)胞較少，壓力側(cè)根中部可見牙骨質(zhì)的吸收, 牙槽骨表面出現(xiàn)不規(guī)則的破骨陷窩，且以潛掘性吸收為主(圖2d)。這可能是由于力值過大，牙槽骨改建受到抑制的緣故。14～21 d時(shí)，B組和C組的牙齒移動(dòng)距離增大，說明其進(jìn)入了進(jìn)行性牙齒移動(dòng)階段，其中C組移動(dòng)距離最大，說明其牙周組織改建活躍，并提示該力值(50 g)是牙槽骨改建的最適力值；而D組的牙齒移動(dòng)基本停滯，可能因?yàn)槠溲乐苁軗p仍然嚴(yán)重，只有待變性的牙周組織完全清除后，牙齒才能移動(dòng)，所以牙齒移動(dòng)緩慢。

BMP- 2是較強(qiáng)的成骨細(xì)胞因子,參與BMP-Smad信號傳導(dǎo)通路[5]，在體內(nèi)可通過自分泌和旁分泌的方式促進(jìn)骨、軟骨等相關(guān)結(jié)締組織的形成[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，BMP- 2在張力側(cè)牙周韌帶(PDL)中，尤其在PDL新生的牙骨質(zhì)和牙槽骨附近染色較強(qiáng)，在牙槽骨外側(cè)骨板和牙槽嵴附近也有BMP- 2的表達(dá)，并與PDL中BMP- 2區(qū)相連系；提示，BMP- 2與牙槽骨的改建有很大的聯(lián)系[8-9]。本結(jié)果顯示：A組張力側(cè)牙周組織中BMP- 2染色較淺，可能與未加力狀態(tài)下，牙周組織自分泌形式維持其穩(wěn)態(tài)有關(guān)；B組BMP- 2 IOD在各加力組中相對較低，說明其對張力側(cè)牙周膜及牙槽骨中的成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的激活能力低，從而使牙槽骨改建不活躍；C組BMP- 2 IOD較B組有所增高特別在加力1 d和21 d時(shí)，與B組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明C組牙周組織改建活躍，該力值能促進(jìn)張力側(cè)成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖和分化；D組BMP- 2 IOD與對照組相比差異顯著并呈增加趨勢，但與C組相比各時(shí)間點(diǎn)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是D組牙周組織破壞嚴(yán)重，牙槽骨改建延遲的緣故。本實(shí)驗(yàn)中BMP- 2表達(dá)水平的最高峰出現(xiàn)在加力的第7 d，而陳遠(yuǎn)萍等[10]報(bào)道，BMP- 2表達(dá)的最高峰出現(xiàn)在加力的第5 d, 其原因可能是由于本實(shí)驗(yàn)以整個(gè)正畸療程為1個(gè)周期，未將5 d納入到此周期范圍，因而高峰出現(xiàn)在第7天，但BMP- 2的變化趨勢與其研究的結(jié)果相一致。

Frost的機(jī)械閾值理論認(rèn)為，如果應(yīng)變量很小，骨代謝則處于負(fù)平衡狀態(tài)，以骨吸收為主，從而導(dǎo)致骨量丟失；如應(yīng)變量增加，骨代謝則進(jìn)入正平衡狀態(tài)，骨沉積增加；如應(yīng)變量繼續(xù)增大且超過一定界限，則骨代謝又表現(xiàn)為負(fù)平衡，骨組織中會出現(xiàn)微小損傷，并且修復(fù)的速度不能趕上損傷的速度，從而導(dǎo)致骨量減少。本結(jié)果與上述理論相一致，即：30 g力時(shí)應(yīng)變量很小，骨代謝處于負(fù)平衡狀態(tài)，以骨吸收為主，表現(xiàn)為成骨活動(dòng)不活躍，牙槽骨改建緩慢；50 g力時(shí)，應(yīng)變量增加，骨代謝進(jìn)入正的平衡狀態(tài)，以骨沉積為主，表現(xiàn)為成骨活動(dòng)活躍，牙槽骨改建較快; 80 g力時(shí), 超過牙周膜改建的最適力值，牙周組織破壞嚴(yán)重，從而使骨代謝進(jìn)入負(fù)平衡狀態(tài)，表現(xiàn)為成骨和破骨活動(dòng)均不活躍，牙槽骨改建停滯，骨量減少。本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同力值作用不同時(shí)間后，BMP- 2 在移動(dòng)牙張力側(cè)牙周組織中的表達(dá)情況，了解了不同力值對于大鼠牙周組織改建的影響。結(jié)果提示，在正畸過程中關(guān)閉拔牙間隙時(shí)，并不是力值越大越好，力值過大反而抑制了牙齒的移動(dòng)，其中以50 g的力值最佳,既利于牙槽骨改建又可提高牙齒移動(dòng)的效能。但這只是初步階段，如何利用BMP- 2促進(jìn)成骨的特性，將其用于正畸臨床中以加速牙齒移動(dòng)，并改善牙周病患者正畸治療的風(fēng)險(xiǎn)，還有待更深入的研究。

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The related study of the effect of different orthodontic force on the rebuilding of periodontal tissue in rats

CHANG Yue*, ZHANG Xiao- ping, WANG Ming- jie, Wang Yue, CUI Shu- xia

(*DepartmemtofOrthodontics,theForthAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

AIM: To investigate the effect of different orthodontic force on BMP- 2 expression in the tension side of periodontal tissues of rat during orthodontic tooth movement. METHODS：60 healthy rats were randomly divided into 4 groups (n=15) and were subjected to different orthodontic forces：group A (0 g), group B (30 g), group C (50 g) and group D (80 g). The distance of orthodontic tooth movement was determined after adding the forces for 1, 3, 7, 14 and 21 d, respectively. Then the rats were executed and the periodontal tissue of the maxiallary first molars were observed by HE staining. The expression of BMP- 2 in periodontal tissue in the tension side was determined by immunohistochemical method. RESULTS: The distances of orthodontic tooth movement were as in following order: group C>B>D>A. HE staining r showed that there were no significant changes in the periodontal tissue in group A. The periodontal tissue rebuilt in groups B and C was active and osteoblasts were more in the tension side of the periodontal tissue. While in group D, periodontal ligament fibers were in disorder and root resorption was observed . Immunohistochemical staining showed that BMP- 2 was mainly distributed in periodontal ligament, especially in alveolar bone and cementum region, With the increase of orthodontic force, the expression of BMP- 2 increased (P﹤0.05). No statistically significant difference was observed between group C and group D. CONCLUSION: The expression of BMP- 2 is highly related with the orthodontic force strength. 50 g orthodontic force can promote periodontal tissue remodeling.

orthodontic force; rat; alveolar bone remodeling; BMP- 2

2015-01-11

省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(13A320625)

常 悅(1987-),女，漢族，河南鄭州人。碩士

崔淑霞，E-mai:cui-shuxia@163.com

R783.5

A

1005-2593(2015)09-0529-05