重慶養(yǎng)殖中華鱉群體遺傳多樣性的RAPD分析

趙華一 刁曉明 李華 楊煥超 陳彥伶 涂全宇 劉釗

摘要 ?［目的］利用RAPD標(biāo)記技術(shù)對重慶4個養(yǎng)殖地區(qū)中華鱉的遺傳多樣性進(jìn)行分析。［方法］選?。ㄤ?、永川、江津、長壽）4個地區(qū)養(yǎng)殖中華鱉樣本，運(yùn)用RAPD方法對4個地區(qū)的中華鱉遺傳多樣性與其遺傳距離進(jìn)行了分析。［結(jié)果］用20個隨機(jī)擴(kuò)增引物得到142個擴(kuò)增片段，多態(tài)片段數(shù)量為95個，4個地區(qū)的多態(tài)位點(diǎn)比例范圍為50.78%～64.54%，總多態(tài)位點(diǎn)比例為66.90%，總基因多樣性為0.227，種群內(nèi)基因多樣性為0.135，遺傳分化系數(shù)為0.307，基因流為1.127。4個養(yǎng)殖中華鱉群體的遺傳距離為0.049～0.151。［結(jié)論］重慶4個地區(qū)養(yǎng)殖中華鱉遺傳多樣性較高，且大部分遺傳變異存在于種群內(nèi)，個體間親緣關(guān)系較近，遺傳變異度較小。

關(guān)鍵詞 ?中華鱉；遺傳多樣性；RAPD；重慶地區(qū)

中圖分類號 ?S 966.5 ??文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ?A ??文章編號 ?0517-6611（2023）05-0067-03

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2023.05.017

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

RAPD Analysis of Population Genetic Diversity of Pelodiscus sinensis in Chongqing

ZHAO Hua-yi1， DIAO Xiao-ming2， LI Hua1 et al

（1. Fisheries Research Institute， Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu， Sichuan 611730;2. College of Fisheries，Southwest University/Chongqing Three Gorges Ecological Fisheries Industry Technology Research Institute， Beibei， Chongqing 400715）

Abstract ?［Objective］ ?This article uses RAPD marker technology to analyze the genetic diversity of four Pelodiscus sinensis in Chongqing area. ［Method］ In this study， we mainly selected farmed Pelodiscus sinensis samples from 4 regions （Tongnan， Yongchuan， Jiangjin， and Changshou）. ［Result］ By using 20 random amplification primers， 142 amplified fragments were obtained， of which the number of polymorphic fragments was 95. The polymorphism ratio in the four regions ranged from 50.78% to 64.54%， and the total polymorphism ratio was 66.90%. The total genetic diversity of the four populations was 0.227， the genetic diversity within the population was 0.135， the genetic differentiation coefficient was 0.307， and the gene flow data was 1.127. The genetic distance of the four farmed Pelodiscus sinensis populations is between 0.049 and 0.151. ［Conclusion］ The genetic diversity of farmed Pelodiscus sinensis in the 4 regions of Chongqing is high， and most of the genetic variation exists within the population， and the genetic relationship between individuals is relatively close， and the degree of genetic variation is small.

Key words ?Pelodiscus sinensis;Genetic diversity;RAPD;Chongqing area

中華鱉（Pelodiscus sinensis）俗稱團(tuán)魚、甲魚、王八等，隸屬于爬行綱龜鱉目鱉科中華鱉屬。我國已報道的中華鱉有2種，均屬于鱉亞科［1］。中華鱉在我國除寧夏、新疆、青海及西藏未見報道外，其余各省、市、自治區(qū)均有分布［2］。中華鱉在我國是一種重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖水生生物。

RAPD是于20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的第2代分子標(biāo)記技術(shù)，是一種基于PCR技術(shù)的DNA標(biāo)記技術(shù)［3］。20世紀(jì)90年代，Williams等［4］運(yùn)用隨機(jī)引物擴(kuò)增技術(shù)，即RAPD技術(shù)擴(kuò)增出的多態(tài)DNA片段作為分子遺傳標(biāo)記。Welsh等［5］研究也發(fā)現(xiàn)，RAPD技術(shù)檢測具有靈敏方便、多態(tài)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。在水產(chǎn)方面，郭珂等［6］運(yùn)用RAPD技術(shù)對贛州水系的鯉魚進(jìn)行遺傳多樣性分析，得出了贛江水系鯉魚遺傳多樣性較高的結(jié)論。石洪玥等［7］運(yùn)用RAPD技術(shù)對七里海中華絨螯蟹第６代繁育群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析，得到了107個不同的多態(tài)位點(diǎn)。林基亮等［8］則利用RAPD技術(shù)對青島鰲山衛(wèi)和紅島的2個四角蛤蜊自然群體進(jìn)行遺傳多樣性研究，并在2個群體中共檢測出37個多態(tài)位點(diǎn)。劉至治等［9］對黃河鱉、淮河鱉、洞庭湖鱉、鄱陽湖鱉及太湖鱉5個群體進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果表明，中華鱉的遺傳多樣性較豐富，其多態(tài)位點(diǎn)比例順序?yàn)椋禾M>洞庭湖鱉>鄱陽湖鱉>淮河鱉>黃河鱉；黃麗英［10］利用23條隨機(jī)引物在日本種群、臺灣種群、烏鱉種群、太湖種群4個種群中共檢測出多樣位點(diǎn)110個，其中DNA總多態(tài)百分率占67.90%。中華鱉作為我國優(yōu)質(zhì)名特優(yōu)水產(chǎn)品種，在全國范圍內(nèi)都有大量的養(yǎng)殖，但在重慶市中華鱉的養(yǎng)殖上，養(yǎng)殖戶追求的是中華鱉的產(chǎn)量與銷量及其品質(zhì)，很少在意其種質(zhì)及來源，致使重慶地區(qū)的中華鱉品種品系較為混亂。且目前關(guān)于重慶養(yǎng)殖中華鱉群體的種質(zhì)研究與遺傳研究較少，因此利用分子技術(shù)研究重慶養(yǎng)殖中華鱉的遺傳多樣性對重慶地區(qū)中華鱉的養(yǎng)殖與繁育有積極的推進(jìn)作用。為此，筆者利用RAPD技術(shù)從分子水平對重慶地區(qū)養(yǎng)殖中華鱉進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在為今后如何保護(hù)其種質(zhì)資源及基因庫、防止在規(guī)模化養(yǎng)殖后造成的基因流失提供理論指導(dǎo)，同時為中華鱉合理開發(fā)利用及選擇育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用中華鱉樣本采樣于重慶4個地區(qū)（永川來蘇、江津珞璜、潼南塘壩、長壽雙龍）的中華鱉養(yǎng)殖場。每個地區(qū)各取20只中華鱉樣本，取裙邊肌肉，置于-70 ℃冰箱保存，后期用來提取DNA。Taq DNA 聚合酶采購于上海生工科技有限公司，PCR隨機(jī)引物和DNA提取試劑盒采購于上海擎科有限公司，試驗(yàn)儀器主要有PCR儀、電泳儀和WD-9413A凝膠成像分析儀。

1.2 基因組DNA的提取與RAPD擴(kuò)增

1.2.1

基因組DNA的提取與RAPD擴(kuò)增反應(yīng)體系。取14～20 mg中華鱉裙邊肌肉組織材料，用上海擎科有限公司Ezup柱式動物基因組DNA試劑盒提取基因組DNA。

RAPD擴(kuò)增引物的選擇主要參考劉至治等［9］與肖亞梅等［11］關(guān)于中華鱉RAPD相關(guān)研究數(shù)據(jù)，篩選出20對引物。RAPD反應(yīng)體系總體積為25 μL：10×PCR Buffer 3.0 μL，Ndtps 1.0 μL，MgCl2 2.5 μL，Taq酶0.2 μL，引物2.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 14.3 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，然后94 ℃變性45 s、36 ℃復(fù)性（退火）45 s、72 ℃延伸90 s，循環(huán)次數(shù)為45，最后在72 ℃繼續(xù)延伸7 min。完成后置于4 ℃環(huán)境保存。

1.2.2

RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測用20對引物對樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，電壓為3～4 V/cm，電泳結(jié)束后用WD-9413A凝膠成像分析儀進(jìn)行觀察。

1.3 數(shù)據(jù)的分析與處理

瓊脂糖凝膠電泳過后，在凝膠成像儀上進(jìn)行觀察，如有清晰可見的擴(kuò)增條帶，則進(jìn)行試驗(yàn)記錄。對于不同個體擴(kuò)增出來的RAPD條帶，如果在膠板上有同一個位置的遷移都視為顯性，可以將其賦值為1；如果此位置無條帶的遷移則視為隱性，將其賦值為0。1與0可以構(gòu)成2元數(shù)據(jù)矩陣，用計算機(jī)統(tǒng)計軟件Popgen3.2統(tǒng)計其相應(yīng)結(jié)果。將以上統(tǒng)計可以算出多態(tài)位點(diǎn)的比例，多態(tài)位點(diǎn)比例（P）=多態(tài)位點(diǎn)數(shù)/位點(diǎn)數(shù)×100%，算出Nei氏遺傳相似指數(shù)（F）［12］。將其共有的擴(kuò)增帶（NXY）和各自的擴(kuò)增帶（NX與Ny）作比較，則可以得出遺傳相似指數(shù)。而遺傳距離（D）［13］則為D=1－F，同時也可得出基因流NM［14］，Nei基因多樣性指數(shù)［15］與Shannon信息指數(shù)I［16］。多態(tài)性位點(diǎn)的選擇主要參考劉至治的相關(guān)方法，引物主要參考黃麗英的隨機(jī)引物，PCR反應(yīng)體系則用標(biāo)準(zhǔn)的25 μL總反應(yīng)體系，PCR程序的選擇則在退火溫度上設(shè)置梯度退火溫度，退火溫度設(shè)置為32～55 ℃，預(yù)備試驗(yàn)后優(yōu)選退火溫度36 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD擴(kuò)增結(jié)果

該試驗(yàn)用20對隨機(jī)引物對80只4個地區(qū)養(yǎng)殖中華鱉的基因組DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，其中S55引物對江津地區(qū)養(yǎng)殖中華鱉基因組DNA擴(kuò)增電泳圖如圖1所示。每個引物得到的擴(kuò)增片段在3～12個之間，20個引物總共檢測到142個DNA擴(kuò)增片段，多態(tài)片段數(shù)量為95個，多態(tài)位點(diǎn)比例約為66.90%。

2.2 重慶4個地區(qū)養(yǎng)殖中華鱉內(nèi)部的遺傳變異

表2表明，4個地區(qū)養(yǎng)殖中華鱉的Nei基因多樣性指數(shù)數(shù)值范圍為0.260～0.278；Shannon指數(shù)數(shù)值范圍為0.163～0.184?？梢钥闯?個地區(qū)養(yǎng)殖中華鱉種群內(nèi)的遺傳多樣性并不高。

2.3 重慶4個地區(qū)養(yǎng)殖中華鱉不同種群間的遺傳變異

4個地區(qū)中華鱉的種群遺傳多樣性參數(shù)結(jié)果表明，重慶養(yǎng)殖中華鱉總基因多樣性（HT）數(shù)值為0.227，而各種群內(nèi)的基因多樣性（Hs）數(shù)值為 0.135，種群內(nèi)的基因多樣性所占總基因多樣性的數(shù)值（Hs/HT）為59.31%。根據(jù)種群內(nèi)的基因占總基因多樣性的占比可以看出，4個種群的遺傳變異主要集中于種群內(nèi)；根據(jù)種群遺傳分化系數(shù)的數(shù)值（Gst）0.307可看出，4個種群在不同種群間也產(chǎn)生了一定的遺傳分化，而根據(jù)種群遺傳分化系數(shù)的數(shù)值得出的基因流（Nm）為1.127，其數(shù)值大于1，說明種群間存在某些量的基因交流。

通過聚類分析的樹狀圖可以看出，江津與潼南地區(qū)的養(yǎng)殖中華鱉先聚為一支，而長壽與永川的養(yǎng)殖中華鱉則分別單獨(dú)聚為一支。從表3中可以看出，江津地區(qū)和潼南地區(qū)養(yǎng)殖中華鱉種群的遺傳相似性指數(shù)為0.934，遺傳距離為0.066，此結(jié)論與聚類樹狀圖結(jié)果一致。長壽地區(qū)養(yǎng)殖中華鱉與江津地區(qū)養(yǎng)殖中華鱉遺傳相似度指數(shù)最低，僅有0.049；從地區(qū)上看，江津地區(qū)與其他3個地區(qū)的養(yǎng)殖中華鱉遺傳相似度均高于0.8，而潼南地區(qū)與其他3個地區(qū)的養(yǎng)殖中華鱉遺傳相似度均低于0.2。

3 討論

3.1 重慶4個地區(qū)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性

遺傳多樣性［16］與一個物種對生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)性、在生態(tài)環(huán)境中的生存能力與其繁殖后代的存活率等都有密切關(guān)系，沒有遺傳多樣性，整個生物界將會失去活力與基礎(chǔ)。而多態(tài)位點(diǎn)的比例就是衡量遺傳多樣性的一個重要指標(biāo)。黃麗英［10］對太湖種群、日本種群、烏鱉種群、臺灣種群4個養(yǎng)殖品系進(jìn)行了RAPD遺傳多樣性分析，得出4個品系的平均多態(tài)位點(diǎn)比例為67.90%，略高于該研究得出的平均多態(tài)位點(diǎn)比例（66.90%）。就野生水生生物而言，平均多態(tài)位點(diǎn)比例為30.06%。王廣銀等［17］報道的關(guān)于野生香魚的平均多態(tài)位點(diǎn)比例為30.71%；符書源等［18］報道的野生鞍帶石斑魚的平均多態(tài)位點(diǎn)比例為48.09%；李明云等［19］報道的花鱸多態(tài)位點(diǎn)比例范圍為24.08%～31.18%。從以上報道可看出，野生種類遺傳多樣性都較低，且很大程度上低于該研究的養(yǎng)殖中華鱉群體多態(tài)性，也低于黃麗英［10］研究中4種養(yǎng)殖品系的平均多態(tài)性，可見人工養(yǎng)殖對多態(tài)性有一定程度的影響。在遺傳距離上，4個地區(qū)的遺傳距離范圍為0.049～0.151，與黃麗英得出的遺傳距離相似。Thorpe［20］認(rèn)為，不同物種間遺傳相似度范圍應(yīng)該為0.2～0.8；而同種不同群體間遺傳相似度范圍應(yīng)該為0.80～0.97，與該試驗(yàn)得出的遺傳距離結(jié)論一致。4個地區(qū)養(yǎng)殖中華鱉的種群內(nèi)基因多樣性為0.135，占總基因遺傳多樣性的59.31%，說明4個地區(qū)種群間也存在一定的遺傳分化。而根據(jù)聚類分析來看，永川養(yǎng)殖中華鱉群體聚為單獨(dú)一支，長壽養(yǎng)殖中華鱉群體聚為單獨(dú)一支，潼南養(yǎng)殖中華鱉群體和江津養(yǎng)殖中華鱉群體聚為一支。總體而言，養(yǎng)殖中華鱉遺傳多樣性明顯低于野生中華鱉，魚類也相同。在我國，已經(jīng)建立了一些中華鱉的良種場對其種質(zhì)資源進(jìn)行保護(hù)，其中在浙江、湖南和廣東都設(shè)立了國家級中華鱉良種場，但在重慶地區(qū)的中華鱉良種場較少，因此重慶應(yīng)對中華鱉的種質(zhì)保護(hù)進(jìn)行重視。同時重慶存在一種俗名為紫砂鱉的當(dāng)?shù)赝流M，但近年來對其研究接近空白，后期可以對其進(jìn)行相關(guān)研究。

3.2 關(guān)于RAPD試驗(yàn)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計

RAPD是20世紀(jì)基于PCR分子技術(shù)發(fā)展而來的一項(xiàng)分子標(biāo)記技術(shù)，其引物不需要單獨(dú)設(shè)計，而是用隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增，因此更加簡便高效。但其也存在一定的不穩(wěn)定性，其反應(yīng)體系如受到污染則對試驗(yàn)結(jié)果會有較大影響，因此離心管、PCR小管、移液槍頭等試驗(yàn)器材的滅菌操作非常必要。同時PCR體系的DNA模板濃度與引物濃度也會對試驗(yàn)數(shù)據(jù)有一定的影響。該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DNA模板濃度過高則容易造成拖帶，而引物濃度過低會出現(xiàn)條帶看不清甚至沒有條帶的現(xiàn)象。而退火溫度的選擇也是影響試驗(yàn)結(jié)果的一個非常重要的因素，因此該試驗(yàn)在退火溫度上設(shè)置了一個梯度，即進(jìn)行了梯度RAPD擴(kuò)增試驗(yàn)，退火溫度設(shè)置為32～55 ℃，從而尋求該試驗(yàn)的最佳退火溫度。在RAPD試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計上，容易由于試驗(yàn)人員的主觀原因影響試驗(yàn)結(jié)果，因此需要探尋更好的電泳條帶分析方法。也有學(xué)者使用其他分子標(biāo)記方法對中華鱉的遺傳多樣性進(jìn)行研究，如王利華等［21］運(yùn)用SSR標(biāo)記法對淮河品系中華鱉的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，今后可考慮運(yùn)用其他分子標(biāo)記法對重慶地區(qū)的養(yǎng)殖中華鱉進(jìn)行遺傳多樣性研究。

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