糖尿病和冠心病患者高密度脂蛋白結(jié)構(gòu)與其抗炎作用的相關性研究

劉捷穎 嚴曉偉

高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）在體內(nèi)外均可抑制血管內(nèi)皮細胞表達粘附分子[1]。而病理狀態(tài)下HDL結(jié)構(gòu)改變對其抑制細胞粘附能力的影響尚不明確。我們通過提取健康人、單純糖尿病、單純冠心病及糖尿病合并冠心病患者的HDL，檢測其血清淀粉樣蛋白 A（serum amyloid A protein，SAA）和載脂蛋白 AI（apolipoprotein A-I，apoAI）水平，并進行HDL抑制細胞粘附作用的研究，以探討HDL的結(jié)構(gòu)改變對其抗炎功能的影響。

1 材料、對象和方法

1.1 實驗材料及試劑

人急性單核細胞白血病細胞株（human acute monocytic leukemia cell line，THP-1細胞株）購自中國醫(yī)學科學院基礎研究所細胞中心；臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUⅤECs）取自北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科。人SAA-ELISA免疫分析試劑盒（Biosource公司），人 apoAI-ELISA 免疫分析試劑盒（武漢中美科技有限公司）。抗人CD54單克隆抗體，抗人CD106單克隆抗體（Sigma公司）。Calcein-AM，Calbiochem公司。BCA蛋白測定試劑盒，Pierce公司。

1.2 研究對象及分組

2008年10月在北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科及心內(nèi)科住院患者中隨機入選符合條件的單純糖尿病患者7例（DM組），單純冠心病患者8例（CHD組）及冠心病合并糖尿病患者9例（DM+CHD組）。糖尿病患者入選標準為1999年世界衛(wèi)生組織的2型糖尿病診斷標準[2]。冠心病患者入選標準：既往確診心肌梗死，或有典型心絞痛癥狀，冠狀動脈造影顯示主要血管存在50%以上狹窄。排除標準：取血前有他汀藥物使用史，I型糖尿病、急性冠狀動脈綜合征、肝腎功能不全、年齡＜18歲或年齡≥80歲。同時選取年齡、性別相匹配的健康體檢者8名作為對照組（Normal組），所有受試者簽署知情同意書，研究方案經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會審核批準。所有受試者樣本均隨機編號，受試者信息不提供給檢測人員。

1.3 脂蛋白的分離提取

于 1.21 g/ml密度液（283.4 g NaBr，0.5 g EDTA，去離子水1 L）下部加入受試者血漿，離心（Beckman 55.2 Ti，轉(zhuǎn)速42000 rpm）12 h提取脂蛋白混合物。在清潔離心管中依次加入1.006 g/ml（9 g NaBr，0.5 g EDTA，去離子水 1 L）、1.063 g/ml（95 g NaBr，0.5 g EDTA，去離子水1 L）密度液，于雙層密度液下部加入已提取脂蛋白混合物，離心（Beckman 55.2 Ti，轉(zhuǎn)速45 000 rpm）2 h提取極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，ⅤLDL），低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）和 HDL。 應用透析液（0.02 M Tris-HCl，0.9%NaCl，pH 調(diào)至 7.4）透析 48 h，采用聚乙二醇20 000濃縮脂蛋白并4℃保存。酶標儀562 nm下測定吸光度，BCA法測定各樣本蛋白濃度。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）檢測 HDL中SAA和apoAI含量

根據(jù)人SAA-ELISA及人apoAI-ELISA免疫分析試劑盒說明書步驟操作，酶聯(lián)儀在450 nm波長依序測量各樣本孔光密度（OD值）。采用直線回歸算法繪制標準液的吸光度對應標準濃度的曲線。從標準曲線中讀取未知樣本和對照品的SAA及apoAI濃度。單位脂蛋白量中SAA量的計算如下：SAA量（ng/μg） =SAA 濃度（ELISA 法，ng/ml） /蛋白濃度（BCA法，μg/ml）。單位脂蛋白量中apoAI量的計算如下：apoAI量（ng/μg） =apoAI濃度（ELISA法，μg/ml）/蛋白濃度（BCA 法，μg/ml） ×1 000。

1.5 HUⅤECs的培養(yǎng)

取正常足月新生兒臍帶，用膠原酶I溶液消化獲取HUⅤECs，用ECM完全培養(yǎng)基接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每2～3 d即以1：3的比例進行細胞傳代，傳2代后凍存于液氮罐，實驗前進行細胞復蘇，而后再傳代1次，48 h后進行實驗。

1.6 HDL抑制HUⅤECs表達粘附分子的檢測

調(diào)節(jié)HUⅤECs濃度至5×105cells/ml，種入細胞培養(yǎng)板，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，饑餓細胞12 h，而后加入孵育濃度為1 mg/ml的健康人、糖尿病、冠心病及糖尿病合并冠心病患者的HDL，孵育4 h，再加入刺激濃度為10 ng/ml的腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）刺激4 h 后中止反應，抗人CD54-PE和CD106-FITC單克隆抗體標記后，流式細胞儀檢測平均熒光強度，從而獲得 ICAM-1和ⅤCAM-1的表達水平。

1.7 HDL抑制HUⅤECs對THP-1細胞粘附能力的檢測

調(diào)節(jié) HUⅤECs濃度至 5×105cells/ml，種入細胞培養(yǎng)板，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，饑餓細胞12 h，加入孵育濃度為1 mg/ml的健康人、糖尿病、冠心病及糖尿病合并冠心病患者的HDL，孵育4 h，再加入刺激濃度為10 ng/ml的 TNF-α刺激24 h后，加入Calcein-AM熒光染色劑標記的THP-1細胞，避光共同孵育60 min后中止反應，流式細胞儀檢測平均熒光強度，從而獲得其粘附細胞數(shù)量。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般臨床資料比較

各組基線人口既往病史、相關實驗室及臨床檢測結(jié)果比較，年齡分布、性別構(gòu)成、總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平分布平行，差異無統(tǒng)計學意義（表1）。

表1 各組受試者一般臨床資料比較

2.2 HDL的瓊脂糖電泳鑒定

經(jīng)過瓊脂糖電泳鑒定提取血脂純度，可見全血漿條帶雜亂。HDL、LDL及ⅤLDL樣本的條帶分別位于不同條帶區(qū)，且未出現(xiàn)明顯雜帶。表明通過超速離心方法提取的HDL純度較好。ⅤLDL條帶較淡，與血漿中ⅤLDL含量較低相符。

2.3 HDL對 HUⅤECs表達 ICAM-1及 ⅤCAM-1抑制能力的檢測

如圖1所示，Q1象限內(nèi)細胞表示ICAM-1表達陽性，Q2象限內(nèi)細胞表示ICAM-1及ⅤCAM-1均表達陽性，Q3象限內(nèi)細胞表示兩個粘附分子均表達陰性，Q4象限內(nèi)細胞表示ⅤCAM-1表達陽性。樣品未加入免疫熒光標記抗體，可見大部分HUⅤECs集中于Q3象限，無免疫熒光表達（圖1A）。經(jīng)過TNF-α刺激并加入了ICAM-1及ⅤCAM-1免疫熒光標記抗體的樣品，大部分細胞表達ICAM-1和ⅤCAM-1雙陽性（圖1B）。加入健康人HDL后，可見細胞集中區(qū)域明顯向左下象限移動，兩個粘附分子的表達強度均有所下降（圖1C）。表明HDL有明顯的抑制粘附分子表達的作用。加入各組患者HDL后，細胞集中區(qū)域均較圖1C向右上象限移動（圖1D～F），表明各組患者HDL抑制粘附分子表達的能力均減弱。

對各實驗組間HDL抑制ICAM-1和ⅤCAM-1表達的能力進行比較，健康對照組ICAM-1平均熒光強度明顯小于 DM組（17 318.60±4 364.77比34 171.67±13 918.07，P=0.02）及 DM+CHD 組（39 633.60 ±8 728.22，P ＜0.01）。 CHD 組 ICAM-1平均熒光強度明顯低于DM+CHD組（25 491.75±9 511.25比 39 633.60±8 728.22，P=0.04）（圖2A）。健康對照組ⅤCAM-1平均熒光強度明顯小于DM+CHD組（244.80±119.55比388.80±75.76，P=0.04），但與 DM 組（P=0.49）和 CHD 組（P=0.77）比較差異無統(tǒng)計學意義（圖2B）。結(jié)果提示DM組及DM+CHD組HDL抑制ICAM-1表達的能力明顯減弱；DM+CHD組HDL對ⅤCAM-1表達的抑制作用明顯減弱。

2.4 健康對照組及各患者組HDL對THP-1粘附功能的影響

圖3A顯示的 HUⅤEC未經(jīng) HDL作用，僅經(jīng)TNF-α刺激，其峰值偏右，熒光強度表達較高，提示有較多THP-1細胞粘附。而圖3B顯示的HUⅤEC經(jīng)健康人HDL作用后可見峰值明顯左移，熒光強度表達下降。表明HDL有明顯的抑制THP-1粘附HUⅤECs的作用。

圖1 空白對照，TNF-α刺激后及各實驗組加入HDL后樣本表達粘附分子的流式細胞圖

圖2 各受試組HDL抑制ICAM-1、ⅤCAM-1表達的平均熒光強度值比較

圖3 TNF-α刺激后未加入HDL及加入HDL后樣品圖像對比及各受試組HDL抑制THP-1細胞粘附的對比

健康對照組THP-1表達平均熒光強度明顯小于DM組（503.24±63.50比2 918.00±0.00，P＜0.01）、CHD 組（1 510.33 ± 1 353.87，P=0.05）和DM+CHD 組（4 196.50 ±412.60，P ＜0.01）。 CHD組THP-1表達明顯低于DM組（P=0.02）和DM+CHD組（P＜0.01），DM組THP-1表達明顯低于DM+CHD組（P=0.03）。結(jié)果顯示，不同人群HDL對THP-1細胞粘附功能的抑制作用按以下次序減弱：健康人群＞CHD組＞DM組＞DM+CHD組（圖3C）。

2.5 ELISA法檢測脂蛋白中SAA含量

健康對照組HDL的SAA水平明顯低于DM組（4.89±1.46比22.54±7.40，P ＜0.01），并且明顯低于CHD組（13.28±5.05，P=0.03）。 DM 組 SAA顯著高于 CHD 組（P=0.03）（圖4）。

2.6 各受試組HDL中SAA及apoAI含量與粘附分子表達及細胞粘附能力的相關性分析

圖4 各受試組HDL的SAA含量比較

將所有樣本HDL中SAA和apoAI含量與相關標本ICAM-1、ⅤCAM-1表達平均熒光強度及THP-1細胞粘附HUⅤECs平均熒光強度行多因素回歸分析，并校正年齡、性別、糖尿病、冠心病、吸煙、血漿TC和TG水平的影響。結(jié)果顯示，HDL中SAA的含量對與其共同孵育的HUⅤECs的ICAM-1的表達呈顯著正相關，其回歸系數(shù)為 1.57（t=3.22，P＜0.01）；SAA的含量對 HUⅤECs粘附 THP-1的數(shù)量也呈顯著正相關，回歸系數(shù) 1.16（t=3.05，P=0.01）；SAA含量對 ⅤCAM-1的表達無影響（P=0.60）。HDL中apoAI的含量與HUⅤECs中ICAM-1的表達呈顯著負相關，其回歸系數(shù)為-0.35（t=-2.40，P=0.02）；apoAI含量對 ⅤCAM-1 的表達及THP-1細胞粘附無顯著影響（P=0.25、0.80）。

3 討論

2型糖尿病患者動脈粥樣硬化程度明顯高于健康人[3]。Russo等[4]研究發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)α-1 HDL、α-2 HDL和pre-α-1 HDL水平降低，α-3 HDL水平增高，與其體內(nèi)高炎癥因子水平相關。因此，糖尿病患者HDL的抗炎能力與HDL組成結(jié)構(gòu)密切相關。本研究從抑制粘附分子表達及細胞粘附方面證實了糖尿病患者HDL抗炎作用明顯減弱，甚至弱于冠心病患者，提示糖代謝異常嚴重影響HDL的抗炎功能。

冠心病患者的HDL中補體C3、纖維蛋白原和其他炎性蛋白含量增加，與其抗炎作用的降低有關[5]。 Pérez-Méndez等[6]的研究顯示，心肌梗死患者HDL-C水平與健康人比較并無差異，但HDL-P亞型改變導致HDL顆?？箘用}粥樣硬化作用減弱，甚至出現(xiàn)促動脈粥樣硬化作用。冠心病患者HDL中血紅蛋白含量明顯升高，血紅蛋白與HDL間的連接促進了HDL的促炎作用[7]。上述研究從不同角度均證實HDL結(jié)構(gòu)（并非是HDL-C的血漿水平）發(fā)生改變是導致其抗炎作用發(fā)生異常改變的主要原因。

在炎癥狀態(tài)下，HDL中SAA含量明顯增加并且apoAI含量減少，結(jié)構(gòu)改變的同時抗炎能力下降[8]。終末期腎病患者HDL的49種組成蛋白中，只有富含 SAA的HDL刺激炎癥因子的產(chǎn)生，且HDL中SAA含量與其抗炎能力呈負相關[9]。SAA通過激活NF-κB途徑，促進促炎細胞因子及趨化因子的表達[10]。本研究不僅證實，在疾病狀態(tài)下HDL的抗炎能力下降，還進一步顯示HDL中SAA的含量與其抑制ICAM-1表達及THP-1細胞粘附的能力呈負相關，HDL中apoAI的含量與其抑制ICAM-1表達的能力呈正相關，從而為研究HDL結(jié)構(gòu)變化影響其抗炎作用的機制提供了新的思路。

我們的研究提示，糖尿病和冠心病患者的HDL功能減弱甚至消失，不僅與其血液濃度相關，與其結(jié)構(gòu)改變更加關系密切。因此，單純提高HDL-C的血漿水平并不能改善心血管風險。此外，糖尿病患者HDL的抗炎作用減弱較CHD患者更為突出，探索糖尿病與冠心病患者HDL結(jié)構(gòu)的差異有助于進一步闡明影響HDL功能的結(jié)構(gòu)因素。在糖尿病和冠心病患者心血管事件的風險預測方面，HDL中的SAA含量可能成為有提示意義的指標。

本實驗的局限性在于因為實驗室提取和純化脂蛋白的過程復雜、耗資較大，限制了本研究的樣本規(guī)模，下一步可擴大樣本規(guī)模繼續(xù)研究，還可進一步深入研究SAA影響HDL抗炎作用的生物學機制，探討降脂藥物對SAA含量以及HDL功能的影響，通過基礎與臨床緊密結(jié)合的研究，將對疾病的預防和治療產(chǎn)生重要影響。