莫西沙星對(duì)耐藥葡萄球菌生物膜體外藥效學(xué)研究

姜?jiǎng)?，陳向東，汪 輝，李 魁，范 璐，王素霞

中國(guó)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 微生物教研室，南京 210009

細(xì)菌生物膜（bacterial biofilms）是微生物分泌的胞外多聚基質(zhì)將自身覆蓋而形成的微生物聚集體結(jié)構(gòu)，是相對(duì)于浮游菌而言的一種自我保護(hù)性生長(zhǎng)模式，能有效促進(jìn)微生物粘附于固相物表面，使微生物對(duì)抗生素的敏感性降低，還可使其逃逸機(jī)體的免疫系統(tǒng)，是臨床中引起持續(xù)慢性感染疾病的最主要原因之一[1-3]。葡萄球菌是社區(qū)性感染和醫(yī)院獲得性感染的最主要致病菌之一，其導(dǎo)致的感染發(fā)病率逐年增加，尤其是耐甲氧西林表皮葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus epidermidis，MRSE）和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的感染已成為全球性問(wèn)題[4]。MRSE和MRSA引起的治療難度加大的一部分原因是與其形成生物膜有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)探究了新一類氟喹諾酮類化學(xué)治療藥莫西沙星對(duì)4株臨床分離的耐藥葡萄球菌生物膜的體外活性，以及該藥與局部用藥瑞他帕林（retapamulin）的體外聯(lián)合應(yīng)用的效果。

1 材 料

1.1 菌株

臨床分離產(chǎn)生物膜耐藥菌株4株（MRSE12、MRSE19、MRSA45、MRSA53）、 質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC 29213均由中國(guó)藥科大學(xué)微生物教研室提供。

1.2 藥品與試劑

莫西沙星（拜耳醫(yī)藥保健有限公司）；瑞他帕林（北京世紀(jì)邁勁生物科技有限公司）；結(jié)晶紫（天津化學(xué)試劑研究所）；冰乙酸 （南京化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水甲醇（江蘇漢邦科技有限公司生產(chǎn)）；無(wú)水乙醇、氯化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基、胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、MH肉湯培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基，均購(gòu)自北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司。

1.3 主要儀器

高壓滅菌鍋 （日本Hirayma儀器有限公司）；GHX-9080B-1恒溫培養(yǎng)箱 （上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)伯樂(lè)有限公司公司）；超聲儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；96孔板（康寧公司）。

2 方 法

2.1 體外抗浮游菌活性測(cè)定

采用2012版美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的微量肉湯稀釋法測(cè)定MIC。采用倍比稀釋法制備不同濃度藥液，使96孔板中的藥物終濃度為0.03、0.06、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 mg·L-1，質(zhì)控菌株為ATCC 29213，每孔菌液終濃度為105cfu·mL-1，37℃培養(yǎng) 18 h，觀察結(jié)果。 肉眼未見(jiàn)渾濁的最低藥物濃度即為最低抑菌濃度（MIC）[5]。

2.2 體外抗生物膜活性測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)所選用的4株耐藥葡萄球菌經(jīng)剛果紅平板法以及生物膜半定量法確定為產(chǎn)細(xì)菌生物膜菌株[6-7]。接菌于含1%葡萄糖的胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSBG）中，過(guò)夜培養(yǎng)，調(diào)菌濃度至約 1×107cfu·mL-1，取菌液200 μL加入到96孔板中，37℃孵育24 h，用生理鹽水洗滌3次除去浮游菌后，制備體外細(xì)菌生物膜模型。加入200 μL含系列濃度藥物的MH肉湯，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。肉眼未見(jiàn)渾濁的最低藥物濃度即為最低抑制生物膜濃度（MBIC）[8]。

測(cè)定MBIC后，對(duì)肉眼觀察無(wú)渾濁的孔中，棄去含有藥物的MH肉湯，用生理鹽水洗滌3次，加入200μL的無(wú)藥物的MH肉湯，37℃繼續(xù)孵育20～24h，觀察完全摧毀生物膜的最低藥物濃度（MBEC），即肉眼觀察仍未渾濁的最低藥物濃度[9-10]。

2.3 莫西沙星對(duì)生物膜形成量的影響[5，7]

96孔板體外制備細(xì)菌生物膜模型后，加入含藥物的 TSBG，使藥物終濃度分別為 2×MIC、4×MIC、8×MIC和16×MIC，空白對(duì)照為不含藥物的肉湯培養(yǎng)基，每株菌重復(fù)4孔，37℃培養(yǎng)24 h。采用生物膜半定量法進(jìn)行測(cè)定：棄去培養(yǎng)物，用200 μL生理鹽水每孔洗滌3次，每孔加入200 μL 99%的甲醇固定15 min后，每孔再加入0.2 mL用20%乙醇配制的2%（w/v）結(jié)晶紫，染色5 min，用流水沖去未附著的結(jié)晶紫。室溫干燥后，加入160 μL的33%（v/v）的冰乙酸在室溫下靜置1 h進(jìn)行復(fù)溶，用酶標(biāo)儀測(cè)定A570。不同藥物濃度下，細(xì)菌生物膜形成百分比（the percentages of biofilm formed）計(jì)算公式如下：

P=（A/A0）×100%

A為藥物處理孔的吸光值；A0為空白對(duì)照孔的吸光值

2.4 對(duì)生物膜存活菌的影響

96孔板體外制備細(xì)菌生物膜模型后，加入含有藥物的TSBG,藥物終濃度分別為2、10、50和100倍MIC，空白為不含藥物的TSBG。培養(yǎng)24 h后，棄去液體培養(yǎng)物，用生理鹽水洗滌3次后，加入200 μL TSBG，用槍頭刮下孔壁和底部的生物膜，40 kHz超聲 5 min，取 100 μL 進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)[9，11]。

2.5 與瑞他帕林聯(lián)合抗生物膜作用

生物膜協(xié)同試驗(yàn)采用微量稀釋棋盤法（microdilution checkerboard method）。體外制備細(xì)菌生物膜，加入160 μL MH肉湯后，加入20 μL系列梯度濃度的莫西沙星和20 μL瑞他帕林。2種藥物在孔中的終濃度為 0.0078～64 mg·L-1，37 ℃培養(yǎng) 24 h，測(cè)定兩種藥物的聯(lián)合抗生物膜分?jǐn)?shù)（MBIC）。計(jì)算瑞他帕林-莫西沙星對(duì)4株葡萄球菌的FBICs。FBIC計(jì)算公式如下：

A：藥物 A；B：藥物 B；c：聯(lián)用用藥；a：?jiǎn)为?dú)用藥

FBIC≤0.5，A、B 兩藥協(xié)同；0.5＜FBIC≤1，A、B兩藥部分協(xié)同；1＜FBIC≤4，A、B 兩藥無(wú)關(guān)；FBIC＞4，A、B 兩藥拮抗[12]。

3 結(jié) 果

3.1 體外抗浮游菌活性測(cè)定

莫西沙星、瑞他帕林對(duì)4株臨床耐藥葡萄球菌的MIC測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 2種抗生素對(duì)4株葡萄球菌的MIC的測(cè)定結(jié)果/mg·L-1

3.2 MBIC和MBEC測(cè)定結(jié)果

莫西沙星、瑞他帕林的MBIC、MBEC的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。莫西沙星對(duì)4株臨床耐藥葡萄球菌的MBIC 范圍為 0.25～2 mg·L-1，為 MIC 的 1～4 倍；瑞他帕林的 MBIC 范圍為 0.25～0.5 mg·L-1，為 MIC 的 1～2倍。莫西沙星的MBEC范圍是16～256mg·L-1，為MIC的 64～4096倍；瑞他帕林的 MBEC 為 64～＞128 mg·L-1，為 MIC的 256～＞512倍。 莫西沙星對(duì) MRSE12、MRSE19、MRSA53的 MBEC 是 MIC 的 64～512倍，對(duì)MRSA45的MBEC約為MIC的4000倍。瑞他帕林對(duì) MRSE12、MRSE19、MRSA53 的 MBEC 是 MIC的256倍，對(duì)MRSA45的MBEC是大于512倍MIC。

3.3 藥物對(duì)生物膜形成百分比的影響

藥物對(duì)MRSE12生物膜形成百分比的結(jié)果見(jiàn)圖1（A），對(duì)MRSA45生物膜形成百分比的結(jié)果見(jiàn)圖1（B）。莫西沙星和瑞他帕林都在2×MIC顯著降低生物膜的形成量。對(duì)MRSE12，莫西沙星和瑞他帕林的藥物濃度增加對(duì)生物膜形成的影響不明顯，分別約為41%和35%；而對(duì)MRSA45，莫西沙星對(duì)生物膜形成的抑制呈濃度依賴性，但在8×MIC、16×MIC時(shí)，生物膜形成百分比都約為26%；瑞他帕林濃度對(duì)生物膜形成的影響不明顯，生物膜形成百分比都約為18%。

圖1 藥物在2、4、8、16倍MIC濃度作用下對(duì)MRSE12（ A）和 MRSA45（ B）生物膜形成量百分比

3.4 對(duì)生物膜存活菌的影響

莫西沙星對(duì)生物膜存活菌的影響見(jiàn)表3。對(duì)MRSE12，莫西沙星在2×MIC時(shí)，存活菌數(shù)顯著降低， 在 10×MIC、50×MIC 和 100×MIC 作用下的存活菌數(shù)趨于一致，約為4.57 log10cfu·mL-1；對(duì) MRSA45，莫西沙星在50×MIC時(shí)，存活菌數(shù)明顯降低，在50×MIC、100×MIC作用下的存活菌數(shù)相似，約為5.56 log10cfu·mL-1。 莫西沙星在 100×MIC作用 24 h后，MRSE12和MRSA45的生物膜存活數(shù)明顯降低了 1.92、1.40 log10cfu·mL-1。

表3 莫西沙星對(duì)MRSE12和MRSA45生物膜的影響

3.5 與瑞他帕林聯(lián)合抗生物膜作用

莫西沙星與局部抗生素瑞他帕林對(duì)MRSE12、MRSE19、MRSA45、MRSA53 的 FBICs 都 小 于 1.0，分別為0.75、0.56、0.36和0.75，可見(jiàn)莫西沙星與瑞他帕林在體外進(jìn)行聯(lián)合用藥時(shí)表現(xiàn)出協(xié)同作用和部分協(xié)同作用，無(wú)拮抗作用。

4 討 論

莫西沙星和瑞他帕林對(duì)4株臨床耐藥葡萄球菌的MBIC為MIC的1～4倍，則兩種藥物對(duì)葡萄球菌生物膜都有很好地抑制作用。MBEC代表完全摧毀生物膜的最低藥物濃度，莫西沙星對(duì)MRSA45的MBEC大于4000倍的MIC，推測(cè)MRSA45可能為強(qiáng)生物膜菌，明顯降低了藥物的滲透性，增加了對(duì)藥物的耐藥性。因此，莫西沙星摧毀耐藥葡萄球菌生物膜的作用強(qiáng)弱具有菌株特異性，可能與菌株的生物膜形成能力強(qiáng)弱有關(guān)。

莫西沙星和瑞他帕林都可降低葡萄球菌生物膜形成量，可見(jiàn)兩種藥物都能抑制生物膜的形成。但在一定藥物濃度范圍（2～16）×MIC內(nèi)，生物膜的形成量與藥物濃度無(wú)關(guān)，可能是生物膜降低了藥物的滲透性。然而，生物膜檢測(cè)的96孔半定量法只能反映生物膜的總量，不能確定其中的存活菌數(shù)。因此，需要通過(guò)活菌計(jì)數(shù)來(lái)確定藥物對(duì)生物膜存活菌的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，莫西沙星在100×MIC時(shí)可明顯降低生物膜中存活菌數(shù)。當(dāng)藥物濃度范圍在 （10～100）×MIC時(shí)，藥物濃度對(duì)生物膜存活菌數(shù)影響不明顯，推測(cè)藥物在這個(gè)濃度范圍內(nèi)，生物膜降低了藥物的滲透性，使高濃度藥物表現(xiàn)出低濃度的殺菌效果[11]。生物膜最后在MBEC的作用下被完全摧毀，說(shuō)明生物膜對(duì)莫西沙星存在一個(gè)較大的耐受濃度范圍。

局部抗生素瑞他帕林在局部損傷部位可達(dá)到較高藥物濃度，其軟膏可使藥物保持高濃度狀態(tài)，所以能有效阻止和治療局部感染[13]。瑞他帕林通過(guò)抑制肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性來(lái)殺滅微生物，與莫西沙星抑制DNA解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的作用機(jī)制不同[14-15]。因而測(cè)定莫西沙星和瑞他帕林的聯(lián)合抗生物膜作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，兩者藥效學(xué)方面相互作用為協(xié)同作用。因此，可以考慮莫西沙星與局部用藥瑞他帕林一起聯(lián)合用于治療局部葡萄球菌生物膜相關(guān)感染。

綜上所述，體外研究證明莫西沙星對(duì)臨床耐藥葡萄球菌生物膜活性具有抑制和摧毀作用，而且與局部用藥瑞他帕林具有協(xié)同作用，兩者可以進(jìn)行聯(lián)合用藥。

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