不同原料厭氧發(fā)酵及其微生物種群的研究

李海紅，巴琦玥，閆志英，劉曉風（.西安工程大學環(huán)境科學系，陜西 西安 70048；.中國科學院環(huán)境與應(yīng)用微生物重點實驗室，四川 成都 6004）

不同原料厭氧發(fā)酵及其微生物種群的研究

李海紅1，巴琦玥1，閆志英2*，劉曉風2（1.西安工程大學環(huán)境科學系，陜西 西安 710048；2.中國科學院環(huán)境與應(yīng)用微生物重點實驗室，四川 成都 610041）

使用PCR-DGGE技術(shù)，對以雞糞、豬糞、牛糞、秸稈為發(fā)酵原料的發(fā)酵體系的微生物群落多樣性進行了研究.在發(fā)酵不同時間取樣，進行了日產(chǎn)甲烷量、日產(chǎn)甲烷濃度的變化分析和DGGE分析.結(jié)果表明，日產(chǎn)甲烷量整體趨勢為豬糞＞雞糞＞秸稈＞牛糞，日平均產(chǎn)甲烷量分別為2.67、2.24、0.99、0.49L；豬糞、雞糞、秸稈的日產(chǎn)甲烷濃度在整個發(fā)酵周期大多可維持在50%以上，牛糞的日產(chǎn)甲烷濃度大部分時間低于30%；細菌的優(yōu)勢菌群有擬桿菌屬（Bacteroidetes）、密螺旋體屬（Treponema）、厭氧繩菌科（Anaerolineaceae）等，新增優(yōu)勢菌群有梭菌屬（Clostridium）、脫硫葉菌屬（Desulfobulbus）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、醋弧菌屬（Acetivibrio）；古菌的優(yōu)勢菌群有甲烷鬃菌屬（Methanosaeta）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales），新增優(yōu)勢菌群有斯氏甲烷球菌屬（Methanosphaera stadtmanae）.

雞糞；豬糞；牛糞；秸稈；厭氧發(fā)酵；PCR-DGGE；菌群多樣性

禽畜糞便和農(nóng)作物秸稈是我國主要的兩大類生物質(zhì)資源，2009年中國畜禽養(yǎng)殖業(yè)糞便排放總量為32.64億t鮮重，其資源沼氣潛力約1200億m3［1］.厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣技術(shù)實現(xiàn)了畜禽廢棄物生物質(zhì)的能源轉(zhuǎn)化，厭氧發(fā)酵的過程由多種微生物協(xié)同作用完成，主要分為產(chǎn)乙酸菌（細菌）和產(chǎn)甲烷菌（古菌）兩大微生物群落，以共營養(yǎng)形式相互聯(lián)系［2］.傳統(tǒng)微生物學分析方法因其局限性很難對環(huán)境中的微生物進行深入研究［3］，隨著分子生物學的迅速發(fā)展，基于16S rDNA基因的分子生物學方法被廣泛運用于復雜微生物種群的研究中［4-6］，國內(nèi)學者也運用這些技術(shù)對魚腸道和厭氧顆粒污泥微生物種群、塔式蚯蚓生態(tài)濾池微生物群落結(jié)構(gòu)進行了研究，并取得了一定的成果［7-9］.本研究采用5L厭氧發(fā)酵裝置，分別以雞糞、豬糞、牛糞、水稻秸稈為發(fā)酵原料進行連續(xù)式厭氧發(fā)酵，利用PCR-DGGE（聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳）技術(shù)研究發(fā)酵過程中古菌和細菌種群結(jié)構(gòu)的差異，并對DGGE圖譜中的優(yōu)勢條帶切膠回收進行測序，結(jié)合反應(yīng)器的工藝條件對結(jié)果進行分析和討論，以期為不同原料產(chǎn)沼氣以及提高產(chǎn)氣效率提供分子生物依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

水稻秸稈取自成都郊區(qū)某農(nóng)村，用粉碎機粉碎后待用.新鮮的雞糞、豬糞、牛糞分別取自成都雙流某養(yǎng)雞場、養(yǎng)豬場及奶牛場，剔除雜物后置于4℃冰柜待用.接種物為本實驗室中溫厭氧發(fā)酵富集馴化的發(fā)酵液.發(fā)酵原料基本性質(zhì)見表1.

表1 原料和接種物的特性Table 1 Characteristics of materials and inoculum

1.2 實驗設(shè)計

表2 連續(xù)厭氧消化實驗設(shè)計（g）Table 2 Experimental design of anaerobic digestion（g）

設(shè)置4組連續(xù)厭氧消化實驗，發(fā)酵原料分別為雞糞、豬糞、秸稈、牛糞，在35℃條件下運行，反應(yīng)器為有機玻璃制成，有效容積5L.發(fā)酵體系的TS（總固體）濃度始終為6%，水力停留時間為30d，每天的進料量見表2.

每天在相同時刻進行進出料并測定產(chǎn)甲烷量以及產(chǎn)甲烷濃度，進料前后分別攪拌20min，在發(fā)酵的第3、9、21、27d分別取樣于-20℃冰箱保存，實驗結(jié)束后對所取樣品集中處理進行DGGE分析.

1.3 分析方法

總固體（TS）、揮發(fā)性固體（VS）含量采用常規(guī)方法測定［10］，C質(zhì)量分數(shù)、N質(zhì)量分數(shù)、碳氮比用碳氮分析儀測定，產(chǎn)氣量用氣袋法收集后用北京合百意燃氣計量表測量，氣體成分用安捷倫7890A 氣相色譜測定.

1.4 基因組總DNA的提取

DNA的提取采用自己改進后的手提研磨法［11］.

1.5 PCR擴增

擴增對象為16S rDNA的V3可變區(qū)對于細菌，引物為518R（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'）和341F（5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3'）；對于古菌，引物為518R（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'）和109F（5'-ACGGCTCAGTAACACGT-3'）；為提高DGGE分辨效率，在518R的5'端加GC夾（-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGCACGGGGGG-）［12-14］.

PCR反應(yīng)體系:天根Mastermix 12.5μL，引物各1μL，模板1μL，補加無菌ddH2O至25μL，PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

細菌PCR反應(yīng)條件:94℃預變性4min，然后94℃變性45s，55℃退火40s，72℃延伸45s，最后72℃保溫7min，30個循環(huán).

古菌PCR反應(yīng)條件:94℃預變性4min，然后94℃變性1min，56℃退火37s，72℃延伸1min，最后72℃保溫10min，35個循環(huán).

1.6 變性梯度凝膠電泳（DGGE）

在INGENY phorU- 2Dcode Universal Mutation system 上進行DGGE分析，聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，細菌和古菌的變性劑濃度范圍分別是45%～60%和35%～50%，在1×TAE緩沖液中，以200V電壓，60℃預電泳10min，然后以90V電壓，60℃恒溫電泳12h.電泳結(jié)束后，進行硝酸銀染色［15］并拍照.用Quantity One 軟件對DGGE圖譜進行分析.

1.7 DGGE條帶回收及序列分析

選擇DGGE圖譜中條帶清晰的優(yōu)勢帶，切膠并溶于30μL滅菌ddH2O中，4℃過夜，然后取1μL做模板進行PCR反應(yīng)，引物不帶GC“夾子”外，反應(yīng)條件同上.產(chǎn)物直接送上海生物工程測序，登陸NCBI （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/），將測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行比對分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 日產(chǎn)甲烷量

甲烷的產(chǎn)氣量是厭氧消化過程中一個重要參數(shù)，能直觀反映厭氧消化系統(tǒng)的產(chǎn)氣性能.是判斷厭氧消化過程好壞的重要依據(jù).圖1為不同發(fā)酵原料的日產(chǎn)甲烷量.

圖1 多種原料日產(chǎn)甲烷量Fig.1 Daily methane production of different materials

從圖1可以看出，日產(chǎn)甲烷量整體趨勢呈現(xiàn)出豬糞＞雞糞＞秸稈＞牛糞.豬糞的平均日產(chǎn)甲烷量為2.67L，發(fā)酵的前10d日產(chǎn)甲烷量不穩(wěn)定，產(chǎn)氣量先呈下降趨勢然后穩(wěn)步回升，后20d的日產(chǎn)甲烷量比較穩(wěn)定，產(chǎn)氣最高峰出現(xiàn)在第23d，為3.57L；雞糞的平均日產(chǎn)甲烷量為2.24L，前24d的日產(chǎn)甲烷量整體呈現(xiàn)出穩(wěn)步上升的趨勢，然后小幅回落，產(chǎn)氣最高峰出現(xiàn)在第24d，為3.1L；秸稈的平均日產(chǎn)甲烷量為0.99L，前11d產(chǎn)氣量穩(wěn)定，然后產(chǎn)氣量穩(wěn)步回升，從第17d開始產(chǎn)氣量繼續(xù)保持平穩(wěn)狀態(tài)，產(chǎn)氣最高峰出現(xiàn)在第28d，為1.8L；牛糞的平均日產(chǎn)甲烷量為0.49L，發(fā)酵的前9d產(chǎn)氣量一直呈現(xiàn)下降趨勢，之后產(chǎn)氣量穩(wěn)定沒有出現(xiàn)明顯波動，產(chǎn)氣最高峰出現(xiàn)在第1d，為1.54L.秸稈的纖維素、木質(zhì)素含量高，降解緩慢，大分子的水解作用是整個過程的限速步驟，因此發(fā)酵啟動期較長［16］.牛糞的日產(chǎn)甲烷量一直處于較低的水平，可能與奶牛飼養(yǎng)過程中口服抗生素抑制了牛糞的微生物活性有關(guān).

2.2 日產(chǎn)甲烷濃度

根據(jù)產(chǎn)氣中甲烷的百分含量可判斷厭氧發(fā)酵中占優(yōu)勢的是酸化反應(yīng)還是甲烷化反應(yīng)，當甲烷含量等于或者高于50%時，甲烷化反應(yīng)占優(yōu)勢［17］.圖2為不同發(fā)酵原料的日產(chǎn)甲烷濃度.

圖2 不同原料日產(chǎn)甲烷濃度Fig.2 Daily methane concentration of different materials

從圖2可以看出，日產(chǎn)甲烷濃度整體趨勢呈現(xiàn)出豬糞＞雞糞＞秸稈＞牛糞.豬糞和雞糞的日產(chǎn)甲烷濃度在整個發(fā)酵周期沒有發(fā)生大的波動，基本都維持在50%以上；秸稈的日產(chǎn)甲烷濃度波動較大，前9d呈現(xiàn)下降趨勢，緊接著穩(wěn)步回升后再次出現(xiàn)回落，從第20d開始濃度基本維持在47%左右；牛糞的日產(chǎn)甲烷濃度前9d波動不大，基本維持在53%左右，之后一直呈下降趨勢，從第16d開始濃度波動不大，基本維持在27%左右.牛糞的日產(chǎn)甲烷濃度大部分時間低于30%，且產(chǎn)甲烷量也不高，說明整個發(fā)酵體系有酸化現(xiàn)象.總體來說，各發(fā)酵原料的產(chǎn)甲烷濃度變化與產(chǎn)甲烷量的變化趨勢基本保持一致.

2.3 樣品細菌的DGGE分析

2.3.1 細菌16S rDNA片段V3區(qū)PCR擴增以不同發(fā)酵原料中提取的DNA為模板擴增出細菌16S rDNA V3區(qū)片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標產(chǎn)物大小約180bp，與預計大小一致，條帶清晰明亮，滿足后續(xù)實驗要求.

2.3.2 不同發(fā)酵原料細菌DGGE圖譜及特征條帶序列分析 不同發(fā)酵原料細菌16S rDNA V3區(qū)PCR產(chǎn)物的DGGE電泳指紋圖譜見圖3.圖3中條帶的位置和數(shù)量反映了樣品中菌群的多樣性，條帶的亮度反映了該條帶所代表菌群的豐度［18-19］，條帶數(shù)目及強度與微生物的種類及相對含量成正比［20］.從圖3可以看出，在發(fā)酵初期，條帶數(shù)目和位置變化不大，表明各發(fā)酵體系微生物群落結(jié)構(gòu)可能比較穩(wěn)定.從第15d開始，雞糞、秸稈、牛糞發(fā)酵體系的條帶數(shù)目明顯增多，在不同的位置出現(xiàn)了新增條帶，而之前的一些優(yōu)勢條帶的顏色深度有所變淺，條帶a、b、e、g、h、i均為新出現(xiàn)的新增條帶，表明以上3個發(fā)酵體系在這一時期微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變.第21、27d各原料發(fā)酵體系的條帶位置及數(shù)目相對穩(wěn)定沒有發(fā)生大的變化，表明原先的微生物群落經(jīng)過一定時間的調(diào)節(jié)和演替形成了一個新的比較穩(wěn)定的微生物群落.豬糞發(fā)酵體系的條帶及數(shù)目在整個發(fā)酵過程中始終沒有發(fā)生大的改變，這可能與采用豬糞接種物有關(guān)，由于發(fā)酵原料相同，因此對原先的微生物群落沖擊不大，這也解釋了為什么豬糞發(fā)酵體系產(chǎn)甲烷量及產(chǎn)甲烷濃度可以始終保持穩(wěn)定.從第9d起，秸稈的條帶改變最大，有很多新增條帶出現(xiàn)，原先的優(yōu)勢條帶的顏色也有所變淺，與此同時，秸稈發(fā)酵體系的產(chǎn)甲烷量以及產(chǎn)甲烷濃度開始回增直至達到一個穩(wěn)定的狀態(tài).牛糞的條帶數(shù)目、顏色深度和其他發(fā)酵體系相比都比較少、比較淺，表明它的微生物相對含量以及群落生物多樣性比較低，這也解釋了為什么牛糞發(fā)酵體系的產(chǎn)甲烷量及產(chǎn)甲烷濃度始終保持低水平.

圖3 不同發(fā)酵原料細菌PCR-DGGE指紋圖譜Fig.3 16S rDNA PCR-DGGE gene patterns of bacterial about different materials

圖4 不同發(fā)酵原料細菌聚類分析Fig.4 Cluster analysis of bacterial about different materials

通過UPGMA聚類算法對細菌DGGE圖譜進行分析，生成系統(tǒng)進化樹，由圖4可以看出，屬于雞糞原料的5個樣品被聚類到一支，其細菌群落結(jié)構(gòu)的相似程度在71%以上，結(jié)構(gòu)變化相對不明顯；豬糞在發(fā)酵各階段相似性基本在80%以上，群落結(jié)構(gòu)差異不明顯；秸稈15#樣品獨分一支，與其它發(fā)酵原料的相似程度僅有50%，而且在不同的發(fā)酵時期被聚到不同的分支，說明秸稈發(fā)酵系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)不斷變化；牛糞17#樣品與該原料其它發(fā)酵時期相似性較低，之后的相似性均在85%以上，說明群落結(jié)構(gòu)在發(fā)酵中期發(fā)生過一次波動，調(diào)整后趨于穩(wěn)定.

從圖3中選取11個條帶進行切膠克隆送至上海生物工程測序，所測序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov），并將測序結(jié)果通過BLAST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫（http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中查找比對，測序結(jié)果見表3.在所有11個條帶中，除了條帶b、e、i外，其余條帶與對比序列的相似度在99%以上，大多數(shù)為不可培養(yǎng)的細菌，包括梭菌屬（Clostridium）、擬桿菌屬（Bacteroidetes）、密螺旋體屬（Treponema）、厭氧繩菌科（Anaerolineaceae）、厚壁菌門（Firmicutes）等，其余部分屬于脫硫葉菌屬（Desulfobulbus）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、醋弧菌屬（Acetivibrio）.Islam等［21］在相關(guān)研究中指出，梭菌屬（Clostridium）、擬桿菌屬（Bacteroidetes）在厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫中發(fā)揮了重要作用.Ducey等［22］用新一代DNA測序法測定豬場廢水厭氧消化池微生物群落多樣性，其中脫硫葉菌屬（Desulfobulbus）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、醋弧菌屬（Acetivibrio）與測得的部分菌群有極高的相似性. Zhang等［23］在秸稈沼氣發(fā)酵反應(yīng)器中微生物群落特征研究中表明厚壁菌門（Firmicutes）變形菌門（Proteobacteria）與擬桿菌門（Bacteroidetes）為優(yōu)勢種群. Acetivibrio sp.多分離于垃圾污泥和豬糞中，成對或鏈排列，連體運動，中溫生長，最適生長溫度是35℃，化能有機營養(yǎng)，發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乙酸，其他可能的產(chǎn)物有乙醇、CO2和H2，但不產(chǎn)生丙酸和乳酸.解纖維醋弧菌（Acetivibrio cellulolyticus）對于發(fā)酵液中的不良環(huán)境有較好的耐受和調(diào)節(jié)能力，對揮發(fā)酸的生成起著重要作用［24］. 厚壁菌門（Firmicutes），該門細菌已在厭氧消化污泥廢水處理反應(yīng)器、玉米秸稈厭氧反應(yīng)器、餐廚垃圾厭氧反應(yīng)器中、糞便等環(huán)境中被大量發(fā)現(xiàn)過，主要進行纖維素降解有機物水解長鏈脂肪酸降解，生成小分子物質(zhì)［23］，厚壁菌門（Firmicutes）中的Clostridium jejujuense分離自土壤，主要生長在中溫厭氧環(huán)境中，最適生長溫度為30℃， pH值為7.0，可以利用纖維素阿拉伯糖乳糖木糖葡萄糖等最終生成丙酸醋酸甲酸和氫［25］.擬桿菌門（Bacteroidetes）主要分離自海底腸道厭氧反應(yīng)器等厭氧環(huán)境，有降解大分子碳水化合物產(chǎn)酸的功能.

表3 DGGE條帶克隆測序結(jié)果Table 3 Sequence of cloned DGGE bands

2.3.3 不同發(fā)酵原料細菌群落多樣性分析 Shannon-Wiener指數(shù)（H）反映了細菌菌群多樣性的高低，不同發(fā)酵原料細菌菌群的多樣性指數(shù)見圖5.從圖5中可知，雞糞的多樣性指數(shù)介于3.59～3.73，豬糞的多樣性指數(shù)介于3.5～3.8，秸稈的多樣性指數(shù)介于3.4～3.63，牛糞的多樣性指數(shù)介于3.45～3.56，雞糞的細菌多樣性指數(shù)整體最高，牛糞的細菌多樣性指數(shù)整體最低.除了豬糞，其它發(fā)酵原料的多樣性指數(shù)在發(fā)酵初期均呈現(xiàn)下降趨勢，由于接種物和發(fā)酵原料的群落結(jié)構(gòu)有差異，當二者作用在一起時，各自原有的穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)被擾亂，不適應(yīng)新環(huán)境的微生物被淘汰，微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；發(fā)酵中期多樣性指數(shù)緩慢增加，可能內(nèi)部微生物種群已經(jīng)完成更替，一個相對穩(wěn)定的新種群建立；在發(fā)酵后期，多樣性指數(shù)再次出現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于采用的是連續(xù)進料發(fā)酵方法，有機物積累量增大，超過了微生物的代謝能力，氨氮等其它有毒物質(zhì)也隨之積累，部分微生物菌群不易生長，從而導致群落多樣性指數(shù)下降.

圖5 不同發(fā)酵原料細菌菌群多樣性分析Fig.5 Diversity index of bacterial about different materials

2.4 樣品古菌的DGGE分析

2.4.1 古菌16S rDNA片段V3區(qū)PCR擴增 以不同發(fā)酵原料中提取的DNA為模板擴增出古菌16S rDNA V3區(qū)片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標產(chǎn)物大小約400bp，與預計大小一致，條帶清晰明亮，滿足后續(xù)實驗要求.

2.4.2 不同發(fā)酵原料古菌DGGE圖譜及特征條帶序列分析分析 不同發(fā)酵原料古菌16S rDNA V3區(qū)PCR產(chǎn)物的DGGE電泳指紋圖譜見圖6.從圖6上可以看出，從發(fā)酵中期開始，各發(fā)酵系統(tǒng)的條帶數(shù)目及位置都發(fā)生了很大的變化，之前部分優(yōu)勢條帶顏色變淡或消失，均出現(xiàn)了許多新增條帶.其中，雞糞的條帶數(shù)目及位置變化最大，出現(xiàn)了很多的新增條帶，表明這些新增微生物菌群可能是從雞糞中帶入的，之后建立起一個新的穩(wěn)定的微生物群落系統(tǒng)，由于微生物多樣性增加，因此雞糞發(fā)酵體系的產(chǎn)甲烷量呈現(xiàn)穩(wěn)步上升趨勢的原因.豬糞發(fā)酵體系條帶數(shù)目及位置變化不大，始終保持一個穩(wěn)定的狀態(tài)，這可能與采用豬糞接種物有關(guān)，由于發(fā)酵原料相同，因此對原先的微生物群落沖擊不大，從而豬糞發(fā)酵體系產(chǎn)甲烷量及產(chǎn)甲烷濃度可以始終保持穩(wěn)定.牛糞發(fā)酵體系的條帶及數(shù)目和發(fā)酵初期相比減少很多，而牛糞的產(chǎn)甲烷量及產(chǎn)甲烷濃度一直處于下降趨勢，表明發(fā)酵體系原有的微生物系統(tǒng)平衡遭到嚴重破壞，始終沒能建立起一個新的穩(wěn)定的微生物群落.

圖6 不同發(fā)酵原料古菌PCR-DGGE 指紋圖譜Fig.6 16S rDNA PCR-DGGE gene patterns of archaea about different materials

通過UPGMA聚類算法對古菌DGGE圖譜進行分析，生成系統(tǒng)進化樹，由圖7可以看出，雞糞發(fā)酵中期和發(fā)酵前期、后期的相似性僅有63%、66%，在發(fā)酵的整個周期相似性差異比較明顯；豬糞古菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高，群落結(jié)構(gòu)變化不明顯；秸稈11#樣品獨分一支，與其它發(fā)酵原料的相似程度僅有60%，而且在不同的發(fā)酵時期被聚到不同的分支，說明秸稈發(fā)酵系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)不斷變化；牛糞發(fā)酵各階段的相似性不高，大多被聚在不同的分支，說明群落結(jié)構(gòu)在不斷變化并進行調(diào)整.

從圖6中選取5個條帶進行切膠克隆送至上海生工測序，所測序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov），并將測序結(jié)果通過BLAST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/blast）中查找比對，測序結(jié)果見表4.在所有6個條帶中，除了條帶a外，其余條帶與對比序列的相似度在98%以上.包括不可培養(yǎng)古菌甲烷鬃菌屬（Methanosaeta）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales），其余部分屬于兔甲烷球菌屬（Methanosphaeracuniculi）、斯氏甲烷球菌屬（Methanosphaera stadtmanae）.產(chǎn)甲烷菌群是整個沼氣發(fā)酵的重中之重，嚴格專性厭氧，甲烷球菌屬于食氫產(chǎn)甲烷菌，甲烷八疊球菌和斯氏甲烷球菌屬于食乙酸產(chǎn)甲烷菌［28］.Zhang等［23］在秸稈沼氣發(fā)酵反應(yīng)器中微生物群落特征研究中表明秸稈反應(yīng)器中甲烷鬃菌屬（Methanosaeta）為優(yōu)勢種群，相對豐度為69.2%～71.9%，在秸稈中添加豬糞的反應(yīng)器中，甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）為優(yōu)勢種群，相對豐度為73.1%，甲烷鬃菌屬（Methanosaeta），屬于極端嚴格厭氧菌，最適生長溫度為40℃，可利用氫氣或甲酸鹽，還原二氧化碳生成甲烷，不能利用乙酸和甲基胺，在富含纖維的原料厭氧消化中發(fā)揮著重要作用.何志剛等［26］在研究牛糞沼氣產(chǎn)甲烷菌多樣性時，甲烷八疊球菌（Methanosarcina sp.）為優(yōu)勢微生物，占總數(shù)的42%.甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）是僅能的以乙酸為代謝底物產(chǎn)甲烷的菌屬，同時也是地球生物圈CH4來源最大的貢獻者，甲烷巴疊球菌科（Methanosarcinaceae）的其他物種均可利用甲醇和甲胺產(chǎn)甲烷［27］.

圖7 不同發(fā)酵原料古菌聚類分析Fig.7 Cluster analysis of archaea about different materials 1～5:雞糞；6～10:豬糞；11～15:秸稈；16～20:牛糞

表4 DGGE條帶克隆測序結(jié)果Table 4 Sequence of cloned DGGE bands

圖8 不同發(fā)酵原料古菌PCR-DGGE指紋圖譜Fig.8 Diversity index of archaea about different materials

2.4.3 不同發(fā)酵原料古菌群落多樣性分析 不同發(fā)酵原料古菌菌群的多樣性指數(shù)見圖8.從圖8可知，雞糞的多樣性指數(shù)介于3.03～3.55，豬糞的多樣性指數(shù)介于3.31～3.47，秸稈的多樣性指數(shù)介于3～3.47，牛糞的多樣性指數(shù)介于3.26～3.45.雞糞和秸稈的多樣性指數(shù)期初較低，后來有明顯升高的趨勢，表明這兩個發(fā)酵體系的古菌微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化，秸稈的基本成分主要包括木質(zhì)素、纖維素、半纖維素等［29］，微生物首先要將這些大分子有機物降解成小分子有機物后才能提供給產(chǎn)甲烷菌進一步利用，因此秸稈發(fā)酵系統(tǒng)的啟動器較長，發(fā)酵初期微生物群落多樣性指數(shù)比豬糞、牛糞組低；雞糞的氨氮含量高，低質(zhì)量濃度的氨氮可以為微生物生長提供氮源，且有利于維持穩(wěn)定的pH值，但是高質(zhì)量濃度的氨氮會抑制產(chǎn)甲烷［30］，發(fā)酵初期主要是一些硝化細菌利用轉(zhuǎn)化氨氮，因此抑制了甲烷菌的生長.豬糞和牛糞發(fā)酵體系的多樣性指數(shù)變化不大，表明這兩個發(fā)酵體系的古菌群落結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定.

3 結(jié)論

3.1 日產(chǎn)甲烷量整體趨勢為豬糞＞雞糞＞秸稈＞牛糞，它們的日平均產(chǎn)甲烷量分別為2.67、2.24、0.99、0.49L，除了牛糞其他3組的日產(chǎn)氣量都呈現(xiàn)出先緩慢上升最后保持一個相對穩(wěn)定的狀態(tài).日產(chǎn)甲烷濃度整體趨勢為豬糞＞雞糞＞秸稈＞牛糞，豬糞、雞糞、秸稈的日產(chǎn)甲烷濃度在整個發(fā)酵周期大多可維持在50%以上，牛糞的日產(chǎn)甲烷濃度大部分時間低于30%.

3.2 細菌優(yōu)勢菌群有擬桿菌屬（Bacteroidetes）、密螺旋體屬（Treponema）、厭氧繩菌科（Anaerolineaceae）等，新增優(yōu)勢菌群有梭菌屬（Clostridium）、脫硫葉菌屬（Desulfobulbus）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、醋弧菌屬（Acetivibrio）等.雞糞的細菌Shannon-Wiener指數(shù)（H）介于3.59～3.73，豬糞介于3.5～3.8，秸稈介于3.4～3.63，牛糞介于3.45～3.56.

3.3 古菌優(yōu)勢菌群有古菌甲烷桿菌科（Methanobacteriaceae）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales），新增優(yōu)勢菌群有斯氏甲烷球菌屬（Methanosphaera stadtmanae）.雞糞的古菌Shannon-Wiener指數(shù)（H）介于3.03～3.55，豬糞介于3.31～3.47，秸稈介于3～3.47，牛糞介于3.26～3.45.

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Studies on microbial community of different materials and anaerobic fermentation.

LI Hai-hong1， BA Qi-yue1， YAN Zhi-ying2*， LIU Xiao-feng2（1.Department of Environmental Science， Xi'an Polytechnic University， Xi'an 710048，China；2.Key Laboratory of Environmental and Applied Microbiology， Chengdu Institute of Biology， Chinese Academy of Sciences， Chengdu 610041， China）. China Environmental Science， 2015，35（5）：1449～1457

PCR-DGGE analysis was used to study the diversity of the microbial community in different anaerobic fermentation systems using chicken dung， pig manure， cow dung and straw as substrate respectively. Methane biogas production and methane concentration were measured daily. Slurry was sampled at different fermentation stage and used for DGGE analysis. The results showed that the overall trend of daily biogas production appeared pig＞ chicken＞ straw＞cow dung and their average biogas production was 2.67， 2.24， 0.99， 0.49L. Daily methane concentration of pig， chicken manure and straw was above 50% during the whole fermenting period， while the methane concentration of cow was less than 30% most of the time. Dominant bacterial groups were Bacteroidetes， Treponema， Anaerolineaceae and the newly developed bacterial groups were Clostridium， Desulfobulbus， Lachnospiraceae and Acetivibrio. Dominant archaeal groups were Methanobacteriaceae， Methanosarcina and Methanosarcinales. A newly developed group was Methanosphaera stadtmanae.

chicken dung；pig manure；cow dung；straws；anaerobic fermentation；PCR-DGGE；bacterial diversity

X705

A

1000-6923（2015）05-1449-09

李海紅（1971-），女，陜西西安人，教授，碩士，從事固體廢物處理及資源化利用研究.發(fā)表論文14篇.

2014-09-19

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973）項目（2013CB733500）；國家國際科技合作專項項目（2013DFA61260）；四川省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目（2013JY0050）

* 責任作者， 副研究員， Yanzy@cib.ac.cn