香煙提取物對氣道平滑肌細胞增殖作用的研究

管頻，于化鵬，吳智勇，李偉，吳潔

香煙提取物對氣道平滑肌細胞增殖作用的研究

管頻1，2，于化鵬1△，吳智勇2，李偉2，吳潔3

目的探討香煙提取物（CSE）對人氣道平滑肌細胞（ASMCs）增殖以及鈣網(wǎng)織蛋白（CRT）、CCAAT增強子結(jié)合蛋白α（CEBPα）表達的影響及機制。方法（1）通過收集經(jīng)不同濃度CSE處理24 h的ASMCs，分為對照組、2.5%CSE組、5%CSE組、10%CSE組。以MTT法分析各組細胞增殖情況，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測各組細胞CEBPα的mRNA水平；免疫印跡法檢測4組細胞CRT、CEBPα的蛋白水平。（2）在10%CSE組，分別在ASMCs中轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA、CRT的siRNA，比較2組ASMCs的CEBPα、CRT表達及細胞增殖情況。結(jié)果（1）對照組、2.5%CSE組、5%CSE組、10%CSE組ASMCs的CEBPα蛋白表達依次遞減，CRT和細胞增殖程度呈依次增高（P＜0.05）；而CEBPα mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（2）在10%CSE作用下，CRTsiRNA組中ASMCs的CEBPα表達較陰性對照siRNA組增強（P＜0.05），而CRT和細胞增殖程度均較相應(yīng)陰性對照siRNA組減弱（P＜0.05）。結(jié)論CSE可使ASMCs中CRT的表達增強，從而抑制CEBPα mRNA的翻譯，使CEBPα的表達減少，最終促進ASMCs的增殖。

肌細胞，平滑?。患毎鲋常环渭膊?，慢性阻塞性；體外研究；香煙提取物；鈣網(wǎng)織蛋白；CCAAT增強子結(jié)合蛋白

CCAAT增強子結(jié)合蛋白α（CEBPα）廣泛表達于肺、肝臟及骨髓干細胞等，可抑制細胞增殖的活性［1］。Borger等［2］研究顯示，在哮喘患者氣道平滑肌細胞（ASMCs）中CEBPα的表達明顯下調(diào)。Miglino等［3］研究顯示，在體外以室內(nèi)塵螨作用于哮喘患者的ASMCs后，CEBPα的表達受抑制，從而使AMSCs的增殖明顯增加。進一步研究認為，人AMSCs中CEBPα的表達受抑制與鈣網(wǎng)織蛋白（CRT）密切相關(guān)［4］。慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者ASMCs的顯著增生是COPD氣道重塑的基礎(chǔ)之一［5］。體外研究顯示，在香煙提取物（CSE）作用下AMSCs的增殖加速［6］，但具體機制尚未明確。本研究旨在探討CSE促進ASMCs增殖的可能機制，為研究COPD患者的氣道重塑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料原代ASMCs購自美國ScienceCell公司，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，取第4～6代細胞用于后續(xù)實驗；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；羊抗人CEBPα、CRT及內(nèi)參蛋白甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自上海吉泰生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊單克隆抗體、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒、Radio-Immunoprecipitation Assay（RIPA）裂解液、Trizol及DMEM胎牛血清購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。CRT?siRNA、陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒及CEBPα的引物購自上海生工生物有限公司。

1.2 CSE的制備及分組按文獻［7］的方法，將1支3R4F參考香煙（海南醫(yī)學(xué)院熱帶檢驗學(xué)院實驗室贈予）點燃，其過濾嘴端接一根橡皮管，橡皮管的另一端接注射器。收集煙霧注入含25 mL 10%胎牛血清DMEM的玻璃瓶中，搖晃玻璃瓶使煙霧溶入10%胎牛血清DMEM中，即為100%的CSE原液，以0.22 μm微孔濾膜過濾。CSE原液采用10%胎牛血清DMEM稀釋，按照稀釋濃度=CSE原液體積/總體積×100%計算。分別將含2.5%、5%、10%CSE的10%胎牛血清DMEM加入到細胞培養(yǎng)瓶中，即為2.5%CSE組、5%CSE組、10% CSE組，以不加入CSE者設(shè)為對照組。每組設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。

1.3 方法

1.3.1 MTT比色法檢測人ASMCs的增殖程度各組每孔加入5 g/L的四甲基偶氮唑鹽（MTT）20 μL，孵育4 h，1 500 r/min離心10 min，棄上清，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，搖勻，用免疫酶標(biāo)儀（490 nm處）測定各孔培養(yǎng)液光密度（OD490）值。

1.3.2 RT-PCR法測定各組ASMCs中CEBPα mRNA表達各組分別以Trizol抽提細胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。由CEBPα引物（擴增片段210 bp）：上游5′-GGCGGCGACTTTGACTACC-3′；下游5′-CTGCTTGGCTTATCCTCCTC-3′。擴增條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火40 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)，72℃再延伸6 min。β-actin引物（擴增片段620 bp）：上游5′-ACACTGTGCCCATCTACGACG-3′；下游5′-AGGGGCCG?GACTCCTCATACT-3′。擴增條件：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，72℃再延伸6 min。所有擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用MUVB220凝膠成像分析系統(tǒng)對擴增產(chǎn)物測定CEBPα基因及內(nèi)參β-actin的灰度值，取CEBPα與β-actin比值為CEBPα mRNA的相對含量。

1.3.3 免疫印跡法（Western blot）測定各組ASMCs中CEBPα、CRT的蛋白表達提取各組細胞總蛋白，以SDSPAGE進行電泳，轉(zhuǎn)膜，以5%牛血清白蛋白封閉，分別加入羊抗人CRT（44 ku）、CEBPα（42 ku）和GAPDH（36 ku）抗體，再予辣根過氧化物酶標(biāo)記相對應(yīng)的兔抗羊IgG單克隆抗體進行孵育，以DAB進行酶底物顯色反應(yīng)。濾膜照片通過凝膠成像系統(tǒng)定量掃描灰度值，分別以CEBPα/GAPDH、CRT/ GAPDH來表示CEBPα、CRT的蛋白表達水平。

1.3.4 采用siRNA技術(shù)干預(yù)后CEBPα、CRT及細胞增殖程度變化在10%CSE濃度條件下，通過分別對人ASMCs轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA、CRT siRNA相應(yīng)分為陰性對照siRNA組、CRT siRNA組。檢測2組人ASMCs中CRT、CEBPα的表達及增殖程度并進行比較。CRT siRNA組及陰性對照siRNA組的轉(zhuǎn)染分別按照相應(yīng)試劑盒說明書進行，待ASMCs細胞融合至80%左右置于6孔板中，分別以50 nmol/L的相應(yīng)siRNA轉(zhuǎn)染7 h，然后均加入新鮮的DMEM培養(yǎng)24 h，再予10%CSE作用24 h后收集細胞，檢測2組CEBPα、CRT及細胞增殖程度表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。2組計量資料的比較采用獨立樣本資料t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度CSE下ASMCs的CEBPα、CRT表達及ASMCs增殖程度不同CSE濃度組間人ASMCs的CEBPα mRNA的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），細胞增殖程度（OD490）依次增高，見圖1、表1。隨著CSE濃度增加，CEBPα蛋白表達依次降低，CRT表達依次增加，見圖2。

2.2 CRTsiRNA組和陰性對照siRNA組中ASMCs的CRT、CEBPα的表達及細胞增殖程度比較CRT siRNA組CEBPα高于陰性對照siRNA組，CRT和細胞增殖程度低于陰性對照siRNA組（P＜0.05），見表2。

3 討論

CEBPα是重要的具有抑制細胞增殖活性的轉(zhuǎn)錄因子［8］。CEBPα有42 ku和30 ku 2種異構(gòu)體，分別稱為P42CEBPα和P30CEBPα，它們是由同一個mRNA通過“核糖體跳躍機制”翻譯得到的產(chǎn)物，P42CEBPα在N端比P30CEBPα長出12 ku的區(qū)域內(nèi)含有轉(zhuǎn)錄激活功能較強的AD區(qū)及抑制有絲分裂的功能域，因此P30CEBPα轉(zhuǎn)錄激活功能較弱，且沒有抗有絲分裂的作用，因而不能抑制細胞的增殖［1］，僅P42CEBPα有相應(yīng)生物學(xué)活性［9］。本研究結(jié)果顯示，在CSE的作用下，隨著其濃度的增高，ASMCs的增殖程度逐漸增加，而具有抗細胞增殖活性CEBPα的蛋白表達逐漸下降，表明CSE促進ASMCs增殖的機制可能與抑制CEBPα的表達有關(guān)。

Fig.1 The expression levels of CEBPα mRNA under different concentrations of CSE in four groups圖1 各組不同濃度CSE下CEBPα mRNA表達

Tab.1 The expression levels and proliferation of CEBPα and CRT in four groups表1 各組ASMCs中CEBPα mRNA、CEBPα、CRT的表達及細胞增殖程度（n=6，）

Tab.1 The expression levels and proliferation of CEBPα and CRT in four groups表1 各組ASMCs中CEBPα mRNA、CEBPα、CRT的表達及細胞增殖程度（n=6，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與（1），b與（2），c與（3）比較，P＜0.05

組別對照組（1）2.5%CSE組（2）5%CSE組（3）10%CSE組（4）F CEBPα mRNA 0.661±0.133 0.696±0.126 0.713±0.125 0.677±0.142 0.174 CEBPα 0.733±0.101 0.622±0.084a0.497±0.098ab0.368±0.077abc18.238＊＊組別對照組（1）2.5%CSE組（2）5%CSE組（3）10%CSE組（4）F CRT 0.293±0.092 0.489±0.088a0.620±0.103ab0.770±0.087abc28.628＊＊ASMCs增殖（OD490nm）0.187±0.024 0.270±0.033a0.321±0.041ab0.368±0.043abc28.063＊＊

Fig.2 The expression levels of CEBPα protein and CRT under different concentrations of CSE in four groups圖2 各組不同濃度CSE下CEBPα蛋白和CRT水平的表達

Tab.2 The expression levels and proliferation of CRTand CEBPα in CRT-siRNA group and control group表2 CRTsiRNA組、陰性對照siRNA組中CRT、CEBPα的表達及細胞增殖程度（n=6）

Tab.2 The expression levels and proliferation of CRTand CEBPα in CRT-siRNA group and control group表2 CRTsiRNA組、陰性對照siRNA組中CRT、CEBPα的表達及細胞增殖程度（n=6）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別陰性對照siRNA組CRT siRNA組t OD4900.390±0.079 0.265±0.060 3.101＊＊CEBPα 0.247±0.063 0.380±0.180 2.616＊CRT 0.754±0.126 0.544±0.132 2.826＊

CRT是參與CEBPα mRNA翻譯的重要調(diào)控因子之一。以往研究發(fā)現(xiàn)，在脂肪形成的過程中，CEBPα與CRT的表達呈負相關(guān)，CRT通過抑制CEBPα和PPARα的表達而促進脂肪的合成［10］。近期在ASMCs中的研究也發(fā)現(xiàn)CEBPα的表達受CRT負調(diào)節(jié)［4］?？赡軝C制為CRT與CEBPαmRNA莖環(huán)結(jié)合形成GC富集模體，這種復(fù)合物抑制了CEBPα mRNA翻譯為全長42 ku的CEBPα，從而抑制了其生物學(xué)活性［11］。本研究結(jié)果顯示，不同CSE濃度作用下CEBPα mRNA表達無差異，但CEBPα蛋白的表達隨濃度增加呈依次降低，表明CSE對于ASMCs的作用主要是調(diào)控CEBPα的轉(zhuǎn)錄后水平，從而影響其蛋白表達；CRT的表達隨著CSE濃度增高逐漸增強，提示香煙煙霧可能作用于ASMCs后使CRT表達上調(diào)，通過抑制CEBPα mRNA的翻譯，從而使全長CEBPα（P42）的蛋白水平下降，進而促進ASMCs細胞增殖。另外，本研究采用siRNA技術(shù)抑制CRT的表達后，相應(yīng)的CEBPα（P42）蛋白表達增加，從而使ASMCs的增殖相應(yīng)減弱，進一步證實了CRT、CEBPα之間的關(guān)系，提示抑制CRT的表達可減輕氣道平滑肌的增殖，從而改善氣道重塑、減輕氣道炎癥，此可能為探索COPD發(fā)病機制和治療方法提供一個新的切入點。

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（2014-11-26收稿2015-01-05修回）

（本文編輯陸榮展）

Effects of tobacco extract on proliferation of human airway smooth muscle cells

GUAN Pin1，2，YU Huapeng1△，WU Zhiyong2，LI Wei2，WU Jie3
1 Southern Medical University，Guangzhou 510000，China；2 Department of Medical Health Center，Hainan Provincial People Hospital；3 Hainan Medical University，Haikou△

ObjectiveTo explore the effects and mechanism of cigarette smoke extract（CSE）on the proliferation of air?way smooth muscle cells（ASMCs）and the expression of CCAAT/enhancer-binding protein（CEBPα）and calreticulin.Methods（1）The ASMCs were stimulated with different concentrations of CSE for twenty-four hours.According to the concentra?tions of CSE，the cells were divided into control group，2.5%CSE group，5%CSE group and 10%CSE group.The prolifera?tion of ASMCs was measured by MTT colrimetric method.The CEBPαmRNA was analyzed by RT-PCR.Western bloting as?say was performed to detect the levels of CRT and CEBPα protein.（2）In 10%CSE group，transfection of the siRNA respec?tively for negative control or calreticulin was performed in accordance with instructions.The cell proliferation and the expres?sion of calreticulin and CEBPα were compared in negative control siRNA group and calreticulin siRNA group.Results（1）With the increasing of the concentrations of CSE，the protein expression of CEBPα decreased gradually（P＜0.05），while the proliferation of ASMCs and the protein expression of calreticulin increased（P＜0.05），but the expression of CEBPα mRNA in ASMCs showed no significant difference in groups with different concentrations of CSE（P＞0.05）.（2）Under the 10%CSE，the expression of CEBPα was significantly higher in CRT siRNA group than that in negative control group（P＜0.05），but the cell proliferation and CRT were significantly lower in the calreticulin siRNA group than those in negative control siRNA group（P＜0.05）.ConclusionThe CSE exposure contributes to the expression of calreticulin protein，and then inhibits the translation of CEBPα mRNA，thus promotes the proliferation of ASMCs.

myocytes，smooth muscle；cell proliferation；pulmonary disease，chronic obstructive；in vitro；cigarette smoke extract；calreticulin；CCAAT enhancer-binding protein

R655.3

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.09.005

海南省自然科學(xué)基金資助課題（807081）

1廣東廣州南方醫(yī)科大學(xué)（郵編510000）；2?？?，海南省人民醫(yī)院醫(yī)療保健四區(qū)；3?？?，海南醫(yī)學(xué)院

管頻（1980），女，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師，主要從事慢性阻塞性肺疾病氣道重塑及氣道炎癥研究

△通訊作者E-mail：gp0318@126.com