正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化補(bǔ)腎通痹顆粒提取工藝

謝明艷

（衡陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，湖南 衡陽(yáng) 421001）

風(fēng)濕病是一種發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜的疾病，臨床上非常常見(jiàn)，且難完全治愈[1]。目前，臨床上治療該疾病的藥物主要是糖皮質(zhì)激素類(lèi)或甾體抗炎藥物，治療效果不好而且存在較大的不良反應(yīng)[2-3]。補(bǔ)腎通痹顆粒是我院臨床經(jīng)過(guò)多年實(shí)踐，總結(jié)歸納得到的對(duì)于治療風(fēng)濕有確切療效的處方，經(jīng)過(guò)制藥設(shè)備的提取和濃縮，加入輔料制成易于患者服用的顆粒劑，在本院多年的使用期間對(duì)患者疾病的治愈起到很大的作用。為了進(jìn)一步保證藥物的質(zhì)量和確切的治療效果，本研究通過(guò)分析處方組成，利用高相液相分析和薄層色譜法對(duì)處方主要成分進(jìn)行分析，以確定最佳的提取工藝，現(xiàn)將具體結(jié)果報(bào)道如下。

1 處方提取

補(bǔ)腎通痹顆粒處方為：首烏藤60 g，雞血藤60 g，鹿銜草35 g，丹參35 g，延胡索（醋炙）35 g，桑寄生30 g，骨碎補(bǔ)（燙）30 g，肉蓯蓉30 g，地黃30 g，知母20 g，甘草15 g，熟地黃15 g。將處方中的各味中藥按照正交設(shè)計(jì)表中各因素中的水平進(jìn)行加熱和提取，在各個(gè)提取液中加入沉淀劑至完全陳定后過(guò)濾，取濾液，使用超純水對(duì)濾器進(jìn)行沖洗，將濾液和沖洗液進(jìn)行合并，在真空條件下進(jìn)行濃縮，至密度為1∶1。

2 材料與儀器

處方中各飲片均符合2010版《中國(guó)藥典》中的規(guī)定。將槲皮素、延胡索乙素和原兒茶醛作為對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供）；色譜儀為島津LC-20A高效液相色譜儀（LC-20A泵，Alltech3300型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器）；其余試劑均為分析純，水是超純水。

3 方法和結(jié)果

3.1 丹參、延胡索、桑寄生提取工藝考察：使用槲皮素、原兒茶醛、延胡索乙素、丹參酮的薄層鑒別作為指標(biāo)，分別使用醇提法和水提法來(lái)考察3味處方中主要成分的藥材的提取效率。

3.1.1 水提法：取35 g延胡索（醋炙）、35 g丹參和30 g桑寄生在圓底燒瓶中，加入10倍水進(jìn)行加熱回流，1.5 h后進(jìn)行過(guò)濾，取藥渣加入8倍水進(jìn)行加熱回流，1 h后過(guò)濾，將濾液合并濃縮至50 mL備用。

3.1.2 醇提法：取35 g延胡索（醋炙）、35 g丹參和30 g桑寄生在圓底燒瓶中，加入10倍50%乙醇進(jìn)行加熱回流，1.5 h后進(jìn)行過(guò)濾，取藥渣加入8倍50%乙醇進(jìn)行加熱回流，1 h后過(guò)濾，將濾液合并濃縮至50 mL備用。

3.1.3 鑒別：取20 mL本品，研細(xì)后加入20 mL甲醇，進(jìn)行超聲處理，30 min后進(jìn)行過(guò)濾，去濾液進(jìn)行濃縮，濃縮至20 mL后在進(jìn)行20 min超聲處理，加乙酸乙酯搖動(dòng)提?。?次，30 毫升/次），將2次乙酸乙酯液合并后蒸干，取殘?jiān)尤? mL乙酸乙酯液作為供試品溶液。再取對(duì)照品槲皮素加入乙酸乙酯后制成0.5mg/mL溶液，作為對(duì)照品溶液。進(jìn)行薄層色譜法試驗(yàn)（2010版《中國(guó)藥典一部附錄VB》）：使用0.5%氫氧化鈉溶液制備硅膠G薄層板，吸取上述2種溶液各10 μL分別點(diǎn)在同一個(gè)薄層板上，使用甲苯-乙酸乙酯-甲酸（比例為5∶4∶1）作為展開(kāi)劑，進(jìn)行展開(kāi)、取出和晾干，再噴灑5%三氯化鋁乙醇溶液，放置在365 nm紫光燈下進(jìn)行檢視。供試品色譜中在和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上會(huì)有相同顏色的熒光斑點(diǎn)顯示。

3.2 醇提工藝條件選擇：本方中延胡索乙素的含量測(cè)定方法選擇高效液相色譜法。

3.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：考察原料粒度大小、提取時(shí)間、溶媒量等因素對(duì)延胡索乙素、原兒茶醛提取含量以及藥物有效成分提取的影響，因此在實(shí)施正交試驗(yàn)時(shí)選擇不同濃縮方式也作為一個(gè)因素[4-6]，具體見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)工藝因素水平

3.2.2 高效液相色譜法色譜條件：甲醇和0.1%磷酸（PH使用三乙胺調(diào)整至6.0）以60∶40比例作為流動(dòng)相，使用C18柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。按照延胡索乙素峰計(jì)算理論板數(shù)，不低于2000。

3.2.3 制備對(duì)照品溶液：取適量對(duì)照品延胡索乙素，加甲醇制成0.04 mg/mL溶液。

3.2.4 制備供試品溶液：取5 mL延胡索純提液，進(jìn)行精密稱(chēng)定后放置在離心管中，加入20 mL甲醇，進(jìn)行超聲處理（2次，20分鐘/次），將濾液合并蒸干后，取殘?jiān)?0 mL水溶解，加入5 mL濃氨水，使用乙醚進(jìn)行萃?。?次，20毫升/次），取3次萃取后的乙醚液進(jìn)行合并和揮干后取殘?jiān)蛹状? mL溶解后即為供試品溶液。

3.2.5 測(cè)定方法：分別取20 μL對(duì)照品和供試品溶液，注入液相色譜后進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表2可知，最佳提取工藝為A1B2C3D1。將延胡索乙素提取效率作為指標(biāo)，提取效率越高，效果也越好，可以作為工藝選擇指標(biāo)[7-8]。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果分析可知，中等粒度的延胡索乙素，50%乙醇和8倍溶劑量，并進(jìn)行2次提取，在減壓高溫條件下進(jìn)行濃縮的提取方案為最佳方案。按照該方案進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示延胡索乙素的提取效率較好，且進(jìn)行薄層鑒別可見(jiàn)斑點(diǎn)明顯。表明該提取工藝合理可行。

4 討 論

該補(bǔ)腎通痹顆粒適用于腰酸軟、風(fēng)濕痹痛、關(guān)節(jié)痹痛、筋骨無(wú)力等病癥的治療，處方中的首烏藤、地黃和桑寄生作為君藥，具有養(yǎng)血活絡(luò)、祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨和補(bǔ)肝腎的作用；延胡索和丹參為臣藥，作用為活血通絡(luò)；甘草則對(duì)諸藥進(jìn)行調(diào)和，諸藥聯(lián)用具有祛風(fēng)濕、益腎健骨、強(qiáng)腰膝、增強(qiáng)免疫和強(qiáng)健體質(zhì)的作用[9-10]。輔助合理穩(wěn)定的提取工藝可以保證藥物作用最大化地發(fā)揮。

本研究中使用延胡索乙素提取效率作為指標(biāo)，提取效率越高，效果也越好。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果分析可知，中等粒度的延胡索乙素，50%乙醇和8倍溶劑量，并進(jìn)行2次提取，在減壓高溫條件下進(jìn)行濃縮的提取方案為最佳方案。

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