小干擾RNA對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株CXCR4基因表達(dá)和侵襲力的影響

燕 鋒* 孫國(guó)棟 燕 霞 韓文華 劉曉東 崔星亮 劉貴京 王小英 楊 濤 張 靜

（1 邯鄲市中心血站，河北 邯鄲 056002；2 河北工程大學(xué)，河北 邯鄲 056002；3 邯鄲市中醫(yī)院，河北 邯鄲 056002）

根據(jù)近幾年研究可知，CXCR4在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌中具有高度表達(dá)，并與腫瘤散播、轉(zhuǎn)移具有密切聯(lián)系[1]。因此，干擾癌細(xì)胞的CXCR4有助于繁殖腫瘤轉(zhuǎn)移。本文主要通過(guò)RNA干擾技術(shù)，用CXCR4-siRNA對(duì)人卵巢細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分析siRNA對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株CXCR4基因表達(dá)和侵襲力的影響。研究報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料和試劑：南京凱基公司提供卵巢癌細(xì)胞株SW626，兔抗人CXCR4抗體購(gòu)于Santa Cruz公司，PCR試劑盒、脂質(zhì)體Lipofectamine2000、Trizol試劑盒均購(gòu)于大連寶生物公司，Biocoat Matrigel侵襲能力檢測(cè)儀購(gòu)于美國(guó)Becton Dickinson公司[2]。同時(shí)，在5%CO2、37 ℃條件下，由DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)SW626細(xì)胞，試驗(yàn)用細(xì)胞均在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)。

1.2 方法：利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，按照不同比例的脂質(zhì)體、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW626細(xì)胞，在48 h后利用顯微鏡對(duì)轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行觀察。同時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，在胰酶消化后計(jì)數(shù)細(xì)胞，在50 mL培養(yǎng)瓶中，以每瓶5×105細(xì)胞接種，在CO2條件下培養(yǎng)24 h，確保細(xì)胞融合率達(dá)到85%左右。然后，在根據(jù)轉(zhuǎn)染說(shuō)明要求進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，并放入5%CO2、37 ℃中培養(yǎng)，每隔6 h對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行更換，并根據(jù)試驗(yàn)要求加入其他試劑。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，將細(xì)胞裂解液加入其中，提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)試濃度，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE凝膠、轉(zhuǎn)膜、CXCR4抗體反應(yīng)等，沖洗膠片，測(cè)試蛋白質(zhì)表達(dá)水平，利用RT-PCR方法測(cè)試CXCR4 mRNA[3]。最后，利用Biocoat Matrigel侵染能力檢測(cè)儀對(duì)細(xì)胞浸染能力進(jìn)行分析，將測(cè)試結(jié)果與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：在處理本次的研究結(jié)果的過(guò)程中，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)處理利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS12.0進(jìn)行，用百分?jǐn)?shù)表示計(jì)數(shù)資料，并用χ2檢驗(yàn)，用（±s）表示正太分布的計(jì)量資料，且用t檢驗(yàn)，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理，當(dāng)P＜0.05時(shí)，表示數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

在siRNA對(duì)卵巢癌CXCR4 mRNA表達(dá)影響方面，轉(zhuǎn)染72 h后，CXCR4 mRNA水平明顯下調(diào)，明顯低空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組（P＜0.05）；同時(shí)，分析Westerm印跡法檢測(cè)結(jié)果，CXCR-siRNA組的蛋白表達(dá)率明顯低于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組（P＜0.05）；而在侵襲力影響方面，CXCR-siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 三組CXCR4基因表達(dá)及侵襲力情況（±s）

表1 三組CXCR4基因表達(dá)及侵襲力情況（±s）

組別 CXCR4 mRNA水平 CXCR4蛋白表達(dá)率 穿膜細(xì)胞數(shù)CXCR-siRNA組 4.56±0.71 16.31±0.18 15.03±2.46空白對(duì)照組 13.48±1.59 48.63±1.07 26.01±3.65陰性對(duì)照組 11.34±0.64 47.02±0.76 29.18±4.31

3 討 論

趨化因子受體及其配體在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，對(duì)趨化因子受體的信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行有效拮抗、抑制可控制趨化因子系統(tǒng)功能，進(jìn)而對(duì)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)進(jìn)行有效防止[4]。作為細(xì)胞趨化因子受體之一，CXCR4在組織中表達(dá)廣泛，在卵巢、乳腺等惡性腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。同時(shí)，由于CXCR4被其配體結(jié)合激活后，可聚合細(xì)胞肌動(dòng)蛋白絲，形成定向遷移侵襲，在腫瘤中異常表達(dá)。

在本次研究中， 利用小干擾RNA干擾人卵巢癌細(xì)胞株CXCR4，分析siRNA作用下，CXCR4 siRNA的mRNA產(chǎn)量，結(jié)果，CXCR-siRNA組的CXCR4 mRNA水平、蛋白表達(dá)率、穿膜細(xì)胞數(shù)均明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組之間無(wú)明顯差異。由此可知，小干擾RNAZ可有效抑制人卵巢癌細(xì)胞株CXCR4基因表達(dá)及侵襲力。在RNA依賴(lài)性RNA聚合酶作用下，siRNA大量擴(kuò)增，轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，并以其高效性、可遺傳性、高特異性特點(diǎn)產(chǎn)生強(qiáng)強(qiáng)烈的干擾效應(yīng)，抑制CXCR4基因[5]。

綜上所述，RNA干擾CXCR4基因后，有效抑制卵巢細(xì)胞增增，減緩腫瘤生長(zhǎng)，說(shuō)明卵巢癌基因治療的靶基因可能為CXCR4基因，為卵巢癌治療提供新的方法，值得在以后臨床研究中試驗(yàn)、推廣。

[1]湯容,于國(guó)新,袁瑞,等.shRNA抑制人卵巢癌SW626細(xì)胞CXCR4基因的研究[J].生物技術(shù)通報(bào),2010,26(4):165-168.

[2]劉瑜,袁瑞.CXCR4-siRNA重組腺病毒載體沉默人卵巢癌細(xì)胞株CXCR4基因表達(dá)的研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,36(10):1168-1171.

[3]王紅英,王景苗,靳衛(wèi)國(guó),等.siRNA靶向沉默CXCR4基因?qū)θ寺殉舶㏒W626細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展,2012,21(11):848-856.

[4]燕霞,燕鋒,張靜,等.siRNA沉默卵巢癌CXCR4基因?qū)β殉舶└骨晦D(zhuǎn)移的影響[J].河北醫(yī)藥,2013,(24):3701-3703.

[5]湯容.siRNA抑制人卵巢癌SW626細(xì)胞CXCR4基因的研究[D].重慶:重慶醫(yī)科大學(xué),2010.