體外誘導人牙齦成纖維細胞多向分化潛能的實驗研究

蔣少云，陶玉飛，李陽，宋立婷，朱東望，鄧嘉胤

體外誘導人牙齦成纖維細胞多向分化潛能的實驗研究

蔣少云，陶玉飛，李陽，宋立婷，朱東望，鄧嘉胤△

目的探索人牙齦成纖維細胞（hGFs）是否具有多向分化潛能，為組織工程學提供新的細胞來源。方法經(jīng)志愿者知情同意后收集健康牙齦組織，組織塊法培養(yǎng)hGFs。取第3代hGFs進行成骨、成軟骨和成脂誘導，未分化誘導的細胞為對照組。分別用堿性磷酸酶（ALP）染色和茜素紅染色、阿利新藍染色、油紅O染色檢測細胞成骨、成軟骨和成脂能力。實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測細胞中成骨分化標志基因ALP、runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）、成軟骨分化標志基因聚集蛋白聚糖（AGR）和成脂分化標志基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ2（PPARγ2）的表達。結(jié)果成骨誘導組培養(yǎng)至7 d時ALP染色可見大量的藍紫色沉淀，28 d時細胞周圍有大量紅染的鈣結(jié)節(jié)沉積，而對照組無鈣結(jié)節(jié)，培養(yǎng)至14 d細胞中ALP和Runx2表達明顯高于對照組（P＜0.01）。14 d時成軟骨誘導組阿利新藍陽性，成脂誘導組可見紅色的脂肪滴，而對照組2種染色為陰性，AGR、PPARγ2表達均明顯高于對照組（P＜0.01）。結(jié)論hGFs具有成骨、成軟骨和成脂分化的多向分化潛能。

牙齦；成纖維細胞；成脂分化；細胞分化；人牙齦成纖維細胞；成骨分化；成軟骨分化

牙周炎的重要病理變化之一是牙槽骨的吸收，如何促進牙周骨缺損再生是牙周治療的難題，采用組織工程學獲得牙周骨再生是研究的熱點。目前研究較多的口腔來源細胞包括牙周膜細胞、牙髓干細胞和牙囊細胞等［1-3］，但是由于這些細胞取材困難，增殖分化數(shù)量少等，臨床應(yīng)用的可能性相對較低。人牙齦成纖維細胞（human gingival fibroblasts，hGFs）是牙齦組織中的主要細胞成分。研究發(fā)現(xiàn)hGFs不但參與炎癥反應(yīng)［4］，而且從人牙齦組織中分離的間充質(zhì)干細胞或hGFs能夠在體外誘導下表達多種成骨相關(guān)基因［5-6］。但至今尚鮮見文獻直接證實hGFs具有多向分化的潛能。本研究旨在探索hGFs在體外培養(yǎng)條件下是否具有成骨、成軟骨和成脂分化的能力，為確定hGFs作為組織工程的種子細胞提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料DMEM細胞培養(yǎng)液（低糖）、胎牛血清（fetal bo?vine serum，F(xiàn)BS）、0.25%胰蛋白酶（Gibco，美國）；青/鏈霉素、抗壞血酸、3-異丁基-1-甲基黃嘌、吲哚美辛、地塞米松、L-谷氨酰胺、茜素紅（Sigma，美國）；DispaseⅡ分散酶（Roche，德國）；胰島素、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1、Trizol總RNA提取試劑（Invitrogen，美國）；飽和油紅O染色液、阿利新藍（北京索萊寶公司，中國）；cDNA合成試劑盒、real-time PCR試劑盒（Promega，美國）。5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽/四唑硝基藍（BCIP/NBT）溶液（北京華興博創(chuàng)生物技術(shù)中心，中國）。

1.2方法

1.2.1hGFs體外分離與培養(yǎng)選擇就診于天津醫(yī)科大學口腔頜面外科的志愿者，年齡18～25歲，無齲病、牙周病，經(jīng)志愿者知情同意后，于局麻下拔除埋伏阻生齒時獲得新鮮健康牙齦組織。組織塊經(jīng)加有雙抗的磷酸鹽緩沖液反復沖洗后，用2 U/mL無菌中性蛋白DispaseⅡ分散酶4℃浸泡，16～18 h后剝離牙齦上皮組織棄之，剪成體積約為0.5～1 mm3的碎塊，將組織塊均勻接種于100 mm培養(yǎng)皿中。待組織塊于培養(yǎng)皿適當貼合以后，加入DMEM+15%FBS，置于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長情況。待細胞從組織塊中爬出并鋪滿瓶底達80%融合時進行傳代，用DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，取生長良好的第3代細胞用于實驗。

1.2.2細胞分化培養(yǎng)取生長良好的第3代hGFs，以2×104/孔接種于6孔板，37℃溫箱孵育24 h，待細胞貼壁后，進行細胞分化誘導培養(yǎng)。成骨誘導培養(yǎng)：DMEM培養(yǎng)基（低糖）、3%FBS、1×10-3mol/L β-甘油磷酸鈉、5 mg/L抗壞血酸、2×10-3mol/LL-谷氨酰胺以及1×10-7mol/L地塞米松。成軟骨誘導培養(yǎng)：DMEM（低糖）、3%FBS、50mg/L抗壞血酸、6.25mg/L胰島素及10μg/LTGF-β1。成脂誘導培養(yǎng)：包括DMEM（低糖）、3%FBS、1×10-6mol/L地塞米松、0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌及2×10-4mol/L吲哚美辛。對照組培養(yǎng)：DMEM（低糖）+3%FBS。

1.2.3堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色按1.2.2所述方法接種細胞后，加入成骨分化培養(yǎng)基，37℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每周換2～3次液。培養(yǎng)至7 d的細胞，棄培養(yǎng)基，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次后，加入BCIP/NBT溶液，室溫避光染色30 min，PBS漂洗2次，于直視及倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.4茜素紅染色按1.2.3所述方法培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)至28 d收集細胞，棄培養(yǎng)基，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次，每次3 min，然后加入0.5%茜素紅染色液，室溫染色30 min，PBS漂洗2次后，于直視及倒置顯微鏡下觀察。

1.2.5阿利新藍染色如1.2.2所述方法接種細胞后，加入成軟骨分化培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每周換2～3次液。培養(yǎng)至14 d時，棄培養(yǎng)基，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定30 min，加入阿利新藍染色液，孵育過夜，3%醋酸漂洗3次，每次5 min，PBS漂洗，直視及顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.6油紅O染色如1.2.2所述方法接種細胞后，加入成脂分化培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每周換2～3次液。培養(yǎng)至14 d時，棄培養(yǎng)基，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定30 min，加入油紅O染色液，室溫染色10 min，PBS漂洗3 min×2次，于倒置顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。

1.2.6實時定量PCR如1.2.2所述方法接種細胞，分別加入成骨、成軟骨和成脂培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每周換2～3次液。培養(yǎng)至14 d時，棄培養(yǎng)基，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在Applied Biosystems 9700 Thermo?cycler（Applied Bio-systems，USA）上用實時定量PCR檢測誘導后細胞中ALP、runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related tran?script factor 2，Runx2）、聚集蛋白聚糖（aggrecan，AGR）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ2（peroxisome proliferator-activat?ed receptor gamma 2，PPARγ2）的表達，以GAPDH為內(nèi)參，所得的數(shù)據(jù)用2-ΔΔCT法［6］進行處理，與相同刺激時間的對照組進行比較分析。引物序列：ALP上游5′-ACCATTCCCACGTC TTCACATTTG-3′，下游5′-AGACATTCTCTCGTTCACCGCC-3′；Runx2上游5′-TCTGGCCTTCCACTCTCAGT-3′，下游5′-GACTGGCGGGGTGTAAGTAA-3′；AGR上游5′-CGGCCTG?GACAAGTGCTAT-3′，下游5′-CCGAAGTGAGGCTGCATAC C-3′；PPARγ2上游5′-AGACAACCTGCTACA AGCCC-3′，下游5′-AGCGGGTGAAGACTCATGTC-3′；GAPDH上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游5′-ATGGTGGTGA AGACGCCAGT-3′。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃2 min，1個循環(huán)；95℃持續(xù)15 s；60℃持續(xù)60 s，40個循環(huán)。

1.3統(tǒng)計學方法使用SAS V8軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用描述，進行Student’s t檢驗，檢驗水準α=0.05。

Fig.1ALP staining in human gingival fibroblasts induced in osteogenic medium圖1 hGFs成骨誘導ALP染色

2 結(jié)果

2.1ALP染色和茜素紅染色培養(yǎng)至7 d的細胞，對照組無明顯ALP染色，成骨誘導組細胞內(nèi)可見大量藍紫色沉淀，見圖1。培養(yǎng)至28 d的細胞，對照組細胞周圍無鈣結(jié)節(jié)形成，成骨誘導組可見細胞周圍有大量紅染的鈣結(jié)節(jié)，見圖2。

Fig.2Alizarin red staining in human gingival fibroblasts induced in osteogenic medium圖2 hGFs成骨誘導茜素紅染色

2.2阿利新藍染色培養(yǎng)至14 d的細胞，對照組細胞阿利新藍染色陰性，成軟骨誘導組見大量胞質(zhì)呈藍染的細胞，見圖3。

Fig.3Alcian blue staining in human gingival fibroblasts induced in chondrogenic medium圖3 hGFs成軟骨誘導阿利新藍染色

2.3油紅O染色加入成脂誘導培養(yǎng)基以后，hGFs表現(xiàn)出細胞表型的變化包括體積變大，形態(tài)呈長橢圓形或多角形。培養(yǎng)至14 d的細胞，成脂誘導組培養(yǎng)液中存在漂浮的脂肪顆粒。鏡下可見：對照組細胞呈長梭形，油紅O染色陰性；成脂誘導組可見部分細胞體積增大，細胞呈類圓形或長橢圓形，細胞質(zhì)內(nèi)見大小不一的紅色球狀脂肪顆粒，見圖4。

2.4成骨、成軟骨和成脂標志基因的表達成骨誘導14 d后細胞中ALP和Runx2的表達明顯高于對照組（P＜0.01），成軟骨誘導14 d后細胞中AGR的表達明顯高于對照組（P＜0.01），成脂誘導14 d后細胞中PPARγ2的表達明顯高于對照組（P＜0.01），見表1。

Fig.4Oil red O staining in human gingival fibroblasts induced in adipogenic medium圖4 hGFs成脂誘導油紅O染色（×100）

Tab.1ALP，Runx2，AGR and PPARγ2 expressions in hGFs after being induced by differentiation medium表1 hGFs分化培養(yǎng)后ALP、Runx2、AGR和PPARγ2的表達

Tab.1ALP，Runx2，AGR and PPARγ2 expressions in hGFs after being induced by differentiation medium表1 hGFs分化培養(yǎng)后ALP、Runx2、AGR和PPARγ2的表達

＊＊P＜0.01

ALP 1.002±0.069 4.599±0.571組別對照組成骨組成軟骨組成脂組t Runx2 1.001±0.050 5.532±0.853 PPARγ2 1.007±0.146 ------10.84＊＊9.19＊＊AGR 1.023±0.251 -5.375±0.624 -11.21＊＊7.224±0.727 14.53＊＊

3 討論

hGFs來源于人牙齦結(jié)締組織的間充質(zhì)細胞，具有活躍的自我更新能力，并且具有合成和降解膠原纖維的功能。通過本研究發(fā)現(xiàn)：hGFs在體外在一定的條件下能被誘導向成骨、成軟骨和成脂分化，說明hGFs可能是一種具有多向分化潛能的細胞。

本研究采用ALP染色和茜素紅染色檢測hGFs的成骨分化能力。ALP在成骨的過程中可以水解磷酸酯，為羥磷灰石的沉積提供磷酸，可以反映細胞成骨分化趨勢，也是檢測細胞成骨分化的早期標志之一。本研究顯示，在成骨分化誘導7 d后hGFs細胞內(nèi)見大量藍紫色沉淀，而且通過檢測ALP mRNA水平，發(fā)現(xiàn)成骨誘導組細胞中的表達明顯高于對照組，與染色結(jié)果一致，說明在成骨誘導的早期，hGFs表現(xiàn)出明顯的成骨分化趨勢。同時Runx2是細胞成骨分化過程中重要且標志性的因子，在成骨分化培養(yǎng)后hGFs細胞內(nèi)Runx2 mRNA的水平明顯升高，說明hGFs已向成骨分化。進一步用茜素紅染色進行驗證，細胞成骨誘導28 d時茜素紅染色顯示細胞周圍有大量的鈣結(jié)節(jié)形成，證明了hGFs具有成骨分化能力，與Mostafa等［5-7］的研究結(jié)果一致。但是，有些研究顯示：hGFs無明顯成骨分化能力［8-9］。通過比較分析發(fā)現(xiàn)：成骨誘導培養(yǎng)基的成分不同可能是導致成骨分化誘導結(jié)果存在差異性的主要原因。在Martinez等［8］的研究中成骨誘導培養(yǎng)基的成分中除基礎(chǔ)培養(yǎng)基外僅含有β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸，而在筆者此前研究中發(fā)現(xiàn)hGFs在含β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸的成骨誘導培養(yǎng)基有較弱的成骨分化能力，但是在培養(yǎng)基中加入適量的地塞米松后，hGFs的成骨分化能力明顯增強［10］；筆者的研究與Choi等［9］的研究進行比較，成骨分化培養(yǎng)基成分基本相同，但是某些成分的含量有差異，如胎牛血清、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸，有可能導致研究結(jié)果的不一致。

阿利新藍是細胞成軟骨分化的一個重要標志。本研究hGFs經(jīng)成軟骨誘導后阿利新藍染色陽性，說明hGFs能向成軟骨分化，而且成軟骨分化標志基因AGR mRNA水平在成軟骨誘導組細胞中的表達明顯升高，說明在成軟骨誘導培養(yǎng)環(huán)境中細胞內(nèi)的成軟骨基因表達增強，決定了細胞向成軟骨方向分化，與阿利新藍染色結(jié)果一致。

本研究在成脂培養(yǎng)基中hGFs發(fā)生了細胞形態(tài)的變化，而且在14 d時油紅O被細胞內(nèi)的脂肪滴溶解，出現(xiàn)橘紅色油紅O染色，而且在成脂分化培養(yǎng)基中細胞內(nèi)成脂分化標志基因的表達升高，決定了hGFs向成脂分化的方向，從而出現(xiàn)油紅O染色陽性的結(jié)果，以上均證實了hGFs的成脂分化潛能。

綜上，hGFs在不同的分化誘導過程中細胞內(nèi)的標志性基因發(fā)生了相應(yīng)的變化，驅(qū)使細胞向成骨、成軟骨或成脂方向分化，而且與其他自體來源的細胞相比，hGFs來源廣泛、取材方便、體外培養(yǎng)容易，因此hGFs可能會成為一種新的種子細胞，在組織工程學中具有良好的研究和應(yīng)用前景。

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（2015-02-27收稿 2015-04-02修回）

（本文編輯 李國琪）

Study on differentiation pluripotency of human gingival fibroblasts induced in vitro

JIANG Shaoyun，TAO Yufei，LI Yang，SONG Liting，ZHU Dongwang，DENG Jiayin△
Department of Periodontics，Hospital of Stomatology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China△

ObjectiveTo investigate the pluripotency of human gingival fibroblasts（hGFs），and provide a novel cell source for tissue engineering.MethodsWith informed consent from volunteers，fresh and healthy gingiva were collected. The hGFs were obtained from the gingiva by tissue culture.The third passage of hGFs was cultured in osteogenic medium，chondrogenic medium and adipogenic medium.Cells without differentiation were taken as control.Cells were examined by al?kaline phosphatase（ALP）staining，Alizarin red staining，Alcian blue staining and oil red O staining for detecting of the abili?ty of differentiation pluripotency.Real-time polymerase chain reaction was applied to examine the expression of osteogenic marker genes ALP，runt-related transcript factor 2（Runx2），chondrogenic marker aggrecan（AGR）and adipogenic marker peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2（PPARγ2）.ResultsThe hGFs cultured in osteogenic medium showed massive violet deposit at day 7 and calcium nodulus at day 28，meanwhile，the expressions of ALP and Runx2 were higher than those of control（P＜0.01）.In chondrogenic group cells were found blue deposit at day 14.In adipogenic group lipidfilled droplets stained with oil red O were found in cells at day 14.However，hGFs in control group had no any positive stain?ing.Furthermore，expressions of AGR and PPARγ2 were significantly higher than those of control（P＜0.01）.Conclusion Human gingival fibroblasts have the pluripotency of osteogenic，adipogenic and chondrogenic differentiation.

gingiva；fibroblasts；adipogenesis；cell differentiation；human gingival fibroblasts；osteogenic differentia?tion；chondrogenic differentiation

R781

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.003

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計劃-自然科學基金重點項目（12JCZDJC22700）

天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院牙周科（郵編300070）

蔣少云（1972），女，副教授，博士，主要從事牙周病發(fā)病機制及牙周組織工程學的研究

△通訊作者E-mail:yazhou2991@126.com