江川縣雞大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

李 琳，寸誠(chéng)芬，李正甫，周慶國(guó)，白祖留

(1.江川縣畜牧獸醫(yī)局，云南 江川 652600;2.騰沖縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南 騰沖 679100;3.保山市畜牧工作站，云南 保山 678000;4.通海縣四街鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南 通海 652702;5.昆明錦農(nóng)堂農(nóng)牧科技有限公司，云南 昆明 650000)

雞大腸桿菌病是指部分或全部由致病性大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)所引起的局部或全身性感染的疾病[1]，臨床上表現(xiàn)為敗血癥、心包炎、氣囊炎、肝周炎和腹膜炎。雞大腸桿菌除單獨(dú)引起雞只死亡外，還常與其它細(xì)菌[2]、病毒[3]和寄生蟲(chóng)[4]混合感染或繼發(fā)感染，使發(fā)病率、死亡率明顯升高，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。雞大腸桿菌還可引發(fā)人類食源性疾病，給人類公共衛(wèi)生安全帶來(lái)威脅，在公共衛(wèi)生中也日益受到人們重視。近年來(lái)，隨著各種抗生素的濫用，大腸桿菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，多重耐藥菌株的不斷增多，給雞大腸桿菌病的治療造成困難。為了解江川縣雞大腸桿菌的耐藥性，對(duì)2013—2014年江川縣6個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)疑似雞大腸桿菌病的肝臟、心包液等病料進(jìn)行病原菌的分離鑒定、形態(tài)學(xué)觀察、小白鼠致病性試驗(yàn)和耐藥性分析，用于指導(dǎo)雞大腸桿菌病的臨床用藥。

1 病料來(lái)源

病料來(lái)源于2013年3月至2014年11月，江川縣不同鄉(xiāng)(鎮(zhèn))的6個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)疑似雞大腸桿菌病病雞的肝臟、心包液等病料。每只雞所取病料為1份病料，共17份病料。不同時(shí)間采集的病料均保存于－20℃，用于細(xì)菌分離培養(yǎng)。

2 細(xì)菌分離

將17份樣品的肝臟和心包液，分別劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，放置于普通培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過(guò)夜觀察結(jié)果，可見(jiàn)每份病料樣品接種的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上均長(zhǎng)出直徑1～2mm的中等大小乳白色菌落，菌落凸起、光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊。從每份病料樣品接種的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上挑取1個(gè)單菌落，用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)夜后先用接種環(huán)分別挑取菌落涂布載玻片制作細(xì)菌涂片，用于后續(xù)的染色鑒定。再用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基分別將各個(gè)純培養(yǎng)物洗脫下來(lái)，分別編號(hào)為菌1—菌17，4℃保存，用于后續(xù)的鑒定、致病性試驗(yàn)和耐藥性分析。

將菌1—菌17分別接種麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，置普通培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過(guò)夜觀察結(jié)果，可見(jiàn)17株分離株在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上均呈中等大小紫紅色菌落，菌落凸起、光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊;在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上均呈中等大小帶綠色金屬光澤的紫黑色菌落。綜合菌1—菌17在營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性，將17株分離株初步鑒定為大腸桿菌。

3 細(xì)菌染色鏡檢

將上述制備的菌1—菌17的細(xì)菌涂片，按照細(xì)菌革蘭氏染色標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行染色，再將染色好的細(xì)菌涂片用顯微鏡油鏡鏡檢，鏡檢結(jié)果均為革蘭氏陰性中等大小桿菌。細(xì)菌形態(tài)結(jié)合上述培養(yǎng)特性，將17株分離株鑒定為大腸桿菌，并分別命名為大腸桿菌E.coli－1—E.coli－17。

4 致病性試驗(yàn)

將大腸桿菌E.coli－1—E.coli－17分離株分別接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，用滅菌生理鹽水將菌苔分別洗脫下來(lái)，制成菌懸液，用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定其濃度分別為1.7×108～3.2×108CFU/mL，每株大腸桿菌各腹腔注射3只小白鼠，每只小白鼠注射0.2 mL，再取3只小白鼠各腹腔注射0.2mL滅菌生理鹽水作為對(duì)照。結(jié)果除了E.coli－5和E.coli－12接種的小白鼠在接種后72 h僅有部分死亡，表明其對(duì)小白鼠的致病性較弱。其它15株大腸桿菌接種的小白鼠均在72 h內(nèi)全部死亡，表明其對(duì)小白鼠有強(qiáng)致病性。

5 藥敏試驗(yàn)

用青霉素 G(P)、氨芐西林(AM)、阿莫西林(AMX)、頭孢噻吩鈉(CF)、頭孢氨芐(CX)、頭孢呋辛鈉(CXM)、頭孢他啶(CAZ)、卡那霉素(K)、鏈霉素(S)、慶大霉素(GM)、氧氟沙星(OFL)、諾氟沙星(NOR)、痢特靈(FR)、磺胺甲惡唑(SMX)和氟苯尼考(FFC)共15種常用抗生素(均購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)對(duì)分離株進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，方法按照美國(guó)臨床試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)研究所CLSI/NCCLS 1999—2005年頒布的藥敏實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)定進(jìn)行。參照CLSI/NCCLS 1999—2005的標(biāo)準(zhǔn)將各菌株的耐藥性判定為耐藥(R)、敏感(S)或中介(I)，17株致病性大腸桿菌的耐藥性見(jiàn)表1。由表1可知17株致病性大腸桿菌耐藥性如下:12耐1株，11耐2株、9耐3株，8耐4株、7耐3株、6耐2株、5耐2株。痢特靈、頭孢呋辛鈉、頭孢他啶、氟苯尼考的耐藥率低于17.6%(3/17)，即分離株對(duì)該4種藥物的敏感性高于83.4%，可作為江川縣雞大腸桿菌病治療的首選藥物。

表1 17株雞致病性大腸桿菌耐藥性

6 討論

大腸桿菌病是危害養(yǎng)雞業(yè)的重要細(xì)菌性傳染病，隨著抗生素的濫用，大腸桿菌耐藥性日益增強(qiáng)，多重耐藥菌株不斷出現(xiàn)，給雞大腸桿菌病的治療造成困難。畢保良等[5]2012年報(bào)道了豬大腸桿菌對(duì)15種常用抗生素的耐藥性，結(jié)果顯示在7株豬大腸桿菌中14耐1株，13耐2株，11耐2株，8和8耐以下2株，表明云南豬大腸桿菌已經(jīng)呈現(xiàn)出十分嚴(yán)重的多重耐藥性。楊斌等[6]2010年也報(bào)道了云南省雞大腸桿菌的耐藥性，結(jié)果顯示其對(duì)青霉素、紅霉素和環(huán)丙沙星等多種藥物耐藥，對(duì)氟苯尼考、頭孢曲松等藥物敏感。本研究報(bào)道了江川縣2013—2014年雞大腸桿菌的分離鑒定及其耐藥性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從疑似雞大腸桿菌病病例中分離到的17株雞大腸桿菌均為強(qiáng)致病性菌株;藥敏試驗(yàn)表明江川縣雞大腸桿菌也出現(xiàn)了多重耐藥趨勢(shì)，分離株對(duì)15種常用抗生素顯示出嚴(yán)重的多重耐藥性，其中12耐1株、11耐2株、9耐3株，8耐4株，8耐以下共7株，均在5耐以上。青霉素、氨芐西林、頭孢噻吩、頭孢氨芐、卡那霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、鏈霉素和磺胺甲惡唑的耐藥率均在58.8%(10/17)以上。痢特靈、頭孢呋辛鈉、頭孢他啶、氟苯尼考的耐藥率低于17.6%(3/17)。在實(shí)際應(yīng)用中，用痢特靈、頭孢呋辛鈉、頭孢他啶和氟苯尼考這4中藥物對(duì)江川縣6個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)雞大腸桿菌病例進(jìn)行治療，取得非常好的治療效果，這4種敏感藥物可作為江川縣雞大腸桿菌病治療的首選藥物，值得推廣應(yīng)用。

大腸桿菌的耐藥性復(fù)雜，不同地區(qū)雞場(chǎng)大腸桿菌耐藥性差別很大，敏感藥物有所不同;同一雞場(chǎng)不同時(shí)期分離的菌株的耐藥性也有較大差異，敏感藥物也不相同。因此，為了科學(xué)用藥治療雞大腸桿菌病，減緩耐藥性的發(fā)展，避免超級(jí)細(xì)菌的產(chǎn)生，同時(shí)也為了養(yǎng)雞業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展和人類公共衛(wèi)生安全，在臨床用藥治療前必須進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定和藥敏試驗(yàn)，篩選敏感藥物進(jìn)行治療。同時(shí)，加強(qiáng)雞的飼養(yǎng)管理，控制飼養(yǎng)密度，防止溫度驟變，加強(qiáng)衛(wèi)生消毒，提供優(yōu)質(zhì)飼料和清潔飲水，嚴(yán)格執(zhí)行衛(wèi)生防疫措施，減少各種誘發(fā)因素也是防治雞大腸桿菌病的重要措施。

[1]Y.M.saif.禽病學(xué)(第十一版)[M].蘇敬良，高福，索勛主譯，北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005:712－738.

[2]張玉政，崔衛(wèi)濤.雞傳染性鼻炎和大腸桿菌混合感染的診治[J].山東畜牧獸醫(yī)，2011(6):89－90.

[3]譚紅，張汝，常志順，等.蛋雞大腸桿菌和H9亞型禽流感病毒混合感染的診治[J].云南畜牧獸醫(yī)，2014(4):8－9.

[4]高佩民.三黃雞大腸桿菌和球蟲(chóng)混合感染的診治[J].養(yǎng)禽與禽病防治，2012(5):41－42.

[5]畢保良，李富祥，胡騎，等.云南多重耐藥豬源大腸桿菌的分離鑒定及其耐藥機(jī)制初步研究[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2012(5):6－7.

[6]楊斌，王傳禹，楊向東，等.云南省雞致病性大腸桿菌的血清型鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].云南畜牧獸醫(yī)，2010(3):2－4.