球孢白僵菌和中華甲蟲蒲螨對(duì)冷杉梢斑螟殺蟲作用及其相關(guān)酶活性影響1)

劉行 聶振業(yè) 遲德富 賀麗敏

(東北林業(yè)大學(xué),哈爾濱,150040) (河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹研究所)

冷杉梢斑螟(Dioryctriaabietella)是針葉林的破壞性害蟲,廣泛分布于朝鮮半島、歐洲、北美和中國(guó)東北[1]。在歐洲,種子園中有很大比例的球果被冷杉梢斑螟侵害,導(dǎo)致種子產(chǎn)量大幅下降[2]。冷杉梢斑螟幼蟲主要以球果為食,對(duì)球果、種鱗和種子造成危害。幼蟲在林下枯枝落葉層中越冬,成蟲在每年6月和7月上樹產(chǎn)卵,會(huì)對(duì)紅松(Pinuskoraiensis)、赤松(Pinusdensiflora)和云杉(Piceaasperata)等造成危害[3-4]。近年來(lái),該害蟲在我國(guó)東北大面積發(fā)生,嚴(yán)重危害紅松球果種實(shí),造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,控制冷杉梢斑螟種群具有較大的經(jīng)濟(jì)意義。

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是一種蟲生真菌,在自然界分布廣、寄主多,對(duì)很多農(nóng)林害蟲致病力強(qiáng),可侵染15目149科的700余種昆蟲[5-7]。對(duì)梢斑螟具有較高的毒力和防治潛力[8]。中華甲蟲蒲螨(Pyemoteszhonghuajia)作為目前國(guó)內(nèi)重點(diǎn)研究和開發(fā)的寄生螨品種,對(duì)螟蛾科(Pyralidae)昆蟲也表現(xiàn)出了較好的寄生和防治能力[9]。白僵菌一般是配成孢子液,直接噴施到目標(biāo)生物上,然后通過(guò)孢子的侵染作用殺死害蟲[10],但防治球果內(nèi)部的害蟲時(shí),害蟲因不容易接觸到孢子液而成為“漏網(wǎng)之魚”[11],從而降低了白僵菌的防治效果。中華甲蟲蒲螨通過(guò)主動(dòng)搜索的方式寄生寄主[12],從這個(gè)角度來(lái)說(shuō),二者的聯(lián)合應(yīng)用可以起到互補(bǔ)作用。本文采用浸蟲法和室內(nèi)接種蒲螨的方法,對(duì)2株球孢白僵菌和中華甲蟲蒲螨進(jìn)行室內(nèi)毒力和殺蟲力測(cè)定,并從2株球孢白僵菌中篩選出毒力更高的菌株。單獨(dú)或聯(lián)合使用球孢白僵菌和中華甲蟲蒲螨,研究其對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲僵蟲率和死亡率的影響,并測(cè)定幼蟲被球孢白僵菌和中華甲蟲蒲螨侵染或寄生后的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、乙酰膽堿酯酶(AChE)2種解毒酶以及多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)3種保護(hù)酶的活性變化,旨在為球孢白僵菌與中華甲蟲蒲螨聯(lián)合防控冷杉梢斑螟提供參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料:冷杉梢斑螟由黑龍江省牡丹江市海林市海林鎮(zhèn)森寶源天然食品有限公司提供。培養(yǎng)條件:使用人工氣候箱(HPG-400HX),設(shè)置溫度(25±1)℃,相對(duì)濕度(65±5)%,光周期16 h光照、8 h黑暗,利用人工飼料飼養(yǎng)[13]。

供試菌株,2株球孢白僵菌CFCC81428和CFCC83116由北納生物公司提供。利用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(配方:馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g,蒸餾水1 L)培養(yǎng)。

中華甲蟲蒲螨由河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹研究所提供。置于直徑2.0 cm、長(zhǎng)10.0 cm的玻璃管內(nèi),使用人工氣候箱培養(yǎng),溫度設(shè)置為(25±1)℃,相對(duì)濕度(50±5)%,用天牛幼蟲供其寄生繁育[14]。

球孢白僵菌和中華甲蟲蒲螨的毒(殺蟲)力測(cè)定:將球孢白僵菌孢子接種在PDA固體平板培養(yǎng)基上,在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)15 d[15],將分生孢子溶于體積分?jǐn)?shù)為0.05%的無(wú)菌聚山梨酯-80中,用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾掉菌絲,將孢子液稀釋為105、106、107、108孢子/mL 4個(gè)孢子濃度梯度,菌株孢子萌發(fā)率均超過(guò)90%,用于毒力測(cè)定。選取冷杉梢斑螟的老熟幼蟲,逐頭浸入不同孢子濃度的球孢白僵菌分生孢子懸浮液中15 s后取出,用濾紙拭干蟲體表面水分,放入養(yǎng)蟲盒中,再蓋上已扎多個(gè)直徑1 cm小孔的養(yǎng)蟲盒蓋,置于人工氣候箱中飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件設(shè)置為溫度(25±1)℃,相對(duì)濕度(65±5)%,光周期16 h光照、8 h黑暗。每15頭冷杉梢斑螟幼蟲為1個(gè)重復(fù),每個(gè)孢子濃度重復(fù)3次,以體積分?jǐn)?shù)為0.05%的無(wú)菌聚山梨酯-80作為對(duì)照。連續(xù)觀察記錄10 d,每天記錄幼蟲死亡數(shù),幼蟲僵直不動(dòng)視為死亡,計(jì)算出毒力數(shù)據(jù)[16],并將死蟲挑出保濕培養(yǎng),記錄僵蟲數(shù)。

將中華甲蟲蒲螨在玻璃管中用天牛幼蟲飼養(yǎng),挑出5個(gè)數(shù)量梯度的雌螨[17],分別為20、40、60、80、100頭,用于殺蟲力測(cè)定,選取冷杉梢斑螟老熟幼蟲,置于35 mm×12 mm的培養(yǎng)皿里,將不同數(shù)量梯度的雌螨挑取到培養(yǎng)皿里。每15頭冷杉梢斑螟幼蟲為1個(gè)重復(fù),每個(gè)中華甲蟲蒲螨數(shù)量設(shè)置3次重復(fù),以未接種蒲螨處理的作為對(duì)照。連續(xù)觀察3d,用針扎不動(dòng)視為死亡,每天記錄死亡數(shù),計(jì)算得出半數(shù)致死量等殺蟲力數(shù)據(jù)。

將球孢白僵菌和中華甲蟲蒲螨聯(lián)合使用,以孢子濃度為108孢子/mL的球孢白僵菌和數(shù)量為20、40、60、80、100頭的中華甲蟲蒲螨聯(lián)合使用,以使用中華甲蟲蒲螨和體積分?jǐn)?shù)為0.05%的無(wú)菌聚山梨酯-80為對(duì)照,記錄冷杉梢斑螟幼蟲的死亡數(shù);將數(shù)量為80頭的中華甲蟲蒲螨和孢子濃度為105、106、107、108孢子/mL的球孢白僵菌聯(lián)合使用,以單獨(dú)使用球孢白僵菌為對(duì)照,記錄冷杉梢斑螟幼蟲僵蟲數(shù)。

雖然RBM模型有許多優(yōu)勢(shì)，但是現(xiàn)有的流行數(shù)值分析軟件并沒(méi)有RBM模型，使得應(yīng)用RBM變得異常困難。使用基于有限元原理的Abaqus-6.11來(lái)進(jìn)行對(duì)不同幾何形狀的直根的拔出模擬[1]。首先是用Abaqus找到一種可行的模擬根土相互作用的模型；其次將對(duì)不同樹根模型進(jìn)行拔出分析，得到幾何模型的變化如何影響樹根的拔出強(qiáng)度。

亞致死濃度(量)處理:根據(jù)球孢白僵菌和中華甲蟲蒲螨對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲的致死情況,以球孢白僵菌6 d后的亞致死濃度(LC25)和中華甲蟲蒲螨2 d后亞致死數(shù)量(LD25)對(duì)幼蟲進(jìn)行侵染和寄生處理,50頭冷杉梢斑螟幼蟲為一個(gè)重復(fù),每個(gè)處理重復(fù)3次,以體積分?jǐn)?shù)為0.05%的無(wú)菌聚山梨酯-80處理為對(duì)照,在12、24、36、48、60、72 h時(shí)對(duì)每組幼蟲進(jìn)行谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)的酶活力測(cè)定。

酶原制備方法:分別在菌和螨處理后的12、24、36、48、60、72 h進(jìn)行取樣,從處理過(guò)的每組幼蟲中挑取活力較高的3頭幼蟲,分別加入1 mL提取液,進(jìn)行冰浴勻漿。12 000 r/min、4 ℃離心15 min,取上清,置冰上待測(cè)。

GSTs、AChE、PPO、SOD、CAT活力測(cè)定:參照測(cè)試盒說(shuō)明書(購(gòu)自蘇州格銳思生物科技有限公司)測(cè)定。

數(shù)據(jù)處理:根據(jù)試驗(yàn)所獲數(shù)據(jù)計(jì)算各處理的死亡率、校正死亡率和僵蟲率。

死亡率=(死亡蟲數(shù)/總蟲數(shù))×100%。

校正死亡率=[(處理死亡率-對(duì)照死亡率)/(100%-對(duì)照死亡率)]×100%。

僵蟲率=(僵蟲數(shù)/總蟲數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 球孢白僵菌對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲的侵染效果

2株球孢白僵菌對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表可知,2 d時(shí)CFCC83116菌株對(duì)幼蟲的亞致死濃度(LC25)和半數(shù)致死濃度(LC50)分別為4.79×108、1.41×1011孢子/mL,CFCC81428菌株對(duì)幼蟲的LC25和LC50分別為2.14×108、2.19×1010孢子/mL;6 d時(shí)幼蟲死亡率上升明顯,此時(shí)CFCC83116菌株對(duì)幼蟲的LC25和LC50分別為6.92×106、1.05×109孢子/mL,CFCC81428菌株對(duì)幼蟲的LC25和LC50分別為7.41×105、3.02×107孢子/mL;10 d時(shí),CFCC83116菌株對(duì)幼蟲的LC25和LC50分別為1.62×105、1.29×107孢子/mL,CFCC81428菌株對(duì)幼蟲的LC25和LC50分別為2.04×104、7.24×105孢子/mL。2～10 d,球孢白僵菌CFCC81428的LC25、LC50均小于CFCC83116菌株。由表2可知,同一菌株隨著孢子濃度的升高,其對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲的累計(jì)校正死亡率也逐漸升高。幼蟲被孢子濃度為105、106孢子/mL的菌株CFCC83116侵染10 d后的累計(jì)校正死亡率,小于菌株CFCC81428侵染10 d后的累計(jì)校正死亡率;幼蟲被孢子濃度為107、108孢子/mL的菌株CFCC83116侵染10 d后的累計(jì)校正死亡率,顯著小于菌株CFCC81428侵染10 d后的累計(jì)校正死亡率(P<0.05)。由以上數(shù)據(jù)可知,菌株CFCC81428對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲的毒力大于菌株CFCC83116,故選取菌株CFCC81428做后續(xù)試驗(yàn)。

表1 不同飼養(yǎng)時(shí)間2株球孢白僵菌對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲的致死情況

CFCC81428菌株侵染冷杉梢斑螟幼蟲并使其死亡后,在其表面產(chǎn)生菌絲,在體式顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),冷杉梢斑螟染菌后48 h,蟲體已有白色菌絲產(chǎn)生,分布在頭部下側(cè)和節(jié)間褶處,此時(shí)冷杉梢斑螟已經(jīng)死亡,身體柔軟(圖1A);染菌后144 h,蟲體被白色菌絲全部覆蓋,營(yíng)養(yǎng)耗盡,身體僵硬萎縮(圖1B)。

A為接種后48 h的蟲體形態(tài);B為接種后144 h的蟲體形態(tài)。

表2 冷杉梢斑螟幼蟲被2株球孢白僵菌侵染10 d后的累計(jì)校正死亡率

2.2 中華甲蟲蒲螨對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲的寄生效果

中華甲蟲蒲螨對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲的室內(nèi)殺蟲力測(cè)定見(jiàn)表3。1 d時(shí),蒲螨對(duì)幼蟲的LD25和LD50分別為36.31、91.20頭;2 d時(shí),幼蟲死亡率明顯上升,蒲螨對(duì)幼蟲的LD25和LD50分別為16.60、27.54頭;3 d時(shí),蒲螨對(duì)幼蟲的LD25和LD50分別為16.60、25.12頭。

冷杉梢斑螟幼蟲被蒲螨寄生后,膨腹體逐漸變大。幼蟲被寄生24 h后,大量蒲螨附著于蟲體,此時(shí)蟲體顏色加深,已被寄生致死(圖2A);幼蟲被寄生144 h后,蒲螨產(chǎn)生膨腹體,膨腹體上爬動(dòng)著許多雄螨,等待子代雌螨從膨腹體中產(chǎn)出,與其交配,此時(shí)幼蟲營(yíng)養(yǎng)已經(jīng)耗盡,蟲體嚴(yán)重萎縮(圖2B)。

表3 不同飼養(yǎng)時(shí)間中華甲蟲蒲螨對(duì)冷杉稍斑螟幼蟲致死情況

A為寄生后24 h蟲體形態(tài);B為寄生后144 h蟲體形態(tài)。

2.3 冷杉梢斑螟幼蟲被球孢白僵菌和中華甲蟲蒲螨聯(lián)合處理后的作用效果

冷杉梢斑螟幼蟲被中華甲蟲蒲螨和球孢白僵菌聯(lián)合處理3d后的累計(jì)校正死亡率見(jiàn)表4。由表可知,單獨(dú)使用中華甲蟲蒲螨20、40、60、80、100頭時(shí),對(duì)應(yīng)的冷杉梢斑螟幼蟲累計(jì)校正死亡率為51.11%、55.56%、80.00%、100.00%、100.00%。單獨(dú)使用蒲螨寄生幼蟲時(shí),使用數(shù)量20、40頭和使用數(shù)量60頭的幼蟲累計(jì)校正死亡率差異顯著(P<0.05);使用數(shù)量60頭和使用數(shù)量80、100頭的幼蟲累計(jì)校正死亡率差異顯著(P<0.05)。說(shuō)明冷杉梢斑螟幼蟲的累計(jì)校正死亡率隨著蒲螨數(shù)量的增加而增加。中華甲蟲蒲螨80頭和100頭對(duì)應(yīng)的冷杉梢斑螟幼蟲累計(jì)校正死亡率差異不顯著,說(shuō)明冷杉梢斑螟幼蟲被寄生超過(guò)80頭蒲螨后,其累計(jì)校正死亡率不會(huì)顯著增加。聯(lián)合使用時(shí),中華甲蟲蒲螨20、40、60頭對(duì)應(yīng)的冷杉梢斑螟幼蟲累計(jì)校正死亡率顯著高于未聯(lián)合使用的(P<0.05),說(shuō)明中華甲蟲蒲螨和球孢白僵菌聯(lián)合使用對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲殺蟲力更高。

表4 冷杉梢斑螟幼蟲被球孢白僵菌和不同數(shù)量的中華甲蟲蒲螨聯(lián)合處理3 d后的累計(jì)校正死亡率

根據(jù)中華甲蟲蒲螨對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲的致死情況,選取數(shù)量為80頭的中華甲蟲蒲螨和孢子濃度為105、106、107、108孢子/mL的球孢白僵菌聯(lián)合使用,查看冷杉梢斑螟幼蟲的僵蟲率,以單獨(dú)使用球孢白僵菌處理為對(duì)照,結(jié)果見(jiàn)表5。由表可知,冷杉梢斑螟幼蟲被孢子濃度為105、106孢子/mL的球孢白僵菌和數(shù)量為80頭的蒲螨聯(lián)合處理后的僵蟲率為22.22%和33.33%;冷杉梢斑螟幼蟲被孢子濃度為105、106孢子/mL的球孢白僵菌單獨(dú)侵染后的僵蟲率為11.11%和17.78%。在球孢白僵菌孢子濃度為105、106孢子/mL時(shí),聯(lián)合處理與未聯(lián)合處理冷杉梢斑螟幼蟲的僵蟲率差異顯著(P<0.05)。冷杉梢斑螟幼蟲被孢子濃度為107、108孢子/mL的球孢白僵菌和數(shù)量為80頭的蒲螨聯(lián)合處理后的僵蟲率為35.56%和53.33%;幼蟲被孢子濃度為107、108孢子/mL的球孢白僵菌單獨(dú)侵染后的僵蟲率為31.11%和48.89%。球孢白僵菌孢子濃度為107、108孢子/mL時(shí),冷杉梢斑螟幼蟲被聯(lián)合處理的僵蟲率均高于未聯(lián)合處理。幼蟲被孢子濃度為105、106孢子/mL的球孢白僵菌侵染后的僵蟲率與被孢子濃度為107、108孢子/mL侵染后相比差異顯著(P<0.05)。由表可知,同一處理下的冷杉梢斑螟幼蟲僵蟲率會(huì)隨球孢白僵菌孢子濃度升高而不同程度的升高。

表5 冷杉梢斑螟幼蟲被中華甲蟲蒲螨和不同孢子濃度的球孢白僵菌聯(lián)合處理后的僵蟲率

中華甲蟲蒲螨和球孢白僵菌單獨(dú)或聯(lián)合使用對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性的影響見(jiàn)表6。由表可知,幼蟲在被菌侵染12 h后GSTs活性均高于對(duì)照組,36 h時(shí)達(dá)到峰值,此時(shí)GSTs活性是對(duì)照組的3.6倍,顯著高于對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明單獨(dú)使用球孢白僵菌侵染對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲GSTs活性有誘導(dǎo)作用;幼蟲GSTs活性在被蒲螨寄生后12 h達(dá)到峰值,是對(duì)照組的1.2倍,被蒲螨寄生72 h后,GSTs活性低于對(duì)照組,處于被抑制狀態(tài),表明幼蟲GSTs活性在被蒲螨寄生后的前60 h處于被誘導(dǎo)狀態(tài),72 h后處于被抑制狀態(tài);幼蟲GSTs活性在被菌和螨聯(lián)合處理后12 h達(dá)到峰值,是對(duì)照組的1.2倍,之后逐漸下降,前48 h,聯(lián)合處理組高于對(duì)照組,幼蟲GSTs活性處于被誘導(dǎo)狀態(tài),處理60 h后,聯(lián)合處理組低于對(duì)照組,幼蟲GSTs活性處于被抑制狀態(tài),幼蟲在被菌和螨聯(lián)合處理后,除48、72 h外,其他取樣時(shí)間,GSTs活性均低于另外2個(gè)處理組,與另外2個(gè)處理組相比呈現(xiàn)進(jìn)一步下降趨勢(shì)。

中華甲蟲蒲螨和球孢白僵菌單獨(dú)或聯(lián)合使用對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲乙酰膽堿酯酶(AChE)活性的影響見(jiàn)表7。由表可知,幼蟲AChE活性在被菌侵染后36 h到達(dá)峰值,達(dá)到對(duì)照組的6.8倍,顯著高于對(duì)照組(P<0.05),球孢白僵菌處理組幼蟲AChE活性在所有取樣時(shí)間均高于對(duì)照組,說(shuō)明單獨(dú)使用球孢白僵菌侵染對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲AChE活性具有誘導(dǎo)作用;幼蟲AChE活性在被蒲螨寄生后12 h達(dá)到峰值,達(dá)到對(duì)照組的1.8倍,顯著高于對(duì)照組(P<0.05),處于被誘導(dǎo)狀態(tài),被螨寄生后72 h時(shí),幼蟲AChE活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05),處于被抑制狀態(tài);幼蟲AChE活性在被菌和螨聯(lián)合處理后12 h時(shí)到達(dá)峰值,達(dá)到對(duì)照組的1.3倍,處于被誘導(dǎo)狀態(tài),48 h后,幼蟲AChE活性低于對(duì)照組,處于被抑制狀態(tài),與另外2個(gè)處理組相比,AChE活性呈現(xiàn)進(jìn)一步下降趨勢(shì)。

表6 亞致死濃度(數(shù)量)球孢白僵菌和中華甲蟲蒲螨處理冷杉梢斑螟幼蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)的活性

表7 亞致死濃度(數(shù)量)球孢白僵菌和中華甲蟲蒲螨處理冷杉梢斑螟幼蟲乙酰膽堿酯酶(AChE)活性

中華甲蟲蒲螨和球孢白僵菌單獨(dú)或聯(lián)合使用對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲多酚氧化酶(PPO)活性的影響見(jiàn)表8。由表可知,幼蟲PPO活性在被球孢白僵菌侵染12 h時(shí)低于對(duì)照組,處于未被激活狀態(tài),24 h時(shí)開始被激活,48 h時(shí)到達(dá)峰值,此時(shí)菌處理組PPO活性是對(duì)照組的2.4倍,顯著高于對(duì)照組(P<0.05),幼蟲PPO活性在被菌侵染24 h后處于被誘導(dǎo)狀態(tài);幼蟲PPO活性在被中華甲蟲蒲螨寄生后逐漸升高,48 h時(shí)到達(dá)峰值,達(dá)到對(duì)照組的1.5倍,顯著高于對(duì)照組(P<0.05),PPO活性在被蒲螨寄生后的前60 h均高于對(duì)照組,處于被誘導(dǎo)狀態(tài),72 h后低于對(duì)照組,處于被抑制狀態(tài);幼蟲PPO活性在被菌和螨聯(lián)合處理后,僅24、48 h時(shí)高于對(duì)照組,其余時(shí)間均低于對(duì)照組,72 h時(shí)活性最低,顯著低于對(duì)照組(P<0.05),證明此時(shí)抑制作用最明顯。被菌和螨聯(lián)合處理后,幼蟲PPO活性與其他2個(gè)處理組相比呈現(xiàn)提前下降趨勢(shì),證明菌和螨聯(lián)合使用對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲PPO活性抑制更強(qiáng)。

表8 亞致死濃度(數(shù)量)球孢白僵菌和中華甲蟲蒲螨處理冷杉梢斑螟幼蟲多酚氧化酶(PPO)活性

中華甲蟲蒲螨和球孢白僵菌單獨(dú)或聯(lián)合使用對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響見(jiàn)表9。由表可知,幼蟲SOD活性在被菌侵染36 h時(shí)到達(dá)峰值,是對(duì)照組的2.0倍,顯著高于對(duì)照組(P<0.05),幼蟲SOD活性12～72 h均處于被誘導(dǎo)狀態(tài);幼蟲SOD活性在被蒲螨寄生前24 h低于對(duì)照組,從36 h開始被激活,36～72 h時(shí)蒲螨處理組SOD活性高于對(duì)照組,處于被誘導(dǎo)狀態(tài),幼蟲SOD活性在被蒲螨寄生后36 h達(dá)到峰值,是對(duì)照組的1.5倍,顯著高于對(duì)照組(P<0.05);在被菌和螨聯(lián)合處理后,幼蟲SOD活性始終低于對(duì)照組,證明菌和螨聯(lián)合使用對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲SOD活性具有明顯抑制作用。

中華甲蟲蒲螨和球孢白僵菌單獨(dú)或聯(lián)合使用對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的影響見(jiàn)表10。由表可知,幼蟲CAT活性在被菌侵染12 h時(shí)低于對(duì)照組,處于未被激活狀態(tài),在24 h開始被激活,36 h時(shí)到達(dá)峰值,達(dá)到對(duì)照組的1.9倍,顯著高于對(duì)照組(P<0.05),幼蟲CAT活性從24～72 h均高于對(duì)照組,處于被誘導(dǎo)狀態(tài);幼蟲CAT活性在被蒲螨寄生前48 h高于對(duì)照組,處于被誘導(dǎo)階段,36 h到達(dá)峰值,是對(duì)照組的2.1倍,顯著高于對(duì)照組(P<0.05);幼蟲CAT活性在被菌和螨聯(lián)合處理后12 h到達(dá)峰值,是對(duì)照組的2.2倍,顯著高于對(duì)照組(P<0.05),呈明顯被誘導(dǎo)狀態(tài),72 h時(shí)低于對(duì)照組,處于被抑制狀態(tài)。幼蟲CAT活性與其他2個(gè)處理組相比呈現(xiàn)提前下降趨勢(shì)。

表9 亞致死濃度(數(shù)量)球孢白僵菌和中華甲蟲蒲螨處理冷杉梢斑螟幼蟲超氧化物歧化酶(SOD)活性

表10 亞致死濃度(量)球孢白僵菌和中華甲蟲蒲螨處理冷杉梢斑螟幼蟲過(guò)氧化氫酶(CAT)活性

3 結(jié)論與討論

隨著冷杉梢斑螟危害的加重,生物防治方法將會(huì)作為一種可靠且能與其他方法兼容的措施,在綜合害蟲防治中具有重要地位[11]。球孢白僵菌作為一種非常重要的昆蟲病原真菌,對(duì)梢斑螟具有較高的毒力和防治潛力[18]。本研究從2株球孢白僵菌中篩選發(fā)現(xiàn),CFCC81428菌株在孢子濃度為108孢子/mL時(shí),侵染冷杉梢斑螟幼蟲10 d時(shí)累計(jì)校正死亡率為77.30%、半數(shù)致死濃度為7.24×105孢子/mL,表明CFCC81428菌株毒性更強(qiáng),故選取此菌株做后續(xù)試驗(yàn)。

中華甲蟲蒲螨作為我國(guó)本土的一種寄生性害蟲天敵,對(duì)鱗翅目昆蟲表現(xiàn)出了較高的殺蟲效果[19],將其與球孢白僵菌聯(lián)合起來(lái)應(yīng)用,可提升防治梢斑螟的效果,同時(shí)盡可能降低病原菌和天敵的用量,為本文擬探索的重點(diǎn)內(nèi)容。本研究發(fā)現(xiàn),中華甲蟲蒲螨和球孢白僵菌聯(lián)合處理組對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲的累計(jì)校正死亡率高于中華甲蟲蒲螨處理組;聯(lián)合處理組對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲的僵蟲率也高于球孢白僵菌處理組。這是由于中華甲蟲蒲螨寄生幼蟲時(shí),使幼蟲體表產(chǎn)生了傷口,使球孢白僵菌更易侵染,導(dǎo)致其僵蟲率更高。在實(shí)驗(yàn)室條件下,中華甲蟲蒲螨的寄生,對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲的致死率可以達(dá)到100%。但這只是在實(shí)驗(yàn)室封閉條件下實(shí)現(xiàn)的,由于天氣、溫度等因素影響,在野外要達(dá)到室內(nèi)條件下的殺蟲效果,對(duì)其釋放技術(shù)還有待進(jìn)一步探索。

在昆蟲體內(nèi),AChE和GSTs是2種重要的解毒酶,能夠分解植物次生代謝物、真菌、細(xì)菌等產(chǎn)生的外源毒素[20],維持昆蟲正常生理生化活動(dòng),提高昆蟲的抗逆能力,在細(xì)胞的許多重要代謝過(guò)程中起著重要作用[21-24]。本研究發(fā)現(xiàn),冷杉梢斑螟幼蟲AChE和GSTs活性在被亞致死濃度下的球孢白僵菌侵染后36 h時(shí)到達(dá)峰值,其余各取樣時(shí)間也均高于對(duì)照組,表現(xiàn)為被誘導(dǎo)狀態(tài)。幼蟲AChE和GSTs活性在被亞致死量下的中華甲蟲蒲螨寄生后12 h到達(dá)峰值,然后逐漸下降,到72 h時(shí)低于對(duì)照組,處于被抑制狀態(tài)。這是因?yàn)橹腥A甲蟲蒲螨產(chǎn)生毒素,導(dǎo)致冷杉梢斑螟幼蟲難以維持正常的生理生化活動(dòng),生命力下降,從而解毒酶活性受到抑制。球孢白僵菌和中華甲蟲蒲螨聯(lián)合使用時(shí),幼蟲解毒酶活性與其他2個(gè)處理組相比呈現(xiàn)進(jìn)一步下降趨勢(shì),這是由于中華甲蟲蒲螨和球孢白僵菌的聯(lián)合處理,產(chǎn)生了更多的毒素,幼蟲酶活性受到抑制,從而導(dǎo)致幼蟲解毒酶活性與其他2個(gè)處理組相比呈現(xiàn)進(jìn)一步下降趨勢(shì)。

當(dāng)昆蟲受到外源逆境脅迫時(shí),PPO、SOD、CAT這3種保護(hù)酶能迅速做出應(yīng)激反應(yīng),從而維持正常的生理生化活動(dòng)[25-27]。保護(hù)酶可以維持一定的自由基水平,從而防止自由基對(duì)生物體的危害,一旦保護(hù)酶系遭到破壞,導(dǎo)致生物機(jī)體內(nèi)氧自由基濃度過(guò)高,將破壞生物功能分子,使細(xì)胞功能受到威脅[28]。本研究發(fā)現(xiàn),冷杉梢斑螟幼蟲PPO、SOD、CAT這3種保護(hù)酶中,SOD和CAT活性在被球孢白僵菌侵染后36 h到達(dá)峰值,PPO活性在被侵染后48 h到達(dá)峰值,在被處理后的12 h,PPO和CAT活性略低于對(duì)照組,這是由于球孢白僵菌尚未侵染到冷杉梢斑螟幼蟲體內(nèi),其活性還未被激活。其他各取樣時(shí)間點(diǎn),幼蟲保護(hù)酶活性均高于對(duì)照組,表現(xiàn)出明顯的被誘導(dǎo)狀態(tài)。單獨(dú)使用中華甲蟲蒲螨處理后,幼蟲的3種保護(hù)酶活性均呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢(shì),這是由于中華甲蟲蒲螨寄生幼蟲后,產(chǎn)生的毒素導(dǎo)致其保護(hù)酶活性增加,但隨著寄生時(shí)間的延長(zhǎng),幼蟲生理功能受到破壞,保護(hù)酶活性也逐漸降低。幼蟲SOD和PPO活性,被球孢白僵菌和中華甲蟲蒲螨聯(lián)合處理后,與其他2個(gè)處理組相比呈現(xiàn)提前下降趨勢(shì),這是由于中華甲蟲蒲螨的寄生,導(dǎo)致冷杉梢斑螟幼蟲體表產(chǎn)生傷口,加速了球孢白僵菌的侵染,導(dǎo)致幼蟲SOD和PPO活性與另外2個(gè)處理組相比呈現(xiàn)提前下降趨勢(shì)。

根據(jù)對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲的毒力測(cè)定,試驗(yàn)篩選出了對(duì)冷杉梢斑螟幼蟲高效的球孢白僵菌菌株,通過(guò)對(duì)球孢白僵菌和中華甲蟲蒲螨的聯(lián)合試驗(yàn),證明了兩者聯(lián)合使用的增效作用。根據(jù)幼蟲解毒酶和保護(hù)酶活性的變化發(fā)現(xiàn),病原菌開始侵染或天敵開始寄生時(shí),幼蟲為了維持其正常的生理活動(dòng),抵御外源毒素影響,從而使其解毒酶和保護(hù)酶活性升高,但隨著侵染(或寄生)時(shí)間的延長(zhǎng),幼蟲防衛(wèi)能力逐漸瓦解,表現(xiàn)為解毒酶和保護(hù)酶活性下降,隨著毒素的積累,細(xì)胞受到破壞,幼蟲將無(wú)法正?；顒?dòng)最終導(dǎo)致死亡。