環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥DNA提取方法的比較與優(yōu)化

曲衍洪，田 琳，李玉梅，李 強(qiáng)，方嘉碧，宋冬雪，王佳佳，郝大可，陳中合

（1.濟(jì)南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山東濟(jì)南 250022；2.中海瀝青股份有限公司，山東 濱州 256601；3.濟(jì)南大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250022）

環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥DNA提取方法的比較與優(yōu)化

曲衍洪1，田 琳2，李玉梅3，李 強(qiáng)3，方嘉碧3，宋冬雪3，王佳佳1，郝大可3，陳中合1

（1.濟(jì)南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山東濟(jì)南 250022；2.中海瀝青股份有限公司，山東 濱州 256601；3.濟(jì)南大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250022）

探索適宜的環(huán)氧丙烷廢水中活性污泥微生物總DNA提取的方法并進(jìn)行優(yōu)化。采用11種方法提取環(huán)氧丙烷廢水中活性污泥微生物總DNA，即NaCl溶液-提取緩沖液-溶菌酶-十二烷基磺酸鈉（SDS）法、蛋白酶K-SDS法、SDS-反復(fù)凍融法、Tris-EDTA-NaCl-聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（TENP）法和反復(fù)凍融-SDS-蛋白酶K法等。通過對(duì)這11種方法進(jìn)行比較，以確定最佳試驗(yàn)方案并結(jié)合單因素法對(duì)最佳方案進(jìn)行優(yōu)化。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：NaCl溶液-提取緩沖液-溶菌酶-SDS法提取DNA亮度高，有大片斷DNA的存在且拖帶較少，條帶集中；酶法所提取的DNA效果僅次于提取緩沖液-溶菌酶-SDS法，其他方案沒有提取出DNA。單因子試驗(yàn)結(jié)果表明：10 mg/mL溶菌酶，100 g/LSDS，反應(yīng)時(shí)間為30 min，反應(yīng)溫度為45℃時(shí)效果最佳。NaCl溶液-提取緩沖液-溶菌酶-SDS提取法為環(huán)氧丙烷廢水中微生物群落在分子水平上的研究提供了一種簡便、可靠的DNA提取方法。

活性污泥；環(huán)氧丙烷；DNA提取；廢水

活性污泥是由以好氧性細(xì)菌為主體的微生物和水中的懸浮物質(zhì)、膠體物質(zhì)混雜在一起形成的肉眼可見的絮狀顆粒，它是廢水生物處理過程的主體［1］。隨著每年環(huán)氧丙烷工業(yè)用量不斷地增加，環(huán)氧丙烷皂化廢水的有效治理成為國內(nèi)外研究的重點(diǎn)。該廢水具有高溫（經(jīng)閃蒸和換熱后達(dá)60～80℃）、高 pH（10～12）、高鹽（CaCl2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%～4%）、高固體懸浮物（懸浮物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%～0.5%）的特點(diǎn)，化學(xué)需氧量（COD）在1 000～2 000 mg/L，盡管環(huán)氧丙烷皂化廢水處理的工程技術(shù)和工藝已較好地發(fā)展起來，但對(duì)其微生物種群多樣性及其功能相關(guān)性的認(rèn)識(shí)目前依然有限，這在很大程度上制約了廢水處理系統(tǒng)效能的提高［2］。環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥處理污水的能力取決于生物活性的高低，而微生物菌群的結(jié)構(gòu)和功能直接影響著生物活性。因此，為了得到更好的處理效果，應(yīng)該更多地了解環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥中生物的多樣性，以便更加有效地利用微生物群落的特性。

目前，關(guān)于活性污泥中微生物總DNA的提取方法已有相關(guān)研究報(bào)道［3-6］，而尚未有關(guān)于環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥中微生物DNA提取方法的相關(guān)報(bào)道。為此，筆者在綜合比較幾種污泥總DNA提取方法的基礎(chǔ)上，建立并優(yōu)化一種快速、高效的環(huán)氧丙烷皂化廢水中活性污泥基因組DNA的提取方法，以期為今后環(huán)氧丙烷皂化廢水中活性污泥的宏基因組研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 污泥樣品

活性污泥來自山東濱化集團(tuán)石化車間；環(huán)氧丙烷廢水排放于PO工序。

1.1.2 試劑

DNA提取液：100 mmol/L Tris，100 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA），100 mmol/L Na3PO4，1.5 mol/L NaCl，1%十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）；pH 8。

提取緩沖液：100 mmol/L Tris，100 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），200 mmol/L NaCl，1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP-K30），2%CTAB；pH 8。

TENP緩沖液：50 mmol/L Tris，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，0.01 g/mL PVP-K30；pH 10。

磷酸緩沖液（PBS）：137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO；pH 7.4。

TE緩沖液：10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA；pH 8。

Tris（優(yōu)級(jí)純），濟(jì)南朋遠(yuǎn)生物科技有限公司；PVP-K30（醫(yī)藥級(jí)），F(xiàn)luka生化試劑公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）、CTAB（超純），博美生物科技責(zé)任公司；NaCl、EDTA（分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 方法比較

在1.5mL EP管里加濕質(zhì)量為0.5 g的活性污泥，10 000 r/min離心1 min后，取沉淀。每種方法做2個(gè)平行樣。

SDS法：加300 μL DNA提取液，混勻，37℃、30 min；加30 μL 200 g/L SDS溶液，渦旋至混勻，65℃水浴2 h，15～20 min間隔輕搖；6 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至新EP管；沉淀中加90 μL DNA提取液，10 μL 200 g/L SDS溶液，渦旋；65℃水浴10 min，6 000 r/min離心10 min，混合2次所得上清液進(jìn)行純化、沉淀DNA［7］。

Tris-EDTA-NaCl-PVP（TENP）法：加400 μL TENP緩沖液，加玻璃珠混勻，4 000 r/min離心20 min，棄上清，重復(fù)1次；加400 μL PBS溶液，混勻，4 000 r/min離心20 min，棄上清；沉淀懸浮于500 μL無菌水中，-20℃、1 h，沸水10 min，-20℃10 min，沸水10 min反復(fù)凍融；4 000 r/min離心20 min，棄上清；加1 mL提取緩沖液，渦旋5 min；4 000 r/min離心20 min，取上清液進(jìn)行純化、沉淀DNA［8］。

NaCl溶液-提取緩沖液-溶菌酶-SDS法：加入0.9%的NaCl溶液5 mL洗滌1 min，10 000 g離心1 min，加600 μL提取緩沖液，20 μL溶菌酶溶液，渦旋至混勻；37℃水浴30 min，加200 μL 100 g/L SDS溶液，渦旋；10 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行沉淀、純化DNA［9］。

蛋白酶K-SDS法：加300 μL提取緩沖液，20 μL蛋白酶 K溶液，渦旋振蕩混勻；37℃水浴30 min，加80 μL 100 g/L SDS溶液，65℃水浴1 h；12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行純化、沉淀DNA［9］。

酶法：加300 μL提取緩沖液，20 μL溶菌酶溶液，渦旋振蕩混勻；37℃水浴30 min，加80 μL 100 g/L SDS溶液，65℃水浴1 h；12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行純化、沉淀DNA［9］。

提取緩沖液-SDS法：加400 μL提取緩沖液，渦旋至混勻；加入200 μL 20 g/L SDS溶液，上下顛倒混勻；加入750 mg細(xì)玻璃珠，渦旋振蕩；10 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行純化、沉淀DNA［10］。

TENP-凍融-溶菌酶法：加700 μL TENP緩沖液，-20℃15 min、65℃ 3 min，反復(fù)凍融 3次；10 000 r/min離心10 min，取上清液①4℃保存；將沉淀懸浮于1 mL溶菌酶溶液，37℃水浴2 h；加700 μL 100 g/L SDS溶液，反復(fù)顛倒1 min至混勻；10 000 r/min離心10 min，取上清液②；混合上清液①②，進(jìn)行純化、沉淀DNA［10］。

提取緩沖液-凍融-溶菌酶法：加500 μL提取緩沖液，750 mg玻璃珠，渦旋；10 000 r/min離心5 min，棄上清；加300 μL TENP溶液；-20℃、15 min、50℃、2 min，反復(fù)凍融3次；10 000 r/min離心5 min，保留沉淀，上清液①4℃保存；向沉淀加400 μL溶菌酶溶液，渦旋，37℃水浴30 min；加150 μL 100 g/L SDS溶液，渦旋；10 000 r/min離心10 min，取上清液②；混合上清液①②，進(jìn)行純化、沉淀DNA［10-11］。

溶菌酶-蛋白酶K-SDS法：加700 μL TE緩沖液，懸浮，加300 μL溶菌酶溶液（50 g/L）；37℃水浴，1 h；4 μL蛋白酶K溶液（20 g/L），60 μL 100 g/L SDS溶液，55℃水浴30 min；13 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行純化、沉淀DNA［12］。

TE-超聲波法：加1 mL TE緩沖液，混勻靜置1 min；超聲波功率50 Hz，時(shí)間27 s，間隔5 s，重復(fù)5次，冰浴進(jìn)行裂解；12 000 r/min離心3 min，取上清液進(jìn)行純化、沉淀DNA［13］。

提取緩沖液-超聲波法：加600 μL提取緩沖液，封口膜密封，渦旋 5 min；100%功率，超聲處理10 min；12 000 r/min離心3 min取上清液進(jìn)行純化、沉淀DNA［14］。

加與上清液等體積Tris-飽和酚，抽提2次；加酚-氯仿-異戊醇（體積比25∶24∶1）溶液抽提1次；加氯仿-異戊醇（體積比24∶1）溶液抽提1次；加1/10體積乙酸鈉溶液，2倍體積無水乙醇，冰浴沉淀DNA；10 000 r/min離心10 min；500 μL 70%乙醇洗滌沉淀2次；無水乙醇洗滌沉淀1次；室溫干燥后溶于50～100 μL TE緩沖液，加3 μL RNase A溶液，于-20℃下保存所得樣品。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

優(yōu)化方法：經(jīng)過以上方法比對(duì)所得效果較好的細(xì)胞裂解方法是溶菌酶-蛋白酶K-SDS法，比較電泳結(jié)果見圖1。其中，影響其裂解效果的因素有溶菌酶溶液濃度、SDS溶液濃度、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度，以此可進(jìn)行單因素設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，并通過紫外分光光度法測定DNA樣品的含量。在進(jìn)行某個(gè)單因素設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，其余因素均按照原實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行。

圖1 11種方法獲得環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥基因組DNA凝膠電泳分析Fig.1 Gel electrophoresis of genomic DNA of active sludge obtained by 11 extracting methods in epoxypropane saponification wastewater

2 結(jié)果與討論

2.1 11種方法提取DNA結(jié)果

11種方法所得的DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。由圖1可知：NaCl溶液-提取緩沖液-溶菌酶-SDS法、酶法、提取緩沖液-SDS法能夠提取出基因組DNA，而僅有提取緩沖液-溶菌酶-SDS法、酶法電泳結(jié)果較為理想，出現(xiàn)宏基因組的亮帶，其余方法沒有提取出DNA或者提取的量過低以至于無法出現(xiàn)亮帶。其中提取緩沖液-溶菌酶-SDS法獲得的基因組DNA的電泳條帶亮且彌散程度低，說明提取的效果較好；而酶法雖然也得到基因組DNA，但是電泳存在明顯的彌散現(xiàn)象。于是選取提取緩沖液-溶菌酶-SDS法作為進(jìn)一步優(yōu)化的對(duì)象。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

針對(duì)溶菌酶溶液質(zhì)量濃度、SDS溶液質(zhì)量濃度、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)影響因素4個(gè)水平。紫外分光光度法測DNA樣品在260 nm波長處的吸光度，以蒸餾水作為參考物［15］。由表1可知：當(dāng)溶菌酶10 mg/mL、SDS 100 g/L、溶菌酶作用時(shí)間30 min和反應(yīng)溫度45℃時(shí)，提取出的總DNA的量最多。

表1 不同影響因素設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Design and results of different effect factors

2.3 最佳提取條件下提取總DNA

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果得出：溶菌酶質(zhì)量濃度為10 mg/mL、SDS 100 g/L、溶菌酶作用時(shí)間為30 min、反應(yīng)溫度為45℃是提取環(huán)氧丙烷皂化廢水中活性污泥微生物總DNA的最佳條件，在此條件下提取獲得基因組 DNA，其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖 2所示。

圖2 最佳條件下提取的基因組DNA凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of genomic DNA extracted by optimal condition

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為提取環(huán)氧丙烷皂化廢水的活性污泥總DNA提供了可靠的方案，為今后環(huán)氧丙烷皂化廢水中活性污泥的宏基因組研究奠定基礎(chǔ)［16］。

3 結(jié)論

從環(huán)氧丙烷皂化廢水的活性污泥中提取DNA的各種方法的差別在于細(xì)胞破壁的方式不同。通過對(duì)11種不同細(xì)胞破壁方法的比較，獲得了提取環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥總DNA的最佳方案，即NaCl溶液-提取緩沖液-溶菌酶-SDS法。單因子試驗(yàn)結(jié)果表明：溶菌酶10 mg/mL、SDS 100 g/L，反應(yīng)時(shí)間30 min、反應(yīng)溫度45℃，提取的環(huán)氧丙烷皂化廢水的活性污泥細(xì)菌DNA的量最多，電泳圖顯示有大片DNA片段存在且拖帶較少。

［1］Xing D E，Godfrey M H.Nuclear DNA analysis in genetic studies of populations：practice，problems and prospects［J］.Mol Ecol，2003，12（3）：563-584.

［2］伍陽，謝晴，龍用波.從活性污泥中提取微生物總DNA的方法比較［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（3）：4452-4454.

［3］趙勇，周志華，李武，等.土壤微生物分子生態(tài)學(xué)研究中總DNA的提取［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2005，24（5）：854-860.

［4］陳敏.土壤樣品中DNA提取方法的比較［J］.微生物學(xué)雜志，2005，25（3）：101-104.

［5］曹治明，鄭維，權(quán)春善.土壤DNA提取方法的研究［J］.大連民族學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，7（3）：94.

［6］宋培勇.從土壤中提取DNA方法比較［J］.微生物學(xué)雜志，2006，26（1）：109-112.

［7］李鵬，畢學(xué)軍，汝少國.DNA提取方法對(duì)活性污泥微生物多樣性PCR-DGGE檢測的影響［J］.安全與環(huán)境學(xué)報(bào)，2007，7（2）：53-57.

［8］沈國，李茵.廢水處理系統(tǒng)中活性污泥總DNA的提取［J］.環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2010，4（6）：1336-1340.

［9］蘇俊峰，馬放，侯寧，等.活性污泥總DNA不同提取方法的比較［J］.生態(tài)環(huán)境，2007，16（1）：47-49.

［10］丁嫚，李璐，鄒莉，等.活性污泥總DNA提取方法的比較［J］.環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2009，3（9）：1697-1702.

［11］熊開容，張智明，張敏，等.活性污泥總DNA提取方法的研究［J］.生物技術(shù)，2005，15（4）：43-44.

［12］鄭雪松，李道棠，楊虹，等.不同破壁方法對(duì)活性污泥總DNA提取效果的影響［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，38（5）：815-818.

［13］萬晶晶，張汝嘉，邢德峰，等.超聲波破碎法提取活性污泥DNA及其DGGE分析［J］.哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，40（4）：559-562.

［14］廖永紅，周曉宏，汪蘋，等.脫氮活性污泥總DNA提取研究［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2007，30（12）：75-81.

［15］Guo F，Zhang T.Biases during DNA extraction of activated sludge samples revealed by high throughput sequencing［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2013，97（10）：4607-4616.

［16］李強(qiáng)，李玉梅，曲衍洪，等.一種環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA的提取方法：中國，201410067311.X［P］.2014-05-14.

（責(zé)任編輯 荀志金）

Comparison and optimization of DNA extraction methods from activated sludge in wastewater of epoxy propane saponification

QU Yanhong1，TIAN Lin2，LI Yumei3，LI Qiang3，F(xiàn)ANG Jiabi3，SONG Dongxue3，WANG Jiajia1，HAO Dake3，CHEN Zhonghe1
（1.School of Chemistry and Chemical Engineering，University of Jinan，Jinan 250022，China；2.China Offshore Bitumen Co.Ltd.，Binzhou 256601，China；3.School of Biological Science and Technology，University of Jinan，Jinan 250022，China）

The optimal extracting method for genomic DNA from the epoxypropane wastewater sample was investigated in this paper.Eleven methods were used to extract total DNA of the activated sludge samples，and they were sodium chloride solution-extraction buffer-lysozyme-sodium dodecyl sulfate（SDS），proteinase K-SDS method，SDS-repeated freezing and thawing method，Tris-EDTA-NaCl-polyvinylpyrrolidone（TENP）method，repeated freezing and thawing-SDS-proteinase K method，etc.According to the result from the analysis and comparison of these methods，the optimal experimental design was obtained，and it was the extraction buffer-lysozyme-SDS method which resulted in high quality genomic DNA.The results of singlefactor experiments indicated that the optimal level for each factor was 10 mg/mL of lysozyme，100 g/L SDS，the reaction time for 30 min，the reaction temperature at 45℃.These data suggested sodium chloridesolution-extraction buffer-lysozyme-SDS method was a simple and reliable DNA extraction method for the microbial communities in epoxypropane wastewater at the molecular level.

activated sludge；epoxy propane；extraction；wastewater

X703.1；Q93-33

A

1672-3678（2015）01-0042-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.01.008

2014-05-17

國家自然科學(xué)基金（31100088）；山東省科技發(fā)展計(jì)劃（2013GSF12006）

曲衍洪（1988—），女，山東威海人，碩士研究生，研究方向：資源與環(huán)境微生物；李 強(qiáng)（聯(lián)系人），副教授，E-mail：lq_ujn@126.com